TLR7配体GD联合CEA抗原制备特异性GD‑DC‑CTL的方法与流程

本发明属于细胞免疫学领域，尤其是涉及TLR7配体GD联合CEA抗原制备特异性GD-DC-CTL的方法和抗肿瘤过继性免疫细胞治疗应用。

背景技术：

近年来肿瘤已成为严重威胁人类健康的重要疾病之一。肿瘤免疫治疗是临床上继手术、放疗与化疗后，用于肿瘤治疗的第四大疗法。其中免疫细胞治疗对提高生命质量、延长生存期有显著的效果，备受国内外推崇，是目前全身治疗的最佳手段之一，临床潜力巨大。

树突状细胞(DC)是人体内功能强大的主要的专职抗原提呈细胞，成熟DC表面高表达MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD83、CD86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，能诱导出抗原特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)反应。CTL细胞是CD3⁺CD8⁺CD28⁺的T细胞亚群，为一种特异性T细胞，对肿瘤细胞具有直接杀伤作用。

Toll样受体(TLRs)是天然免疫系统中不可或缺的一部分，广泛地表达于DC，能够特异识别病原体表面的病原相关的分子模式(PAMPs)。在TLRs家族中，TLR7是首先被发现可以由小分子化合物激活的Toll样受体。TLR7通过MyD88依赖的信号通路活化DC，促进DC的成熟和抗原肽的呈递，从而活化CTL细胞，启动获得性免疫。本发明使用自主研发合成的小分子TLR7配体GD，9-丙酰氧基-8-羟基-2-(2-甲氧基乙氧基)-腺嘌呤，能特异性激活TLR7，有很强的佐剂作用，并具有稳定结构、低毒性以及低成本等优点。将TLR7配体应用于肿瘤免疫治疗中，从而制备出更有效的CTL细胞。经TLR7配体刺激活化的CTL细胞，能分泌更多的细胞因子产生协同作用，提高杀瘤活性。

癌胚抗原(CEA)是一种广为人知的广谱肿瘤标志物。CEA是免疫球蛋白超基因家族的成员之一，不只是一种单纯的肿瘤标志物，而且是与肿瘤恶性化有关的分子，在多种肿瘤中表达，可以作为肿瘤免疫治疗的有效靶抗原。人们把有CEA表达的肿瘤称为CEA阳性肿瘤，CEA阳性肿瘤包括90％以上的胃癌，肠癌，胰腺癌，70％以上的非小细胞肺癌等，目前临床上常把CEA作为大肠癌和消化道恶性肿瘤的辅助诊断指标。

目前还没有文献报道过TLR7配体GD联合CEA抗原制备特异性GD-DC-CTL的方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，通过LR7配体GD(结构式如下式所示)联合CEA抗原优化DC-CTL细胞培养方案，提供一种制备时间短、扩增倍数高、CTL纯度高且杀伤效果好的CEA抗原特异性GD-DC-CTL细胞的制备方法。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.084(brs,1H),9.954(s,1H),6.486(s,2H),4.249(t,J＝3.60Hz,2H),3.693(t,J＝5.20Hz,2H),3.584(t,J＝3.60Hz,2H),3.266(s,3H),2.205(t,J＝6.00Hz,2H),1.844(t,J＝5.60Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.15,160.09,152.67,149.75,147.88,98.61,70.62,65.65,58.45,38.86,31.14,23.80.MS(ESI)calculated for C₁₂H₁₇N₅O₅,m/z[M+1]312.1230；found 334.1120(M+Na)⁺.

本发明所提供的CEA抗原特异性CTL细胞，是指CD3⁺CD8⁺CD28⁺T淋巴细胞为主的效应细胞，检测其对CEA阳性的肿瘤细胞的杀伤活性可达90％左右，与对照组非特异性的CTL细胞相比显著增强。

为实现上述目的，设计一种TLR7配体GD联合CEA抗原制备特异性GD-DC-CTL的方法，包括如下步骤：

1)采集外周血，分离提取单个核细胞；

2)诱导活化DC细胞与CTL细胞；

3)使用TLR7配体联合CEA抗原刺激未成熟DC细胞；

4)进一步通过细胞因子诱导未成熟DC细胞成为成熟DC细胞；

5)将成熟DC细胞与CTL细胞共培养，获得具有CEA抗原特异性GD-DC-CTL细胞。

作为优选，所述步骤1)为将血细胞用Ficoll淋巴细胞分离液进行密度梯度离心获得单个核细胞；所述步骤2)为通过贴壁法将上述单个核细胞进一步分离获得单核细胞和淋巴细胞。

进一步地，所述步骤1)具体为采用Ficoll密度梯度离心法分离收集，

并用生理盐水洗涤2次，低速离心后获得PBMCs。

所述步骤2)具体为将获取的PBMCs重悬于AIM-V^TM培养基中，然后于37℃，5％C0₂和饱和湿度的培养箱内静止2h,吸取其中悬浮细胞另行CTL细胞诱导培养，贴壁细胞则为单核细胞。

作为优选，所述步骤3)具体包括：将含有8-10％自体灭活血浆、800-1000IU/ml GM-CSF、800-1000IU/ml IL-4、10mM TLR配体的AIM-V^TM培养基加入获取的单核细胞中，继续培养；培养2-3天后，更换新鲜培养基，并在新鲜培养基中加入10μM TLR7配体和1-2g/ml的CEA抗原，继续培养；培养1-2天后，加入TNF-α；继续培养1-2天，进行DC成熟度。

作为优选，所述步骤3)中加入的TNF-α终浓度为8-15ng/ml；GM-CSF浓度为800IU/ml、IL-4浓度为1000IU/ml；所述的DC成熟度的检测方法为流式细胞术。

进一步地，所述步骤3)中加入的TNF-α终浓度为10ng/ml。

作为优选，所述步骤2)具体包括：将收集的淋巴细胞重悬于含8-10％自体灭活血浆的AIM-V^TM培养基中，调整细胞密度(1-2)×10⁶/ml左右，并加入IFN-γ至终浓度500-1500IU/ml,最后转移入培养瓶内进行培养；培养20-28小时后加入抗CD3单抗、抗CD28单抗、IL-1α、IL-2，培养6、7天，其中每2-3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2)×10⁶/ml。

作为优选，所述步骤2)中所加入的抗CD3单抗浓度为50-500ng/ml,抗CD28单抗的浓度为50-500ng/ml,IL-1α的浓度为0.5-5ng/ml,IL-2的浓度为50-1000IU/ml。

进一步地，所述步骤2)中IFN-γ的浓度为1000IU/ml,培养20-28小时候加入抗CD3单抗浓度为100ng/ml,抗CD28单抗的浓度为200ng/ml,IL-1α的浓度 为1ng/ml,IL-2的浓度为1000IU/ml。

作为优选，所述步骤5)具体包括：将步骤4)及步骤2)中培养的DC和CTL收集并重悬于含有50-1000IU/ml的IL-2的AIM-V^TM培养基中在进行培养至第14-21天，每2-3天进行补加含有50-10001U/ml的IL-2的AIM-V^TM培养基。

进一步优选地，所述IL-2终浓度为1000IU/ml。

本发明所制备的人GD-DC-CTL细胞主要应用于癌症病人的治疗。

本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。

本发明同现有技术相比：本发明所制备的GD-DC-CTL细胞与常规培养制备的CIK相比，其对CEA阳性的肿瘤细胞的杀瘤活性明显增加，体外实验时杀瘤活性达到90％以上，明显高于常规方法培养的CIK细胞。同时也具有制备成本低廉、工序简单、条件易控、对设备的要求较低、易于规模化生产等优势。

附图说明

图1：成熟DC形态。培养第7天，成熟DC在倒置显微镜下的形态，放大倍率为40×；

图2：培养第7天流式细胞术进行DC成熟度检测；

图3：不同培养方式培养的外周血来源PBMCs生长曲线(n＝8)。外周血来源的PBMCs通过不同方式培养，在第0、7、11、15天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时(第0天)的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；DC-CTL组：指采用常规培养法培养的DC-CTL细胞；GD-DC-CTL组：指本发明所采用的培养方式。

图4：采用流式细胞仪进行免疫表型检测(n＝8)。外周血来源的PBMCs，通过不同方式培养，在第14天取细胞进行流式荧光抗体：抗CD3-FITC、CD8-PerCP、CD28-BV510进行表面染色并检测。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；DC-CTL组：指采用常规培养法培养的DC-CTL细胞；GD-DC-CTL组：指本发明所采用的培养方式。

图5：采用CCK-8细胞毒活性检测试剂盒对不同培养方式培养的外周血来源PBMCs进行细胞毒性检测(n＝8)。通过不同方式培养，在第15天取细胞通过 CCK-8试剂盒进行细胞毒活性检测。CIK组：指采用斯坦福大学应用的培养法培养的CIK细胞；DC-CTL组：指采用常规培养法培养的DC-CTL细胞；GD-DC-CTL组：指本发明所采用的培养方式。横坐标：表示效靶细胞比值，E：T＝10：1表示效应细胞与靶细胞的比值为10：1，E：T＝20：1表示效应细胞与靶细胞的比值为20：1，E：T＝40：1表示效应细胞与靶细胞的比值为40：1。

图6：GD分子结构式。

具体实施方式

下面用实例来具体说明本发明，但本发明并不受其限制。下面实例中凡未注明具体条件的实验方法，均为遵照常规方法和厂家提供的操作说明执行。

实施例1

本实施例1是分离获得的PBMCs并进行GD-DC-CTL细胞的培养。包括以下步骤：

1.采集患者外周血80-100ml,经Ficoll密度梯度离心获得单个核细胞。具体步骤为：1500转/分，离心10分钟，吸取上层血浆层，56℃灭活30分钟后离心备用，用生理盐水对倍稀释沉淀的血细胞，人淋巴细胞分离液与稀释血液按1：2的比例加入离心管中，2000转/分，离心20分钟，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，转速分别为1600转/分，1300转/分，均离心7分钟，即得到PBMCs。

2.通过贴壁法将上述PBMCs进一步分离获得单核细胞和悬浮细胞。具体步骤为：将上述分离的PBMCs重悬于AIM-V^TM培养基中，调整细胞密度为(5-10)×10⁶/ml,总体积为10m1加入T75cm²的细胞培养瓶内，于37℃、5％C0₂和饱和湿度的培养箱内贴壁2h；轻轻晃动培养瓶，使未贴壁细胞重新悬浮；然后收集悬浮的未贴壁细胞，则留下的贴壁细胞即为单核细胞。

3.单核细胞诱导分化为成熟的DC。具体步骤为：将20ml含有10％自体血浆、800IU/ml GM-CSF、10001U/mlIL-4的AIM-V^TM培养基加入上述T75cm²的培养瓶内，然后置于37℃、5％C0₂和饱和湿度的培养箱内培养。第三天(72h)吸弃10ml培养瓶内的培养基，并补加10ml新鲜的含有10％自体血浆、8001U/ml GM-CSF、10001U/mlIL-4、10μM TLR7配体GD和1-2g/ml的CEA抗原的AIM-V^TM培养基，其中肿瘤抗原优选的浓度为10g/ml。在细胞培养的第五天，加入TNF-α(10ng/mL)。细胞培养的第6、7天，分别通过倒置显微镜和流式细胞术进行 DC形态(见图1)和成熟度(见图2)检测。

4.CTL细胞的诱导培养。具体步骤为：将实施例1步骤2中收集的悬浮细胞重悬于含10％自体灭活血浆的AIM-V^TM培养基中，调整细胞密度2×10⁶/ml左右，并加入IFN-γ至终浓度1000IU/ml,最后转移入培养瓶内进行培养。培养24小时后加入抗CD3单抗、IL-Iα、IL-2，培养6、7天，其中每2-3天补加含有IL-2的新鲜培养基，使补加培养基后的细胞密度控制在(1-2)×10⁶/ml。其中，抗CD3单抗浓度为100ng/ml,IL-1α的浓度为1ng/ml,IL-2的浓度为10001U/ml。

5.DC-CTL细胞的诱导培养。具体步骤为：将实施例1步骤3、4中培养6-7天的DC和CTL收集并重悬于含有10001U/m1的IL-2的AIM-V^TM培养基中在进行培养至第14-21天(PBMCs分离为第0天计算)，以后每2-3天进行补加含有1000IU/ml的IL-2的AIM-V^TM培养基。

实施例2

本实施例2是对GD-DC-CTL细胞进行形态学和增值能力检测。包括以下步骤：

1.DC和CTL共培养24小时即可见细胞沉于培养瓶的底部，有大量的大小不一的集落和不规则的单个核细胞。取培养15天的细胞100ul，加入100ul 0.4％台盼蓝染色液，活细胞不染色，死细胞染成蓝色，显微镜下计数。本发明制备的细胞活力大于95％。

2.在第0、7、13、15天分别用细胞计数板和细胞计数仪进行计数，将当前细胞总数除以开始培养时的细胞总数，所得数值即为细胞增殖倍数，以此进行动态观察细胞增殖情况并作为细胞补加新鲜培养基时的参考，细胞增殖倍数见图3、表1。

表1：不同培养方式培养的外周血来源PBMCs扩增倍数(n＝8)

结果显示，随着培养时间的延长，三组细胞均在增长，第15天,DC-CTL组和GD-DC-CTL组细胞扩增倍数明显高于CIK组，差异有统计学意义(P<O.05)。

实施例3

本实施例3是对GD-DC-CTL细胞进行免疫表型检测。步骤如下：

取第15天的细胞，用含5％新生牛血清的PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×10⁶/ml,每个检测管内加入50ul细胞悬液，加入荧光标记抗体(抗CD3-FITC、CD8-PerCP、CD28-BV510)染色，4℃避光孵育30分钟，用上述PBS洗涤2次，加入含有1％多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式细胞仪进行检测，数据文件采用Flow Jo软件分析，结果见图4、表2。

表2：不同培养方式对外周血来源PBMCs表型影响(n＝8)

结果显示，培养第15天，三组细胞中CD3⁺细胞之间差异无统计学意义；CD3⁺CD8⁺CD28⁺细胞中，DC-CTL组和GD-DC-CTL组均明显高于CIK组，且差异均有统计学意义(P<O.05)；CD3⁺CD8⁺CD28^-细胞中,DC-CTL组和GD-DC-CTL组明显低于CIK组，差异有统计学意义(P<O.05)。

实施例4

本实施例4是对GD-DC-CTL细胞进行细胞毒活性检测。包括以下步骤：

1.取培养第15天的GD-DC-CTL细胞，检测对CEA阳性肿瘤细胞株的杀伤活性。

2.调整CEA阳性肿瘤细胞密度为4×10⁴/孔，96孔板，每孔100ul,按1：10、1：20、1：40的比例与GD-DC-CTL细胞混合，各浓度均设置3复孔，同时设置单独靶细胞(肿瘤细胞)对照、单独效应细胞(效应细胞)对照和单独培养基空白对照。

3.置于37℃、5％C02和饱和湿度的培养箱内培养4小时后，每孔加入10 I 的CCK-8溶液，再培养4h，然后用酶标仪于450nm波长处测定吸光度OD值。

4.根据公式：杀伤率(％)：[1一(实验组OD值一效应细胞组OD值/(肿瘤细胞组OD值)×100％计算杀伤效率。其中，公式中各OD值均为减去空白对照组OD值后的值。结果见图5、表3。

表3：不同培养方式对外周血来源PBMCs细胞毒活性影响(n＝8)

结果显示，不同效靶比之下，CIK组与DC-CTL组、GD-DC-CTL组之间差异具有统计学意义(P<O.05)。