本发明涉及一种高纯度罗汉果苷V的分离纯化方法，具体涉及一种以罗汉果粗制品为原料，制得高纯度罗汉果苷V的分离纯化方法。
背景技术：
罗汉果味甘性凉，归肺、大肠经，有润肺止咳，生津止渴的功效，适用于肺热或肺燥咳嗽，百日咳及暑热伤津口渴等，此外还有润肠通便的功效。现代医学研究证实，罗汉果含有一种比蔗糖甜300倍的甜味素——罗汉果苷V，热量仅为蔗糖的五十分之一，是一种十分理想的天然甜味剂，可作为糖尿病、肥胖等不宜吃糖者的理想替代糖源。
罗汉果苷V纯度的高低是衡量其甜度和口感的重要指标，高纯度的罗汉果苷V目前在国内外食品、饮料行业备受青睐。
虽然罗汉果提取物在国内早已实现了规模化生产，但是，现有产品中的罗汉果苷V的纯度普遍在60%以下，高纯度罗汉果苷V的制备仅停留在理论和实验室阶段，高纯度罗汉果苷V的批量生产难以实现。
CN1706861A公开了一种高纯度罗汉果甜苷V的制备方法和用途，在纯化步骤采用正相硅胶柱层析和反相硅胶C-18柱串联分离技术，正相硅胶柱层析使用的洗脱剂为氯仿和甲醇，反相硅胶C-18柱使用的洗脱剂为丙酮和水。该方法使用正向硅胶和反向硅胶串联分离，工艺繁琐，规模化难度大、投资高，在技术效果部分对罗汉果苷V的收率和纯度均无具体描述；且使用的溶剂都属于第二类毒性有机溶剂（无基因毒性，但有动物致癌性的溶剂），在食品药品行业不宜使用。
CN 103923152 B公开了一种罗汉果甙 V 的提取方法，是以罗汉果鲜果为原料，经提取、大孔树脂吸附分离、离子交换树脂精制、硅胶精制后浓缩再喷雾干燥，获得终产品罗汉果甙V提取物。该方法采用大孔树脂富集罗汉果糖的各种甙元，而采用水相中硅胶吸附杂质的方法分离纯化，其精制的产品含量最高也只能达到60%，不能将苷V与其它罗汉果甜苷分离开。
CN 101402665 B公开了一种罗汉果苷 V 的制备方法，其中，粗苷采用硅胶柱层析和后续的 C18 反相柱层析，正相硅胶柱层析使用的洗脱剂为二氯甲烷和乙醇，反相硅胶C-18柱使用的洗脱剂为乙腈和水。虽然正相硅胶层析加反相C18柱串联的纯化效果较为理想，但是，最终转移率很低，只有50%左右，而且操作过程复杂，对馏出物需分成小份，如接收的每一小杯为20mL都要频繁进行 HPLC 检测，设备投资高、规模小，不利于实际生产应用。
CN 102659739 A公开了一种白杨黄素二甲醚的提取方法，属于植物有效成分提取分离技术领域，使用硅胶拌样上硅胶层析柱，但其硅胶拌样为实验室常用手法，采用有机溶剂拌样，然后挥干再装柱，存在操作时间长、量少、安全隐患，不适合工业化生产的技术缺陷。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种产品收率、纯度高，工艺简单，操作性强，安全环保，成本低，适用于工业化生产的高纯度罗汉果苷V的分离纯化方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种高纯度罗汉果苷V的分离纯化方法，包括以下步骤：
（1）溶解、离心：取罗汉果粗制品，加水进行溶解，离心，得离心液；
（2）超滤、纳滤、浓缩：将步骤（1）所得离心液进行超滤，纳滤，真空浓缩，得浓缩液；
（3）硅胶拌样、洗脱、浓缩：将步骤（2）所得浓缩液与硅胶混合拌样，干燥，装入硅胶层析柱，然后用洗脱液进行洗脱，分段收集目标馏分，浓缩，干燥，得罗汉果苷V干粉；
（4）结晶、洗涤、干燥：将步骤（3）所得罗汉果苷V干粉溶解，过滤，结晶，晶体洗涤、干燥，得高纯度罗汉果苷V产品。
优选地，步骤（1）中，所述罗汉果粗制品中罗汉果苷V的质量含量为20～50%。罗汉果鲜果经破碎后水提，提取液经冷却、离心、过滤后，上大孔吸附层析柱，洗脱液经脱盐、脱色，即得罗汉果粗制品，这是本领域常用的得到罗汉果粗制品的方法，也可市购。
优选地，步骤（1）中，所述水的用量为罗汉果粗制品质量的10～20倍。发明人研究发现，为了更有利于后续的超滤、纳滤，溶解罗汉果粗制品的水量若低于10倍，则超滤、纳滤效果欠佳，若高于20倍，分离纯化效果无明显提升，徒然浪费水资源。
优选地，步骤（1）中，所述离心的速率为10000～15000r/min。所述离心优选管式离心。发明人研究发现，若离心速率低于10000r/min，则分离效果欠佳，若离心速率高于15000r/min，分离效果无明显提升。
优选地，步骤（2）中，所述超滤所用超滤膜的截留分子量为10000～30000道尔顿；超滤时，膜的压力为1.0～2.0MPa，温度为10～25℃，超滤至滤出液电导率≤500μs/cm为止。
优选地，步骤（2）中，所述纳滤所用纳滤膜的截留分子量为1000～5000道尔顿；纳滤时，膜的压力为2.0～4.0MPa，温度为10～25℃，纳滤浓缩至料液中固形物的质量浓度为10～30%，滤出液电导率≤500μs/cm为止。
优选地，步骤（2）中，所述真空浓缩的真空度为-0.10～-0.06MPa，温度为60～90℃；真空浓缩至浓缩液中固形物的质量浓度为60～70%。
优选地，步骤（3）中，所述硅胶的用量为浓缩液质量的0.5～5.0倍（更优选1～4倍）。发明人研究发现，浓缩液直接上硅胶层析展开时色谱带拖尾严重、重叠，分离效果欠佳；而采用拌样上柱时，发明人发现，当硅胶的用量为浓缩液质量的0.5～5.0倍时，展开效果较好，其中，拌样硅胶用量越少，即展开原点越集中时，在洗脱时，每个成分的色谱带间隔大，色谱带在硅胶柱上的分离越好，展开效果越佳。
优选地，步骤（3）中，所述混合拌样后的干燥为烘箱干燥，温度为50～70℃，烘干至表面干燥即可；所述浓缩后的干燥为微波干燥，干燥的真空压力为-0.10～-0.08MPa，温度为30～40℃，干燥至产品中水分含量＜5%。选用微波干燥，可保证干燥过程中干粉不焦化、碳化。
优选地，步骤（3）中，所述洗脱液为乙酸乙酯和乙醇的体积比为20/80～50/50的混合溶液。所述乙酸乙酯和乙醇均为食品级，发明人通过薄层展开实验，确定洗脱用乙酸乙酯和乙醇的混合溶液以20/80～50/50的体积比混合，其薄层展开效果较好。
优选地，步骤（3）中，所述洗脱液的用量为6～15BV（更优选8～12BV），洗脱的流速为0.1～2.5BV/h（更优选0.2～1.0BV/h）。发明人研究发现，当洗脱液用量小于6BV时，洗脱程度欠佳，而当洗脱液用量大于15BV时，造成试剂浪费。通过对照罗汉果苷V标样点薄层检测，确定要收集的目标馏分段，一般为3.5～10.0BV段。
优选地，步骤（4）中，所述罗汉果苷V干粉溶解所用试剂为乙酸乙酯和乙醇的体积比为70/30～80/20的混合溶液，每100mL试剂中溶解罗汉果苷V干粉40～60g（更优选50～55g），所述溶解的温度为50～70℃。
优选地，步骤（4）中，所述结晶的温度为2～5℃，结晶的时间为20～28h。
本发明方法的有益效果如下：
（1）按照本发明方法所得高纯度罗汉果苷V产品的纯度≥98.4%，最终收率＞90%；
（2）本发明方法打破现有技术的局限，简化工艺流程，操作性强，不使用有毒有害化学溶剂，安全环保，且成本低，适用于工业化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
本发明实施例所使用的罗汉果粗制品，编号V25，购于湖南华诚生物资源股份有限公司，罗汉果苷V的质量含量为25%；所使用的乙酸乙酯和乙醇均为食品级材料；所使用的材料、试剂，如无特殊说明，均通过常规商业途径获得。
实施例1
（1）溶解、离心：取100g罗汉果粗制品，加入1kg去离子水进行溶解，在离心速率10000r/min下，进行管式离心，得离心液；
（2）超滤、纳滤、浓缩：将步骤（1）所得离心液用截留分子量为10000道尔顿的超滤膜，在膜的压力为1.0MPa，温度为10℃的条件下，超滤至滤出液电导率为500μs/cm为止，所得超滤液再用截留分子量为1000道尔顿的纳滤膜，在膜的压力为2.0MPa，温度为10℃，纳滤浓缩至料液中固形物的质量浓度为10%，滤出液电导率为500μs/cm为止，所得纳滤截留液再在真空度-0.065MPa，温度88℃下，真空浓缩至浓缩液中固形物的质量浓度为61%，得浓缩液130g；
（3）硅胶拌样、洗脱、浓缩：将步骤（2）所得130g浓缩液与130g硅胶混合拌样，在热风烘箱中，60℃下烘干至硅胶表面干燥，装入硅胶层析柱，然后用12BV乙酸乙酯和乙醇的体积比为20/80的混合溶剂，以流速0.25BV/h进行洗脱，分段收集馏分，通过对照罗汉果苷V标样点薄层检测，取6～10BV段馏分进行浓缩，再在真空压力为-0.1MPa，温度为30℃，微波干燥至产品水分含量＜5%，得罗汉果苷V干粉27.3g；
（4）将步骤（3）所得27.3g罗汉果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的体积比为70/30的混合溶剂，在60℃下充分溶解，过滤，然后放置于5℃的冷藏室结晶24h后，对晶体进行洗涤、干燥，得高纯度罗汉果苷V产品23.5g。
用液相外标检测法，检测本实施例所得高纯度罗汉果苷V产品的纯度为98.9%，收率为92.97%。
实施例2
（1）溶解、离心：取100g罗汉果粗制品，加入1.5kg去离子水进行溶解，在离心的速率13000r/min下，进行管式离心，得离心液；
（2）超滤、纳滤、浓缩：将步骤（1）所得离心液用截留分子量为20000道尔顿的超滤膜，在膜的压力为1.5MPa，温度为15℃的条件下，超滤至滤出液电导率为400μs/cm为止，所得超滤液再用截留分子量为3000道尔顿的纳滤膜，在膜的压力为2.6MPa，温度为15℃，纳滤浓缩至料液中固形物的质量浓度为20%，滤出液电导率为400μs/cm为止，所得纳滤截留液再在真空度-0.08MPa，温度70℃下，真空浓缩至浓缩液中固形物的质量浓度为65%，得浓缩液122g；
（3）硅胶拌样、洗脱、浓缩：将步骤（2）所得122g浓缩液与240g硅胶混合拌样，在热风烘箱中，60℃下烘干至硅胶表面干燥，装入硅胶层析柱，用10BV乙酸乙酯和乙醇的体积比为30/70的混合溶剂，以流速0.5BV/h进行洗脱，分段收集馏分，通过对照罗汉果苷V标样点薄层检测，取5～8.5BV段馏分浓缩，再在真空压力为-0.088MPa，温度为35℃，微波干燥至产品水分含量＜5%，得罗汉果苷V干粉26.1g；
（4）将步骤（3）所得26.1g罗汉果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的体积比为70/30的混合溶剂，在70℃下充分溶解，过滤，然后放置于4℃的冷藏室结晶24h后，对晶体进行洗涤、干燥，得高纯度罗汉果苷V产品23.6g。
用液相外标检测法，检测本实施例所得高纯度罗汉果苷V产品的纯度为98.6%，收率为93.08%。
实施例3
（1）溶解、离心：取100g罗汉果粗制品，加入2.0kg去离子水进行溶解，在离心的速率15000r/min下，进行管式离心，得离心液；
（2）超滤、纳滤、浓缩：将步骤（1）所得离心液用截留分子量为30000道尔顿的超滤膜，在膜的压力为2MPa，温度为20℃的条件下，超滤至滤出液电导率为300μs/cm为止，所得超滤液再用截留分子量为5000道尔顿的纳滤膜，在膜的压力为3MPa，温度为20℃，纳滤浓缩至料液中固形物的质量浓度为30%，滤出液电导率为300μs/cm为止，所得纳滤截留液在真空度-0.1MPa，温度60℃下，真空浓缩至浓缩液中固形物的质量浓度为70%，得浓缩液110g；
（3）硅胶拌样、洗脱、浓缩：将步骤（2）所得110g浓缩液与440g硅胶混合拌样，在热风烘箱中，60℃下烘干至硅胶表面干燥，装入硅胶层析柱，用8BV乙酸乙酯和乙醇的体积比为50/50的混合溶剂，以流速0.5BV/h进行洗脱，分段收集馏分，通过对照罗汉果苷V标样点薄层检测，取3.5～6.5BV段馏分浓缩，再在真空压力为-0.080MPa，温度为40℃，微波干燥至产品水分含量＜5%，得罗汉果苷V干粉27.3g；
（4）将步骤（3）所得27.3g罗汉果苷V干粉用50mL乙酸乙酯和乙醇的体积比为80/20的混合溶剂，在50℃下充分溶解，过滤，然后放置于2℃的冷藏室结晶24h后，对晶体进行洗涤、干燥，得高纯度罗汉果苷V产品23.1g。
用液相外标检测法，检测本实施例所得高纯度罗汉果苷V产品的纯度为98.4%，收率为90.92%。