一种外周血γδT细胞的诱导扩增培养方法与流程

本发明属于免疫学与表观遗传学研究领域，涉及应用细胞因子白介素-2联合帕米磷酸二钠药物协同诱导γδT细胞生成扩增的培养方法。

背景技术：

淋巴细胞是具有特异性免疫识别功能的细胞系，人和哺乳类动物的淋巴细胞系是由形态相似、功能各异的不均一细胞群所组成。按其个体发生、表面分子和功能的不同，可将淋巴细胞系分为T细胞和B细胞二个亚群，它们都起源于造血干细胞。其中的T细胞是由一群功能不同的异质性淋巴细胞组成，由于它在胸腺内分化成熟故称为T细胞。成熟T细胞由胸腺迁出随血循环到周围淋巴器官，在各自既定的区域定居、繁殖，受抗原激活即分化增殖，产生效应细胞，行使其免疫功能。T淋巴细胞激活后，分化增殖形成多种具有特殊性的效应T淋巴细胞株。不同功能成熟的T细胞可借其细胞膜表面分子不同加以鉴别，TCR(T cell receptor)是T细胞识别蛋白抗原的特异性受体，有两种不同的类型，分别由两条不同的跨膜多肽链组成，即αβTCR和γδTCR。在外周血和淋巴器官中，约有95％成熟T细胞的TCR分子是由α和β二条异二聚体肽链组成的，即αβTCR分子；而剩下的1-5％成熟T细胞的TCR是由γ和δ二条异二聚体肽链组成的，这种T细胞被称为γδT细胞。在Kunzmann等首次发现γδT细胞能够大量扩增前，对γδT细胞的研究一直被人们忽略了，现在越多越多的学者开始致力于γδT细胞的研究。目前，γδT细胞的体外扩增和纯化已经成为一种成熟技术，该类细胞的生物学功能也日渐明确。人们已发现γδT细胞在抗感染和抗肿瘤方面发挥着重要的作用，并且其过继免疫治疗肿瘤在临床上也开始得到了应用，有些患者已经从中得到受益。因此，为了使更多的患者能够接受γδT细胞免疫治疗，如何降低γδT细胞的诱导扩增培养成本、简化其培养步骤和提高其诱导效率成为γδT细胞临床应用的迫切需要解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是降低γδT细胞的培养成本和获得大量的γδT细胞，提供一种γδT细胞的诱导扩增培养方法，涉及提供一种γδT细胞的诱导扩增培养方法，能为γδT细胞在临床肿瘤免疫治疗方面的应用提供基础。

本发明所述的一种γδT细胞的诱导扩增培养方法，包括以下步骤：

A.人单个核细胞的制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备外周血单个核细胞，用PBS缓冲液重悬洗涤细胞两次；

B.红细胞的去除：收集得到的单个核细胞红细胞裂解液重悬，裂解残存的红细胞；

C.γδT细胞的诱导扩增：将步骤B所制备的单个核细胞接种到含有20％胎牛血清的完全RPMI 1640培养液中，接种当日按第1天计算，在第1天加入帕米磷酸二钠，在第3天加入白介素-2和帕米磷酸二钠，接着在第6、9、12、15、18天进行半量换液，每次换液时加入新鲜白介素-2和帕米磷酸二钠；

D.γδT细胞数量含量的检测：以CD3和TCRγδ双阳性细胞作为γδT细胞的表型特征；

E.γδT细胞状态的检测：在第1和18天时用倒置相差显微镜查看细胞生长状态；

F.γδT细胞的富集和获得数量：采用免疫磁珠阳性分选方法无菌分选TCRγδ阳性细胞群，该群细胞内富含γδT细胞，收集所有细胞计数获得γδT细胞的数量；

G.富集后细胞纯度和细胞毒性的检测：富集后细胞用流式细胞术检测其纯度，并检测其对肿瘤细胞的细胞毒性作用。

根据本发明所述的γδT细胞的诱导扩增培养方法的进一步特征，步骤B中，收集得到的单个核细胞用5ml红细胞裂解液重悬，37℃水浴1分钟，完全裂解残存的红细胞。

根据本发明所述的γδT细胞的诱导扩增培养方法的进一步特征，步骤D中，培养至第18天时，γδT细胞在培养细胞中的含量超过80％，诱导扩增速度开始减慢。

根据本发明所述的γδT细胞的诱导扩增培养方法的进一步特征，步骤E中，培养至第18天时，γδT细胞生长状态达到细胞透亮度好、形态不规则和聚集成 团，诱导扩增速度开始减慢。

本发明具有如下特点和优点：

(1)本发明所述的γδT细胞的诱导扩增培养方法是通过应用细胞因子白介素-2和帕米磷酸二钠药物联合诱导γδT细胞的增殖后，检测细胞生长状态、数量含量；采用MACS阳性分选富集后，检测γδT细胞的纯度、获得细胞数量和细胞毒性作用以确保能用于临床治疗。

(2)诱导增殖和富集过程简单易行，周期较短，成本低.

(3)诱导效率高，重复性好。

(4)增殖后细胞活力好，富集后细胞数量和细胞毒性作用均能保证临床免疫治疗肿瘤，能为γδT细胞的临床应用提供基础，具有很好的推广价值。

附图说明

图1是人外周血单个核细胞第1天时细胞生长状态图。

图2是人外周血单个核细胞诱导培养18天后的细胞生长状态图。

图3是诱导培养前人外周血单个核细胞的流式分析图。

图4是诱导培养第18天时培养细胞的流式分析图。

图5是诱导培养的细胞中γδT细胞随时间增加的含量变化图。

图6是白介素-2和帕米磷酸二钠不同组合诱导培养单个核细胞18天时γδT细胞的数量含量。

图7是诱导培养的细胞经TCRγδ+T细胞MACS分选后的流式分析图。

图8是TCRγδ+T细胞MACS阳性分选富集得到的γδT细胞的数量图。

图9是MACS阳性分选富集得到的γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

本文中所用细胞因子白介素-2购自北京双鹭药业有限公司，流式细胞术检测所用的单克隆荧光抗体购自Biolegend公司，帕米磷酸二钠(商品名Pamisol)购自澳大利亚科鼎有限公司，γδT细胞MACS分选试剂盒购自德国美天旎生物技术公司，非放射性细胞毒性检测试剂盒检测γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用，购自美国Promega公司。

本实验重复了6名正常志愿者外周血标本，均取得了类似效果。

实施例1：γδT细胞的诱导扩增

(1)在50ml离心管中加入15ml淋巴细胞分离液；

(2)取肝素抗凝静脉血10ml与等量PBS缓冲液充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面，室温水平离心600g×20分钟；

(3)离心后见管内分为三层，上层为血浆和PBS缓冲液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带；

(4)用移液管插到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一50ml离心管中，然后加入PBS缓冲液到50ml，4℃，300g×5分钟离心，洗涤细胞2次；

(5)末次离心后，弃上清，收集得到的单个核细胞用5ml红细胞裂解液重悬水浴1分钟，裂解残存的红细胞，然后加入HBSS缓冲液到50ml，4℃，300g×5分钟离心；

(6)离心后，弃上清，加入含有20％胎牛血清的完全RPMI 1640培养液，重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁶/ml；

(7)将细胞接种于12孔板，每个病人分别设立3个复孔，每孔2ml，各孔于第1天加入帕米磷酸二钠，其终浓度为6μg/ml，在第3天加入白介素-2和帕米磷酸二钠，其终浓度分别为500U/ml和6μg/ml，接着在第6、9、12、15、18天进行半量换液。每次半量换液时加入新鲜白介素-2和帕米磷酸二钠，每孔去除1ml培养液，再加入新鲜含20％胎牛血清的PRMI 1640完全培养液1ml，白介素-2和帕米磷酸二钠终浓度分别仍是500U/ml和6μg/ml；

(8)接种细胞在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中持续培养18天。

实施例2：流式细胞术检测γδT细胞的数量含量

(1)在倒置相差显微镜下观察细胞形态，结果参见图1，图中可见在第1天时，少许碎片，细胞型态多样，体积较小，体积大的细胞透亮度好，胞内未见颗粒；在培养第18天时，结果参见图2，在细胞生长图可见细胞成团生长，形态不规则，细胞体积比一般淋巴细胞大，透亮度好；

(2)分别收集第1、3、6、9、12、15、18天的细胞，收集的细胞每管10⁶，用3ml含有2％胎牛血清的PBS洗涤二次，每次倾倒前离心300g×5分钟，倾倒后用滤纸吸干管口液体；

(3)用100μl含有2％胎牛血清的PBS重悬细胞，加入抗人TCRγδFITC单克隆抗体和抗人CD3APC单克隆抗体各5μl，充分混匀，4℃避光孵育30分钟；

(4)3ml含有2％胎牛血清的PBS洗涤，4℃，300g×5分钟离心，洗涤后倾倒用滤纸吸干管口液体，加入400μl 2％胎牛血清的PBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测；

(5)流式细胞仪检测：应用FACSDiva软件，每管至少获取10000个细胞，以TCRγδAPC和CD3FITC双阳性作为γδT细胞的表型特征，计算γδT细胞占总细胞的百分含量。检测结果发现白介素-2和帕米磷酸二钠诱导前，单个核细胞中的γδT细胞大约只有3％；随着诱导时间的增加,从第6天开始单个核细胞中的γδT细胞含量开始增加，到第18天时γδT细胞含量大约为82％。结果参见图3、图4、图5，图3是诱导培养前人外周血单个核细胞的流式分析图，图4是诱导扩增培养第18天时细胞的流式分析图，图5是诱导培养的细胞中γδT细胞随时间增加的含量变化图。上述结果表明加入白介素-2和帕米磷酸二钠能有效诱导γδT细胞的生成和增殖。图3、4中FITC-A指anti-CD3FITC，APC-A指anti-TCR APC；图中方框中细胞群表示γδT细胞，百分比表明其在所有培养细胞中的含量。图5则是根据流式检测结果用柱形图的方式表达γδT细胞在总细胞中随时间增加的含量变化。

实施例3：白介素-2和帕米磷酸二钠诱导扩增γδT细胞的最优组合

(1)从人外周血中收集单个核细胞，加入含有20％胎牛血清的完全RPMI1640培养液，重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁶/ml，单个核细胞分离方法同实施例1；

(2)将单个核细胞接种于24孔板，每孔1ml，根据白介素-2加入时间和帕米磷酸二钠的终浓度设计不同组合，共15组，每组分别设立3个复孔，共45孔，白介素-2加入时间和帕米磷酸二钠的终浓度如表1所示。培养基中白介素-2(IL-2)为500U/ml，帕米磷酸二钠(PAM)储存浓度为1000μg/ml，所有组第1天就加入帕米磷酸二钠。

表1(单位：μl)

(3)接种细胞在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中持续培养18天。

(4)第18天时分别收集每孔的细胞并计数，获得每种组合的培养细胞总数，然后每管10⁶细胞，用流式细胞术检测不同组合诱导培养后γδT细胞的数量含量，流式细胞术检测方法同实施例2。图3表明在诱导培养前，约有3.2％的单个核细胞是γδT细胞，经过白介素-2和帕米磷酸二钠的不同组合联合培养18天后各组γδT细胞的数量含量也不相同。结果参见图6，图6是白介素-2和帕米磷酸二钠的不同组合诱导培养单个核细胞18天时γδT细胞的数量含量。在第1天就加入白介素-2和5种不同浓度的帕米磷酸二钠都不能有效地提高γδT细胞的数量含量；在第3天就加入白介素-2和6μg/ml、9μg/ml、12μg/ml这3种浓度的帕米磷酸二钠都能将γδT细胞的数量含量提高到80％以上。表2是细胞培养18天后，可获得γδT细胞的数量：γδT细胞数量＝培养细胞总数×γδT细胞的数量含量。表2结果表明接种3×10⁶个单个核细胞后，用不同组合的白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养18天最多可得3.062×10⁶个γδT细胞。根据获得γδT细胞的数量和其在培养细胞的含量，还有IL-2和帕米磷酸二钠使用的效价比来计算，可以得出白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养γδT细胞的最优组合是第3天加入白介素-2和帕米磷酸二钠的终浓度为6μg/ml。

表2(γδT细胞数量＝培养细胞总数×γδT细胞含量)

实施例4：免疫磁珠细胞分选技术富集γδT细胞及γδT细胞的获得数量

(1)MACS缓冲液，由pH 7.2PBS、0.5％牛白蛋白和3M乙二胺四乙酸(EDTA)组成，以下简称缓冲液；在第18天，收集培养的细胞并计数；

(2)4℃，300×g离心10分钟，去除上清；

(3)以80μl缓冲液/10⁷重悬细胞；

(4)以20μl/10⁷加入抗TCRγδ半抗原抗体；

(5)混匀后4℃孵育15分钟；

(6)以1ml/10⁷细胞加入缓冲液，4℃，300×g离心10分钟，弃上清；

(7)再以80μl缓冲液/10⁷重悬细胞，和以20μl/10⁷加入半抗原微珠；

(8)混匀后4℃避光孵育15分钟；

(9)以1ml/10⁷细胞加入缓冲液，300×g离心10分钟，弃上清；

(10)在500μl缓冲液中重悬细胞；

(11)将LS柱放在相应MACS分选器中，用2ml缓冲液润洗分选柱；

(12)将细胞悬液加入分选柱中；

(13)让细胞流出，用3×2ml缓冲液冲洗分选柱，每次等到前一次分选柱中液体流空时加入新的液体；

(14)将分选柱从分选器中移出，放在15ml无菌离心管上；

(15)在分选柱上加入5ml缓冲液，用分选柱配备的活塞快速将磁性标记细胞推下来，推下来的细胞为富集后的细胞；

(16)留取富集后10⁶细胞，用流式细胞术检测富集后γδT细胞的纯度，流式细胞术检测方法同实施例2，图7是诱导培养的细胞经TCRγδ+T细胞MACS分选后的流式分析图。检测结果发现γδT细胞的纯度大于95％，这表明MACS微磁珠分选可以得到高纯度的γδT细胞；

(17)收集所有富集后的细胞并计数，计算γδT细胞的扩增数量。结果参见图8,图8是TCRγδ+MACS阳性分选富集得到的γδT细胞数量图。单个核细胞中的约有0.34×10⁶γδT细胞，经过白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养18天后可获得约30×10⁶γδT细胞，细胞被扩增近100倍数。第1天时的γδT细胞 数量根据以下公式计算：γδT细胞数量＝CD3和TCRγδ双阳性细胞百分比含量×准备培养的细胞总数。结果表明白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养单个核细胞可以在较短时间内获得大量γδT细胞。

实施例5：富集后γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用的检测

(1)此试验中的效应细胞为富集后γδT细胞。试验中的靶细胞为NSCLC细胞、EBV-LCL细胞和正常B细胞。前两者都是肿瘤细胞系，正常B细胞在此实验中为空白对照；

(2)γδT细胞介导的细胞毒性作用检测，检测板的设置如下，每组设置3个复孔：

A.效应细胞自发LDH释放：把要用于实验孔的每一浓度的效应细胞按3个复孔加到含有培养基的孔中以获得效应细胞自发释放值。终体积必须与实验孔相同(用不含细胞的培养基来补足体积)；

B.实验孔：向U-底96孔板的所有实验孔中加入5000个靶细胞。将效应细胞按3个复孔加入孔中，加入不同数量的效应细胞来测试几组效靶细胞比率(1:1,3:1,10:1和30:1)。效靶细胞合在一起的终体积是100μl/孔；

C.靶细胞自发LDH释放：将靶细胞加入到含有培养基的3个复孔中，终体积必须与含有靶细胞和效应细胞的实验孔相等(用培养基调整体积)；

D.靶细胞最大LDH释放：将靶细胞加入到含有培养基的3个复孔中，终体积必须和实验孔相等。每100μl培养基加10μl的裂解液(10X)。在收获上清前，使靶细胞在裂解液(10X)中孵育45分钟；

E.体积校正对照：将10μl裂解液(10X)加入到含有100μl培养基(不含细胞)的3个复孔中。该对照用于校正加入裂解液(10X)引起的体积变化；

F.培养基背景：将100μl培养基加入3个复孔中。该对照用于校正酚红和含有血清的培养基中的LDH活性引起的背景吸光值；

G.1500rpm离心板子4分钟，以确保效应细胞和靶细胞充分接触；

(3)细胞培养与上清的收获：

A.在37℃，5％CO₂的细胞培养箱中孵育细胞毒性检测板6小时。以保证靶细胞和效应细胞有充分的时间接触；

B.在收集上清前45分钟，向靶细胞最大释放孔加入10μl裂解液(10X) /100μl靶细胞；

C.注意：如果靶细胞未被彻底裂解(通过镜下观察确定)，再加入5μl的裂解液(10X)；

D.孵育45分钟后，1500rpm离心板子4分钟；

E.测量LDH：

i.用排枪从每孔转移50μl上清至一个新的96孔平底酶分析板中；

ii.向含有转移过来的样品上清的96孔酶分析板中每孔均加入50μl配好的底物。避光，室温孵育30分钟；

iii.每孔加入50μl终止液；

iv.用注射器针头戳破大的气泡，加入终止液后1小时内在490或492nm测量吸光值；

(4)实验结果的计算：

A.将所有实验孔、靶细胞自发LDH释放孔和效应细胞自发LDH释放孔的吸光值减去培养基背景吸光值的均值；

B.将靶细胞最大LDH释放对照的吸光值减去体积校正对照吸光值的均值；

C.将步骤A和B中获得的经过校正的值带入下面公式，计算每种效靶比所产生的细胞毒性百分比：

％细胞毒性＝(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)÷(靶细胞最大-靶细胞自发)×100；

(5)根据计算结果，可得出γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。

图8是MACS阳性分选富集得到的γδT细胞对肿瘤细胞的细胞毒性作用。结果见图9，经过白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养18天后纯化得到的γδT细胞可以显著性地杀伤肿瘤细胞，NSCLC细胞和EBV-LCL细胞的死亡率在30:1时达到最大值，分别为60％和44％，但γδT细胞几乎不杀伤正常细胞。这些结果说明白介素-2和帕米磷酸二钠联合培养诱导的γδT细胞能特异性的杀伤肿瘤细胞，可以考虑其用于肿瘤病人的免疫治疗。