DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板的制作方法

本发明涉及法医学
技术领域：
，具体涉及DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板。
背景技术：
：人类有22对常染色体和1对性染色体，性染色体上存在着众多的多态性DNA遗传标记，在某些特殊案件(如性侵犯罪及部分亲缘关系鉴定)中，性染色体遗传标记分析具有重要价值。Y染色体的STR基因座是Y-DNA重要遗传标记之一。由于Y染色体为连锁遗传，呈单倍型，除拟常染色区外，在减数分类时不与其他染色体发生重组，因此单个样本在大多数的Y-STR基因座只检出1个等位基因。然而，有少数Y-STR基因座可检出多个等位基因，例如DYS389基因座、DYS385基因座、DYS527基因座等。其中DYS389基因座是Y-STR中最常用基因座之一，多数市售成品化试剂盒中均含有该基因座，因此制备DYS389基因座的等位基因分型标准物具有重要的应用价值。等位基因分型标准物是指某一STR基因座在人群中常见的等位基因的混合物。等位基因分型标准物对于STR基因座的精确分型十分重要，能够对不同实验室因为仪器和检测条件不同而对同一等位基因检测出不同大小的片段进行校正，是STR基因座分型的标准。DYS389基因座的重复结构比较复杂，依次包含区段一、连接序列和区段二，其中连接序列的大小为48bp。区段一的5’端和区段二的5’端均有一段相同的序列，所以采用一个引物对即可PCR扩增出两个长度不同的DNA片段，从而将DYS389基因座分成DYS389I和DYS389II两个基因座(见图1，记载与如下文献中：JohnM.Butler，AdvancedTopicsinForensicDNATyping:Methodology.AcademicPress.2011.)。制备等位基因分型标准物，需要筛选含有不同等位基因分型的血卡样本，而DYS389基因座上两扩增片段的长度不同且二者存在包含关系，以及不同血卡样本的差异使得扩增后随机出现两个不同峰高的扩增片段，难以根据两扩增片段的峰高调平，不能满足等位基因分型标准物平整度的要求。因此，迫切需要制备DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何制备DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板。所述DYS389基因座可分成DYS389I和DYS389II两个基因座。为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种DNA组合物，该DNA组合物可作为DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板，所述DNA组合物可含有DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4、DNA片段5、DNA片段6、DNA片段7、DNA片段8、DNA片段9、DNA片段10、DNA片段11、DNA片段12、DNA片段13、DNA片段14、DNA片段15、DNA片段16和DNA片段17。所述DNA片段1的核苷酸序列可如序列表中的序列1所示。所述DNA片段2的核苷酸序列可如序列表中的序列2所示。所述DNA片段3的核苷酸序列可如序列表中的序列3所示。所述DNA片段4的核苷酸序列可如序列表中的序列4所示。所述DNA片段5的核苷酸序列可如序列表中的序列5所示。所述DNA片段6的核苷酸序列可如序列表中的序列6所示。所述DNA片段7的核苷酸序列可如序列表中的序列7所示。所述DNA片段8的核苷酸序列可如序列表中的序列8所示。所述DNA片段9的核苷酸序列可如序列表中的序列9所示。所述DNA片段10的核苷酸序列可如序列表中的序列10所示。所述DNA片段11的核苷酸序列可如序列表中的序列11所示。所述DNA片段12的核苷酸序列可如序列表中的序列12所示。所述DNA片段13的核苷酸序列可如序列表中的序列13所示。所述DNA片段14的核苷酸序列可如序列表中的序列14所示。所述DNA片段15的核苷酸序列可如序列表中的序列15所示。所述DNA片段16的核苷酸序列可如序列表中的序列16所示。所述DNA片段17的核苷酸序列可如序列表中的序列17所示。所述DNA组合物具体可由所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17组成。所述DNA组合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17的质量比可为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述DNA组合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17的质量比具体可为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。为解决上述技术问题，本发明还提供了重组质粒组合物，所述重组质粒组合物也可作为DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板。本发明所提供的重组质粒组合物，具体可为重组质粒组合物1，其可包括重组质粒组合物甲和重组质粒组合物乙。所述重组质粒组合物甲可通过如下方法制备的：将所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5和所述DNA片段6分别插入到6个载体中，得到6个重组载体；将所述6个重组载体混合，得到重组质粒组合物甲。所述重组质粒组合物乙是通过如下方法制备的：将所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17分别插入到11个载体中，得到11个重组载体；将所述11个重组载体混合，得到重组质粒组合物乙。所述重组质粒组合物1中，所述6个重组载体的质量比可为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重组质粒组合物1中，所述6个重组载体的质量比可为1：1：1：1：1：1。所述重组质粒组合物1中，所述11个重组载体的质量比可为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重组质粒组合物1中，所述11个重组载体的质量比可为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。本发明所提供的重组质粒组合物，具体可为重组质粒组合物2。所述重组质粒组合物2是通过如下方法制备的：将所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17分别插入到17个载体中，得到17个重组载体；将所述17个重组载体组合，得到重组质粒组合物2。所述重组质粒组合物2中，所述17个重组载体的质量比可为1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。所述重组质粒组合物2中，所述17个重组载体的质量比可为1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。上述重组质粒混合物中，所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17可以分别插入到同一个载体中，也可以分别插入到不同的载体中。进一步，可以插入到载体的相同位置，也可以分别插入载体的不同位置。所述载体为克隆载体。所述克隆载体可为T载体。所述T载体具体可为质粒pMD18-T。所述重组载体具体可为将质粒pMD18-T和DNA片段(所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16或所述DNA片段17)连接，得到重组载体。上述任一所述的DNA组合物或上述任一所述的重组质粒组合物在a1)或a2)或a3)中的应用也属于本发明的保护范围：a1)作为DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板；a2)制备DYS389基因座的等位基因分型标准物；a3)检测DYS389基因座的等位基因分型。上述a2)中，制备DYS389基因座的等位基因分型标准物的步骤可为：以上述任一所述的DNA组合物或上述任一所述的重组质粒组合物为模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物即为DYS389基因座的等位基因分型标准物。上述a3)中，检测DYS389基因座的等位基因分型的步骤具体可如下：(1)以上述任一所述的DNA组合物或上述任一所述的重组质粒组合物为模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；(2)完成步骤(1)后，向去离子甲酰胺中加入所述PCR扩增产物和内标，然后用去离子甲酰胺定容，得到反应液；(3)完成步骤(2)后，取所述反应液进行变性，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到DNA检测图谱。所述步骤(2)中，所述内标可为公安部物证鉴定中心生产的Typer500内标。所述步骤(3)中，所述“变性”的反应程序为：先95℃5min，然后迅速转移至-20℃放置5min。上文中，所述DYS389基因座可分成DYS389I和DYS389II两个基因座。上文中，所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16和所述DNA片段17均含有连接序列2：5’-TCTCTTACTATCATGCCATCCTTAAGATTCTTTTCTGTAACTCATAAT-3’。所述连接序列2的核苷酸排列方式对制备DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板、制备DYS389基因座的等位基因分型标准物或检测DYS389基因座的等位基因分型具有重要的意义。本发明将DYS389基因座内区段一和区段二之间的连接序列1：5’-TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA-3’优化为所述连接序列2，然后分别合成DYS389I和DYS389II的各等位基因，调整各等位基因的加入量，从而保证DYS389基因座等位基因分型标准物中各等位基因的量的平衡。实验证明，利用本发明提供的模板可扩增获得DYS389基因座的等位基因分型标准物，并可在多种商业试剂盒中使用，具有重要的应用价值。附图说明图1为DYS389I和DYS389II基因座示意图。图2实施例1步骤三混合液甲和混合液乙的DNA检测图谱。图3为实施例1步骤三9948人类基因组DNA的DNA检测图谱。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。Nanodrop1000微量分光光度计为AppliedBiosystems产品。9948人类基因组DNA为Promaga公司产品。质粒pMD18-T为TaKaRa公司产品，产品目录号为6011。内标为Typer500内标，公安部物证鉴定中心产品。去离子甲酰胺为ABI公司产品，产品目录号为4311320。ABI3130xl遗传分析仪为ABI公司产品。实施例1、DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板的制备和验证一、重组质粒的获得1、连接序列的优化hg19人类基因组(hg19人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/hg19.2bit)内，DYS389基因座中含有连接序列1所示的DNA片段，连接序列1：5’-TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA-3’。经过大量实验，将连接序列1优化为连接序列2：5’-TCTCTTACTATCATGCCATCCTTAAGATTCTTTTCTGTAACTCATAAT-3’。经软件OligoAnalyzer3.1评估，连接序列1和连接序列2的基本特征见表1。表1碱基数目(bp)GC含量(％)解链温度(℃)连接序列14831.260.4连接序列24831.261.52、重组质粒的获得(1)人工合成DNA片段1－DNA片段6，DNA片段1－DNA片段6的核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6所示。(2)根据步骤1优化的连接序列2的核苷酸序列，人工合成DNA片段7－DNA片段17。DNA片段7－DNA片段17的核苷酸序列依次为序列表中的序列7、序列8、序列9、序列10、序列11、序列12、序列13、序列14、序列15、序列16和序列17所示。(3)制备表2所示的17个重组质粒，包含DYS389I基因座以及DYS389II基因座，共17个等位基因。根据测序结果，各重组质粒的详细信息如下：重组质粒DYS389I-10：将DNA片段1和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-10；DNA片段1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；重组质粒DYS389I-11：将DNA片段2和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-11；DNA片段2的核苷酸序列如序列表中序列2所示；重组质粒DYS389I-12：将DNA片段3和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-12；DNA片段3的核苷酸序列如序列表中序列3所示；重组质粒DYS389I-13：将DNA片段4和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-13；DNA片段4的核苷酸序列如序列表中序列4所示；重组质粒DYS389I-14：将DNA片段5和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-14；DNA片段5的核苷酸序列如序列表中序列5所示；重组质粒DYS389I-15：将DNA片段6和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-15；DNA片段6的核苷酸序列如序列表中序列6所示；重组质粒DYS389II-24：将DNA片段7和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-24；DNA片段7的核苷酸序列如序列表中序列7所示；重组质粒DYS389II-25：将DNA片段8和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-25；DNA片段8的核苷酸序列如序列表中序列8所示；重组质粒DYS389II-26：将DNA片段9和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-26；DNA片段9的核苷酸序列如序列表中序列9所示；重组质粒DYS389II-27：将DNA片段10和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-27；DNA片段10的核苷酸序列如序列表中序列10所示；重组质粒DYS389II-28：将DNA片段11和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-28；DNA片段11的核苷酸序列如序列表中序列11所示；重组质粒DYS389II-29：将DNA片段12和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389I-29；DNA片段12的核苷酸序列如序列表中序列12所示；重组质粒DYS389II-30：将DNA片段13和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389II-30；DNA片段13的核苷酸序列如序列表中序列13所示；重组质粒DYS389II-31：将DNA片段14和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389II-31；DNA片段14的核苷酸序列如序列表中序列14所示；重组质粒DYS389II-32：将DNA片段15和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389II-32；DNA片段15的核苷酸序列如序列表中序列15所示；重组质粒DYS389II-33：将DNA片段16和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389II-33；DNA片段16的核苷酸序列如序列表中序列17所示；重组质粒DYS389II-34：将DNA片段17和质粒pMD18-T连接，得到重组质粒DYS389II-34；DNA片段17的核苷酸序列如序列表中序列17所示。表2编号基因座基因型重组质粒名称编号基因座基因型重组质粒名称1DYS389I10重组质粒DYS389I-109DYS389II26重组质粒DYS389II-262DYS389I11重组质粒DYS389I-1110DYS389II27重组质粒DYS389II-273DYS389I12重组质粒DYS389I-1211DYS389II28重组质粒DYS389II-284DYS389I13重组质粒DYS389I-1312DYS389II29重组质粒DYS389II-295DYS389I14重组质粒DYS389I-1413DYS389II30重组质粒DYS389II-306DYS389I15重组质粒DYS389I-1514DYS389II31重组质粒DYS389II-317DYS389II24重组质粒DYS389II-2415DYS389II32重组质粒DYS389II-328DYS389II25重组质粒DYS389II-2516DYS389II33重组质粒DYS389II-3317DYS389II34重组质粒DYS389II-34二、DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板制备1、利用Nanodrop1000微量分光光度计分别测量并稀释步骤一中获得的重组质粒DNA的浓度至1ng/μL，获得各质粒的稀释液。2、完成步骤1后，取重组质粒DYS389I-10的稀释液、重组质粒DYS389I-11的稀释液、重组质粒DYS389I-12的稀释液、重组质粒DYS389I-13的稀释液、重组质粒DYS389I-14的稀释液和重组质粒DYS389I-15的稀释液各1μL，混合，然后用超纯水定容至1mL，得到混合液甲。混合液甲中，步骤一中DYS389I基因座的各个等位基因的DNA浓度均为1pg/μL。3、完成步骤1后，取重组质粒DYS389II-24的稀释液、重组质粒DYS389II-25的稀释液、重组质粒DYS389II-26的稀释液、重组质粒DYS389II-27的稀释液、重组质粒DYS389II-28的稀释液、重组质粒DYS389II-29的稀释液、重组质粒DYS389II-30的稀释液、重组质粒DYS389II-31的稀释液、重组质粒DYS389II-32的稀释液、重组质粒DYS389II-33的稀释液和重组质粒DYS389II-34的稀释液各1μL，混合，然后用超纯水定容至1mL，得到混合液乙。混合液乙中，步骤一中DYS389II基因座的各个等位基因的DNA浓度均为1pg/μL。DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板由混合液甲和混合液乙组成。三、DYS389基因座的等位基因分型标准物的验证(1)以步骤二制备的混合液甲为DNA模板，以5’-FAM-CTTCTGTATCCAACTCTCATCTG-3’(5’末端进行FAM修饰)和5’-GTTGAGGAACACAATTATCCCTGA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。(2)完成步骤(1)后，向去离子甲酰胺中加入1μLPCR扩增产物和0.2μL内标，然后用去离子甲酰胺定容至20μL，得到反应液。(3)完成步骤(2)后，取反应液，95℃变性5min，迅速转移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遗传分析仪进行毛细管电泳检测，得到DNA检测图谱。电泳条件为：进样电压2kV，进样时间为18s。按照上述步骤，将步骤(1)中的混合液甲替换为混合液乙，其它步骤均不变，得到相应的DNA检测图谱。按照上述步骤，将步骤(1)中的混合液甲替换为9948人类基因组DNA，其它步骤均不变，得到相应的DNA检测图谱。实验结果见图2和图3(图2中A为混合液甲，图2中B为混合液乙，图3为9948人类基因组DNA)。上述实验结果表明，DYS389基因座内各等位基因分型完整、正确，峰型尖锐清晰，无杂峰，等位基因间峰高差异小于20％，均衡性良好；9948人类基因组DNA的结果表明，经过等位基因分型标准物校准后分型结果正确、峰型良好、无杂峰，能够保证法医DNA分析结果的有效性和可靠性，同时确保实验室DNA分析结果的可比性和一致性。上述结果表明，使用步骤二制备的DYS389基因座的等位基因分型标准物的模板可进行DYS389基因座的等位基因分型检测。当前第1页1 2 3