三萜类化合物AntcinK及其保肝活性和应用的制作方法

本发明涉及牛樟芝三萜类化合物Antcin K的提取分离方法，以及该化合物作为保肝药物的药物新用途，具体涉及它在保护急性肝炎导致的急性肝损伤、保护酒精性脂肪肝中的应用。

背景技术：

牛樟芝(Antrodia camphorata，Antrodia cinnamomea)又名樟芝、牛樟菇、樟菇、樟内菇、血灵芝、樟窟内菇、红樟芝、樟生薄孔菌、红樟孤等，为一种中国台湾特有的寄生于牛樟树上的名贵真菌。牛樟芝最早在1990年被报道，目前普遍认为牛樟芝属于真菌界(Fungi)，担子门(Basidiomycota)，担子菌纲(Homobasidiomyeetes)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaeeae)，薄孔菌属(Antrodia)。其在历史上被广泛用作抗癌、保肝、解毒、止泻药物，同时还被报道具有增强免疫力、抗氧化、抗炎等作用，被称为“台湾森林的红宝石”。牛樟芝的成分多种多样，迄今为止已经从各种来源的牛樟芝子实体和菌丝体中分离得到超过230种化合物，大分子包括蛋白质、核酸、多糖等，小分子包括三萜类、甾体、苯环衍生物等。

肝脏是腹腔内最大的实质性器官，担负人体的重要生理功能。肝损伤在临床上较为常见，一直是医学科学重点研究的对象之一。引起肝损伤的因素很多，包括药物(化疗药、解热镇痛药、抗病毒药等)，大自然和人类工业生产过程中的化学物质(黄曲霉毒素、四氯化碳、二甲基甲酰胺等)，病毒(甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒等)以及酒精等。肝损伤会导致肝脏不同程度的肝细胞坏死、脂肪变性、肝硬化甚至肝癌。因此，预防和治疗肝损伤是临床上肝病治疗的重要环节之一，是抑制肝纤维化、肝坏死、肝硬化以及肝癌等疾病发生和发展的基础。临床上各种保肝药物种类繁多，但大多价格昂贵，或有毒副作用，从而使它们的使用受到限制。因此，发现有效的新型保肝药物仍然具有重要的现实意义和良好的应用前景。

美国专利US20030113297A1公开了一种牛樟芝菌丝体液体发酵方法，及其产物菌丝体以及牛樟芝子实体的混合物的保护急性肝损伤作用，但这一发现的研究对象牛樟芝子实体来源不明确，也未提供其指纹图谱及其主要成分种类。中国专利CN101785793A公开了善生生技公司的牛樟芝胶囊(其内容物为固态培养的牛樟芝萃取物)的减轻四氯化碳诱导的慢性肝炎作用，这一发现中未声明牛樟芝萃取方法及所使用胶囊的指纹图谱，也未知其中的主要成分。 也有文献报道液体发酵牛樟芝菌丝体提取物对四氯化碳诱导的肝损伤有保护作用(Song TY等，J Agr Food Chem 2003,51,1571-1577；Hsiao G等，J Agr Food Chem 2003,51,3302-3308；Lin WC等，World J Gastroentero 2006,12,2369-2374.)。但是，已有专利和文献对牛樟芝提取物的保肝作用多是针对较易获得的液态或固态发酵菌丝体进行的研究。

液体发酵获得的牛樟芝菌丝体具有三萜等活性成分含量低的缺点，与野生牛樟芝及平皿培养、椴木培养获得的牛樟芝成分相差很大，可能存在截然不同的活性成分。由于药材稀少，对于野生、椴木培养的牛樟芝子实体的保肝药理活性研究和报道受到限制，与此同时，作为一种新兴的优质人工牛樟芝培养方法，平皿培养法获得的牛樟芝的药理活性也未被充分研究。虽然关于牛樟芝保肝作用的研究受到广泛关注，但是，其中具有药理活性的化学成分及其作用机制尚未完全阐明。

技术实现要素：

本发明针对目前对野生、椴木培养和平皿培养牛樟芝子实体保肝活性研究缺乏，对牛樟芝中保肝活性成分及机制研究也较为局限的情况，克服现有的技术及资源局限，通过对平皿培养、椴木培养或野生牛樟芝子实体进行提取分离，提供具有多种保肝活性的牛樟芝活性三萜类化合物。

本发明在对特定来源的牛樟芝子实体进行提取分离后获得活性三萜类化合物Antcin K，并对其多种保肝活性进行测试。

所述牛樟芝活性三萜类化合物Antcin K的结构式如下：

所述三萜类化合物Antcin K包括它的两个差向异构体25S-Antcin K和25R-Antcin K(结构如下所示)及其以任意比例组成的混合物。

本发明的三萜类化合物Antcin K是从野生、椴木培养和/或平皿培养的牛樟芝子实体中提取出来的，优选将以C1～C5的脂肪醇提取牛樟芝子实体所得的提取物进行硅胶柱分离和色谱分离纯化，得到含有不同三萜类化合物的组分。

具体的提取过程可以是：将野生、椴木培养和/或平皿培养的牛樟芝子实体粉碎，无水乙醇加热回流提取，提取液减压浓缩得总浸膏，总浸膏用水混悬，石油醚萃取，弃去石油醚部分；水相再用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯层合并蒸干，硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，洗脱流份经色谱分离纯化得到25S-Antcin K和25R-Antcin K。

本发明在对牛樟芝活性三萜类化合物Antcin K进行提取分离后，研究了其在细胞水平及动物体内保护CCl₄造成的急性肝炎肝损伤活性，以及其保护酒精诱导的脂质异常积累的活性，结果显示其具有通过抗炎活性降低CCl₄造成的急性肝炎肝损伤作用，降低肝损伤导致的转氨酶升高，抑制酒精导致肝细胞中脂质积累的保肝活性。

本发明之牛樟芝活性三萜类化合物Antcin K可用于制备具有保肝作用的药物和/或保健品，在剂型方面可采用各种剂型，如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊或丸剂等剂型。

本发明所提供的具有保肝作用的药物和/或保健品含有所述三萜类化合物Antcin K及其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药中的至少一种。所述具有保肝作用的药物和/或保健品是如下功能(1)和/或(2)：1)预防和/或治疗急性肝炎及肝损伤；2)预防和/或治疗酒精性脂肪肝。所述急性肝炎及肝损伤通常是化学性肝毒性物质造成的急性肝炎及肝损伤，这样的化学物质可能是酒精、环境中的化学毒物和某些药物。

本发明所述活性三萜类化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体、前药以及它们的混合物为有效成分制备的药物或保健品也属于本发明的保护范围。

需要的时候，在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体或辅料。所述载体或辅料包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

利用上述活性化合物或其药学上可接受的盐、酯、溶剂化物、立体异构体、互变异构体以及前药作为活性成分，单独或组合使用，或与其它药物、辅料等配合制备成各种剂型，包 括但不限于片剂、散剂、丸剂、注射剂、胶囊剂、膜剂、栓剂、膏剂、冲剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明分离纯化出牛樟芝三萜类化合物Antcin K，并通过多种活性筛选验证，发现该化合物具有突出的保护CCl₄造成的急性肝炎肝损伤活性，以及保护酒精诱导的脂质异常积累的活性。基于该化合物对急性肝炎及肝损伤和酒精性脂肪肝具有显著的防治作用，可广泛应用于保肝药物和保健品中。

附图说明

图1为25S-Antcin K的氢谱。

图2为25S-Antcin K的碳谱。

图3为25R-Antcin K的氢谱。

图4为25R-Antcin K的碳谱。

图5为实施例2牛樟芝活性三萜类化合物Antcin K(20μM)对CCl₄造成的HepG2细胞急性损伤的保护作用测试结果。

图6为实施例3中Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝炎肝损伤的保护作用血生化结果，其中(a)显示了各组血清谷丙转氨酶(ALT)浓度，(b)显示了各组血清谷草转氨酶(AST)浓度。

图7为实施例3中各组动物肝脏HE染色病理切片。

图8为Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝炎肝损伤的保护作用机制研究qPCR结果。

图9为三萜类化合物Antcin K(AK)对酒精诱导HepG2细胞脂质沉积的保护作用的筛选结果。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，本领域技术人员应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、牛樟芝中三萜类化合物Antcin K的分离纯化

一、实验材料和方法。

本方法中提及的所有化学试剂均购自北京化工厂。

首先取平皿培养的干燥牛樟芝子实体500g粉碎成粗粉，分两批，每批用6L 95％乙醇回流提取6次，每次3h；合并提取液，减压旋蒸得总浸膏约200g；总浸膏加4L水混悬后，依次用4L石油醚萃取5次，水相用乙酸乙酯萃取5次；合并蒸干得乙酸乙酯层约132g。

取乙酸乙酯层约130g浸膏经硅胶柱分离(200～300目，青岛海洋化工有限公司)，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱(1:0,10:1,6:1,4:1,3:1,2:1,1:1,0:1)，根据TLC检测和HPLC-UV检测，将洗脱下来的流份合并为12个流份(A-L)。Antcin K(S/R)为流份K直接通过自动纯化色谱仪(Waters Purification System 2545,配有二元泵溶剂洗脱系统，自动进样器及紫外检测仪)制备得到，制备条件为甲醇-H₂O-TFA(62:38:0.03，v/v，15mL/min，254nm)，25S-Antcin K及25R-Antcin K的保留时间分别为t_S＝21.6min和t_R＝23.4min。25S-Antcin K及25R-Antcin K的氢谱、碳谱如图1至图4所示，分子式为C₂₉H₄₄O₆。

实施例2、牛樟芝中三萜类化合物Antcin K对CCl₄造成的HepG2细胞急性损伤的保护作用

一、实验材料和方法。

HepG2人肝癌细胞购自美国菌种保存中心(ATCC)，实验采用处于对数生长期的细胞。四氯化碳(阿拉丁，上海，中国)，DMEM培养基(中科迈晨，中国)，DMSO(二甲基亚砜)(AppliChem)，优级胎牛血清(PAN,南非)，青霉素－链霉素细胞培养双抗(中科迈晨，中国)，MTS(Promega，美国)，水飞蓟素(华中海威，北京)。

SpectraMax Plus 384光吸收型酶标仪(Molecular Devices，美国)，3111型细胞培养箱(Thermo，美国)，电子分析天平(Satorious，德国)。

CCl₄储液配置：DMSO与CCl₄按1∶1(v/v)混合，涡旋得到50％CCl₄储备液。向DMEM培养基中加入储备液，得到含CCl₄浓度0.35％的培养基。

HepG2培养于含10％FBS和1％双抗的DMEM培养基中，按1×10⁴/孔种于96孔板中，培养12h后将培养基吸出，分组加入以下液体(100μL/孔，3复孔/组)：

空白组：不含CCl₄的空白DMEM培养基(加入不含细胞空白孔)；

空白对照组：含与加药组同等浓度的DMSO的空白DMEM培养基；

模型组：含与加药组同等浓度的DMSO的含0.35％CCl₄的DMEM培养基；

阳性药组：加入水飞蓟素终浓度为20μM含0.35％CCl₄的DMEM培养基；

给药组：加入含有化合物Antcin K终浓度为20μM含0.35％CCl₄的DMEM培养基；

培养6h后，每孔加入10μL MTS溶液，避光孵育2-4h，490nm下测各孔吸光度。

以空白组为0％，对照组为100％，分别计算各组的细胞存活率及SD值，对化合物的保护作用进行评价，由吸光度值计算得到各组孔中细胞存活率。

二、实验结果。

如表1和图5所示，三萜类化合物Antcin K在20μM浓度下对0.35％CCl₄损伤的HepG2起到显著保作用，将CCl₄损伤后的细胞存活率从40％升高至90％以上。说明从皿培牛樟芝乙醇提取物中分离的化合物Antcin K(简称AK)具有显著保护急性肝损伤活性，可用于制备保护急性肝炎肝损伤药物。

表1. 20μM Antcin K对CCl₄造成的HepG2细胞急性损伤的保护作用测试

实施例3、Antcin K对CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用

一、实验材料和方法。

4-6周雄性ICR鼠购自北京大学医学部实验动物部，给予12h光照12h黑暗，恒温，正常饲料及水饲养，于无菌环境中适应4天后进行实验。

四氯化碳(阿拉丁，上海，中国)，水飞蓟素(华中海威，北京，中国)，玉米油(阿拉丁，上海，中国)，羧甲基纤维素钠(北京化工厂，北京，中国)，去离子水(Milli-Q系统制得)，多聚甲醛(雷根生物，北京，中国)，Tranzol(全式金，北京)，氯仿、乙醇、异丙醇(北京化工厂，北京)，RNA溶解液(全式金，北京)，RNase-free双蒸水，反转录试剂盒(Fermantas，美国)，Sybr-green荧光染料法定量PCR体系(艾莱德，北京)。

离心机(Thermo，美国)，全自动血生化分析仪(7170A，Hitachi，日本)。Qubit核酸/蛋白定量仪(Thermo,美国)，实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)，离心机(Thermo,美国)。

动物随机分为6组(n＝6)，1)对照组及2)模型组动物每天按10ml/kg灌胃0.3％羧甲基纤维素钠溶液，3)阳性药组每天按10ml/kg灌胃10mg/ml的水飞蓟素混悬液(混于0.3％羧甲基纤维素钠溶液)，4)AK低剂量保护组和5)AK高剂量保护组每天按10ml/kg分别灌胃1mg/ml、5mg/ml的AK混悬液(给药剂量10mg/kg、50mg/kg)，连续给药7天，第7天灌胃6h后：1)对照组腹腔注射玉米油(7ml/kg)，2)模型组、3)阳性药组、4)AK保护低剂量组和5)AK高剂量保护组腹腔注射CCl₄造模(0.2％v/v,7ml/kg,溶于玉米油)，24h 后摘眼球取血，心脏灌流后取肝组织，称重。血液样品室温静置2h后4℃8000g离心15min取血清。

血清样品进行血生化分析，检测ALT、AST指标。肝脏组织经多聚甲醛固定后进行石蜡包埋、切片、HE染色、拍照。

总RNA提取：分别剪取各动物肝脏组织20mg，剪碎后加入1ml的Tranzol，放置在冰上于匀浆器中碾磨，然后转移到无DNA酶和RNA酶的EP管中。每管加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min，然后于4℃，12000rpm条件下离心15min。将上层水相转移到新的EP管中，在得到的水相中加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置20-30min，然后于4℃，12000rpm条件下离心15min，可于管底见到白色透明胶状物质。去上清，加入1ml 75％的乙醇，涡旋后于4℃，12000rpm条件下离心5min，倒掉上层液体，室温下放置晾干。然后加入20－50μL的RNase-free双蒸水，轻轻反复吹打直至充分溶解RNA，用分光光度计检测A260/280进行RNA定量。

反转：将RNA浓度调整为一致，10或20μL体系进行反转录，具体步骤按照Fermantas反转录试剂盒说明进行操作。

实时定量PCR：QPCR引物信息如表2，按表3配置反应体系后按表4程序进行试试定量PCR实验，并收集处理数据。

表2.QPCR引物信息

表3.QPCR反应体系

表4.QPCR反应程序

二、实验结果。

实验数据计量资料均以均数±标准差表示，两均数的比较使用SPSS16.0统计软件中的one-way ANOVA分析，*p<0.05，**p<0.01与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01与空白组比较。

(1)Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用血清生化指标结果

肝细胞受损后会释放谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)入血，血清中的这两种酶浓度反应肝损伤程度。如表5和图6所示，血生化结果显示AK有明显的保护效果以及剂量依赖，显著保护了CCl₄造成的急性肝损伤。

表5.Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005与模型组比较，^###p<0.005与空白组比较。

(2)Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用HE染色结果

如图7所示，在光学显微镜下观察可见，空白组动物肝组织中肝细胞大小、形态均正常， 无肝实质性细胞病变，中央静脉及汇管区正常。模型组动物肝组织中中央静脉周围肝细胞无正常细胞形态，肝细胞肿大，部分细胞呈气球样变性，有炎症细胞浸润现象。经给药Antcin K(AK)后肝细胞坏死程度显著减轻，炎症浸润程度降低，部分细胞仍呈现气球样变性。

(3)Antcin K(AK)对CCl₄造成的急性肝损伤的保护作用qPCR结果。

本实验选择了与炎症反应相关的TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-17共4个因子进行QPCR对它们在各组动物肝脏中的转录水平进行了测试。iNOS(诱导型一氧化氮合成酶)是机体活性氮自由基产生的催化酶，其含量的高低可做为机体内炎症程度的指标，TNF-α(肿瘤坏死因子-α)是一种能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，可以促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上，从而刺激机体局部炎症反应，并激活核因子NF-κB转录从而激活下游一系列细胞凋亡因子及炎症因子表达，级联扩大炎症反应程度。IL-1β(白细胞介素-1β)、IL-17(白细胞介素17)都属于白细胞介素家族，IL-1β为一种主要由单核巨噬细胞产生的重要多肽调节因子，在细胞免疫激活中发挥调节作用，参与机体造血系统、神经、内分泌系统、机体炎症反应和某些抗肿瘤生理过程，在局部组织内持续地异常合成可导致机体发热、炎症反应。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应，IL-17与受体结合后，可通过MAPK途径和NF-κB途径发挥其生物学作用，能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而介导组织的炎症反应。

从表6和图8中可以看出这4个蛋白的基因转录水平在各组之间差异明显，模型组动物肝脏中炎症因子表达水平比空白组动物肝脏明显升高，说明CCl₄造成的急性肝损伤导致肝脏中炎症相关因子表达显著升高，从而引起炎症、凋亡等一系列损伤反应，EAC组动物肝脏中的TNF-α、iNOS、IL-1β都显著降低，AK保护后的动物肝脏中这三个因子的转录量也明显降低且与空白对照组动物肝脏水平接近，说明保肝三萜类化合物AK通过抗炎对CCl₄造成的急性肝损伤进行了保护。

表6.Antcin K(AK)保护肝脏中炎症因子转录水平QPCR结果

*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005与模型组比较，^#p<0.05，^##p<0.01与空白组比较。

实施例4、三萜类化合物Antcin K对酒精诱导HepG2脂肪沉积的保护作用

一、实验材料和方法。

酒精(北京化工)，DMEM(中科迈晨，中国)，DMSO(AppliChem)，优级胎牛血清(PAN,南非)，青霉素－链霉素细胞培养双抗(中科迈晨，中国)，MTS(Promega)，异丙醇(北京化工)，油红O粉末(Sigma)，细胞爬片(NEST)，90％甘油(北京化工)，载玻片、尖底玻璃离心管(北京玻璃厂)，总甘油三酯试剂盒(中生北控，北京)，总胆固醇试剂盒(中生北控，北京)，HepG2细胞(协和细胞库，北京)。

SpectraMax Plus 384光吸收型酶标仪(Molecular Devices，美国)，3111型细胞培养箱(Thermo，美国)、离心机(Thermo，美国)、高倍显微镜(Leica，德国)。

(1)油红O染色检测

HepG2培养于含10％FBS和1％双抗(PS)的DMEM培养基中，实验前按5×10⁴种于已经铺好细胞爬片的12孔板中，培养24h。

空白组：含10％FBS、1％PS的DMEM培养基。

对照组：含0.3％酒精、10％FBS、1％PS的DMEM培养基加入与给药组相同体积的DMSO。

给药组：含0.3％酒精、10％FBS、1％PS的DMEM培养基中加入化合物母液达到预计的最终浓度(化合物20μM)。

将原细胞培养基吸出，细胞用1mlPBS清洗两遍，每孔加入1ml相应的培养基，每组3个复孔。

细胞培养箱中培养24h，吸出细胞培养基，用PBS冲洗2次，4％多聚甲醛固定10min，ddH₂O清洗细胞2min×3次，60％异丙醇孵育10min，油红O染色30min，60％异丙醇中迅速过数次，ddH₂O中迅速过数次，苏木精染色1min，ddH₂O清洗两遍，90％甘油封片。于光学显微镜下观察并拍照。

(2)总甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)抽提检测

HepG2培养于含10％FBS和1％双抗(PS)的DMEM培养基中，实验前按2×10⁵种于6孔板中，2孔细胞合并为一个样，每组3平行样品，细胞培养24h后将培养基吸出，PBS洗2遍，加药操作同(1)。

加药后于细胞培养箱中培养24h，用PBS清洗2遍，每孔加入0.5ml胰酶消化后加入1.5ml含10％FBS、1％PS的DMEM培养基中止消化，吹打细胞至全部掉落，将孔中液体转移至 离心管中，2孔细胞合并为一管，进行细胞计数，800rpm离心3min，弃去上清，将细胞混悬于1ml PBS中。

将混悬液转移至10ml尖底玻璃离心管中，加入2:1(v/v)的氯仿/甲醇3ml，充分涡旋混匀30s/管，4℃，2000rpm，30min离心，小心移去上层水相至新的玻璃管中，转移下层有机相至另一套玻璃管中，避免吸到中间的蛋白质，在上层水相管中再加入氯仿/甲醇3ml，涡旋30s，4℃，2000rpm，30min离心，将下层有机相转移至有机管中，通风橱中N₂吹干，加入3％TritonX-100(v/v)500μL，反复吹打，恒温摇床50℃，震荡30min，使脂质溶解。

使用总甘油三酯试剂盒建立标准曲线，按说明书操作在490nm下测得各个样品的吸光度，与标准曲线对照得到各个样品的总甘油三酯含量。

二、实验结果。

牛樟芝三萜成分Antcin K对酒精诱导HepG2脂肪沉积的保护作用。

将Antcin K(20μM)按上述操作进行筛选，染色后拍照，结果如图9。油红O染色结果显示：模型组细胞内产生严重脂质沉积现象，在细胞核周围可见明显的红色脂滴，而化合物Antcin K在20μM浓度下都显著减轻了0.3％酒精诱导的HepG2脂质沉积，给药后细胞内红色脂滴显著减少，接近空白组细胞，说明牛樟芝三萜成分与牛樟芝一样具有保护酒精性脂肪肝的药理活性，具有良好的抗脂质沉积活性以及成为抗酒精性脂肪肝药物的前景。