一种以秸秆为碳源的复合丝状真菌生物沥浸处理重金属污染土壤的方法与流程

本发明属于环境工程技术领域，涉及一种以秸秆为碳源的复合丝状真菌生物沥浸处理重金属污染土壤的方法，具体而言是一种利用pH适应区间广、重金属抗性强，以农业废弃物秸秆作为生长碳源，产生多种小分子有机酸的复合丝状真菌(简青霉和黑曲霉)高效、低耗的脱除土壤中重金属的方法。

背景技术：

高速的工业化、城镇化和农业集约化导致土壤重金属污染日趋严重。据农业部的测算，目前我国受Pb、Cd、Cu等重金属污染的耕地面积达1000万公顷，中国环境监测总站的调查则已接近2000万公顷，每年被重金属污染的粮食达1200万吨，这对农产品安全和生态系统健康构成了极大的威胁。由于土壤重金属污染的特异性及地域的复杂性，其治理不仅见效慢、费用高，而且还受多种因素的制约。因此，治理重金属污染土壤一直是国际上研究的热点与难点问题，也是我国农业可持续发展和环境质量改善中许多学科共同感兴趣的问题。

生物沥浸是近20年来兴起的一种清除土壤中重金属的新方法。其原理为：利用某些极端嗜酸菌(主要是一类以CO₂为生长碳源、专性化能自养型的细菌，例如：氧化亚铁硫杆菌Thiobacillus ferrooxidans、氧化硫硫杆菌Thiobacillus thiooxidans、排硫硫杆菌Thiobacillus thioparus)的生物氧化、酸化作用而产生的低pH，促使土壤固相中不溶形态的重金属溶入液相，固液分离后，重金属得以脱除。该方法简单易行、经济性高，尤其适用于多种重金属元素引起的复合、重度污染土壤的处理(例如：采矿区、废弃物堆放场的周边土壤)，引起了科学家的高度重视。当前，该技术正处于由实验室研究向现场实施的转化阶段，国外已有小试工程报道。

从已有的研究实践来看，基于嗜酸性自养型细菌为优势菌的土壤重金属生物沥浸处理大多耗时较长(25-30天)，效果也不稳定，特别是长期连续运行工况条件下，菌种的活性有时会降低。这是因为：1)自养菌的生长速率普遍缓慢；2)这些菌种更适宜于pH 1.0-3.0的酸性环境下生长，将它们接种到土壤(多数为中性、偏碱)，需要一个pH适应的生长延滞期；3)自养菌对有机物都有一定的敏感性，而土壤中溶解性有机质(Dissolved organic matters，DOM)的含量时常会超出它们的致毒水平。

为了提高土壤重金属生物沥浸的效率和稳定性，近期，有研究者提出了利用某些生长速度快、pH适应范围广、重金属抗性强，且能代谢有机碳产生小分子有机酸(如柠檬酸)的异养型丝状真菌，例如：木霉Trichoderma sp.、踝节霉Talaromyces sp.、黑曲霉Aspergillus niger，进行土壤重金属生物沥浸的技术方案。该方法能在一定程度上克服嗜酸性自养型细菌生物沥浸土壤重金属的技术缺陷。现有的有关丝状真菌生物沥浸土壤重金属的研究主要是基于以单一丝状真菌为优势菌和大量外源投加蔗糖、葡萄糖、淀粉等商品化碳源(土壤DOM碳含量不足以能维系丝状真菌的生长需求)的条件下开展的。然而，由于单一菌的产酸类型相对单一以及最大产酸能力有限(大多情况下仅能将土壤pH降低至pH3.5左右)，故常常无法保证生物沥浸处理后土壤中不同种类和形态的重金属均能及时、有效的去除(例如Pb、Cd、Ni的有效去除一般要求pH<2.5)。此外，大量添加商品化的有机碳源也存在处理成本过高的弊端。因此，合理的配伍具有不同产酸特征的丝状真菌，发挥复合菌产酸谱系宽(多种有机酸)和产酸效能高的特性，同时尝试以某些含碳量高的农业废弃物(如秸秆)充当微生物生长的碳源(替代蔗糖等)，则可以显著提高丝状真菌生物沥浸处理重金属污染土壤的技术和经济可行性。

技术实现要素：

1、发明目的

本发明的目的在于提供一种在土壤介质中生长迅速、重金属抗性强、且能利用农业废弃物秸秆作为生长碳源，大量产生柠檬酸、葡萄糖酸、草酸等多种小分子有机酸的复合丝状真菌(菌株NAU-12和A80)脱除土壤重金属的方法。

2、技术方案

一株丝状真菌菌株NAU-12，分类命名为简青霉(Penicillium simplicissimum)，于2015年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.10990。简青霉(Penicillium simplicissimum)菌株NAU-12具有以下生物学特性：在马铃薯PDA平板上繁殖迅速，28℃下生长4天，菌落直径25mm，菌落中间有凸起，有规则的辐射状沟纹；外观呈灰绿色，质地为丝绒状；大量分生孢子结构，分生孢子头为球形，直径150-300μm；在pH 3.0-8.0下均可生长，对Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺有较强的抗性，耐受浓度分别为200mg/L、300mg/L、100mg/L、1000mg/L；能利用碱热预处理的秸秆为碳源生长，主要产葡萄糖酸和草酸(12天产酸量分别为56mM和42mM)，兼有少量柠檬酸。

一株丝状真菌菌株A80，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，于2011年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC NO.4533。黑曲霉(Aspergillus niger)菌株A80具有以下生物学特性：在马铃薯PDA平板上繁殖迅速，28℃下生长4天，菌落直径60mm，菌落中间有凸起，有规则的辐射状沟纹，外观呈褐黑色，质地为丝绒状；大量分生孢子结构，分生孢子头为球形，直径300-500μm；在pH 2.5-7.0下均可生长，对Zn²⁺、Cu²⁺、Cd²⁺、Pb²⁺有较强的抗性，耐受浓度分别为300mg/L、200mg/L、50mg/L、1500mg/L；能利用碱热预处理的秸秆为碳源生长，主要产柠檬酸(15天产酸量为68mM)，兼有少量苹果酸和草酸。

本发明所述的丝状真菌菌株NAU-12在处理重金属污染土壤的应用。

一种复合丝状真菌菌剂，该菌剂是由含有1-2×10⁸孢子/mL的简青霉NAU-12菌剂和含有1-2×10⁷孢子/mL的黑曲霉A80菌剂等体积混合而成的菌剂。

所述的复合丝状真菌菌剂的制备方法，步骤如下：挑取NAU-12菌体，接入液体生长培养基，25-35℃，振荡培养5-7天；挑取A80菌体,接入液体生长培养基，25-35℃，振荡培养4-6天；培养结束后，按体积比1:1将两个培养物混合，得到复合菌剂。

本发明所述的复合丝状真菌菌剂在处理重金属污染土壤的应用。

本发明所述的以秸秆为碳源的复合丝状真菌生物沥浸处理重金属污染土壤的方法，步骤如下：

步骤(1)、制备接种用复合丝状菌剂：挑取NAU-12菌体，接入液体生长培养基，25-35℃，振荡培养5-7天；挑取A80菌体,接入液体生长培养基，25-35℃，振荡培养4-6天；培养结束后，按体积比1:1将两个培养物混合，得到复合丝状真菌菌剂；

步骤(2)、制备碳源：将秸秆粉碎至1-1.5cm，置于0.5-1.5％的NaOH溶液、80-100℃下浸泡1-2h进行碱热预处理；

步骤(3)、处理重金属污染土壤：用水将重金属土壤稀释，制成泥浆浓度1-5％的土壤泥浆，投入反应器，添加40-80g/L经碱热预处理的秸秆或蔗糖作为碳源，添加1-3g/L酵母膏，按处理泥浆体积的5-10％接种复合丝状真菌菌剂，在25-35℃、好气、120-150r/min转速下搅拌处理15-20天，泵出处理后的土壤泥浆；

步骤(4)、固液分离：经步骤(3)处理的土壤泥浆进行土-水固液分离，得到土壤泥浆沉淀和含重金属离子的清液；

步骤(5)、中和沉淀：向含重金属的清液中加碱使重金属离子沉淀；用生石灰中和土壤泥浆沉淀。

步骤(1)中，所述的液体生长培养基为：NaNO₃ 1.5g/L、K₂HPO₄ 0.5g/L，KCl 0.025g/L，MgSO₄ 0.025g/L，酵母膏1.5g/L，蔗糖，35g/L，pH自然，灭菌。

振荡培养的转速为120-150r/min。

步骤(2)中，所述的秸秆为风干的小麦或水稻秸秆，秸秆的总固体含量>90％。

步骤(3)中，优选采用经碱热预处理的秸秆作为碳源。经碱热预处理的秸秆的添加量优选为50-70g/L，酵母膏的添加量优选为1-2g/L。本发明中，添加量以秸秆或酵母膏的质量和土壤泥浆的体积比计，土壤泥浆的体积等于水的体积。

步骤(5)中，所述的碱性物为氧化镁、生石灰或氢氧化钠。

本发明所述的重金属包括Pb、Zn、Cd、Cu、Ni、Mn等。

3、有益效果

本发明的丝状真菌菌株简青霉Penicillium simplicissimumNAU-12和黑曲霉Aspergillus niger A80均无致病性，对人和动物安全。采用本发明利用碱热预处理的农业废弃物秸秆作为生长碳源并且产生多种小分子有机酸的复合丝状真菌生物沥浸处理重金属污染土壤，弥补了现有技术使用单一菌种重金属去除效率低的不足和投加商品化碳源成本高的弊端。本处理技术在常温常压下进行，反应设备少、能耗低，易于放大规模后的实际应用。

附图说明

图1为简青霉NAU-12在PDA平板上的菌落形态。

图2为简青霉NAU-12在纯培养过程中小分子有机酸的产生动态。

图3为黑曲霉A80在PDA平板上的菌落形态。

图4为黑曲霉A80在纯培养过程中小分子有机酸的产生动态。

生物材料保藏信息

NAU-12，分类命名为简青霉(Penicillium simplicissimum)，于2015年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.10990。

A80，分类命名为黑曲霉(Aspergillus niger)，于2011年1月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.4533。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1Penicillium simplicissimum NAU-12和Aspergillus niger A80的分离与培养：

称取10g采自安徽铜陵某铜矿厂区土壤，倒入装有一定体积无菌水的三角瓶中，28℃、120r/min转速下，振荡培养1d后，从三角瓶中吸取2mL菌悬液涂布在固体生长培养基(NaNO₃：1.5g/L，K₂HPO₄：0.5g/L、KCl：0.025g/L，MgSO₄：0.025g/L，酵母膏：1.5g/L，蔗糖：35g/L，琼脂：20g/L)，28℃恒温培养4天。挑取菌丝发达的疑似菌株划线于含3％溴甲酚绿(产酸指示剂)的固体生长培养基上，显色完全后，挑选菌落周围黄色透明圈较大的菌落，划线分离2次，得到两株纯化菌株，分别命名为NAU-12、A80。参照《真菌鉴定手册》和《中国真菌志》，初步鉴定菌株NAU-12和A80分别为青霉属和曲霉属。采用真菌DNA试剂盒，分别提取NAU-12和A80的DNA，PCR扩增18S rDNA-ITS序列，通过rDNA-ITS基因测序以及与NCBI数据库BLAST同源性比对，最终鉴定NAU-12和A80分别为简青霉和黑曲霉。

采用液体生长培养基对菌株NAU-12和A80分别进行扩大培养：

从斜面挑取简青霉NAU-12菌体，接入液体生长培养基，25-35℃下，120-150r/min振荡培养5-7天，获得菌密度为10⁸孢子/mL的NAU-12菌剂。采用高效液相色谱对扩大培养过程中菌株NAU-12的产酸类型和产酸量进行检测，如图2，发现，其主要产生葡萄糖酸和草酸(12天的产酸量分别为56mM和42mM)，兼有少量柠檬酸(12天的产量为8mM)。

从斜面挑取黑曲霉A80菌体，接入液体生长培养基，25-35℃下，120-150r/min振荡培养4-6天，获得菌密度为10⁷孢子/mL的A80菌剂。采用高效液相色谱对扩大培养过程中菌株A80的产酸类型和产酸量进行检测，如图4，发现，其主要产柠檬酸(15天的产酸量为68mM)，兼有少量苹果酸和草酸(15天的产酸量分别为3mM和7mM)。

所述的液体生长培养基为：NaNO₃ 1.5g/L，K₂HPO₄ 0.5g/L，KCl 0.025g/L，MgSO₄0.025g/L，酵母膏1.5g/L，蔗糖35g/L，pH自然，灭菌。

实施例2处理单一重金属Cu污染土壤

复合丝状真菌生物沥浸处理Cu污染土壤的方法，步骤如下：

步骤(1)、制备菌剂：按实施例1的方法，分别获得菌密度为10⁸孢子/mL的NAU-12和10⁷孢子/mL的A80菌剂，按体积比1:1混合，得到用于接种的复合菌剂；

步骤(2)、制备小麦秸秆碳源：将风干的小麦秸秆(总固体含量92.5％)机械粉碎至1cm，置于1.5％的NaOH溶液、80℃下浸泡2h进行碱热预处理，备用；

步骤(3)、土壤Cu的生物脱除：土样采自安徽铜陵某铜矿区土壤，该土样为黄红壤，土壤pH值为6.22。经检测，该土样主要受单一Cu污染，Cu含量达1098mg/kg。

取2g的Cu污染土壤，加水200mL稀释，将制成的土壤泥浆投入三角瓶中，添加10g碱热预处理后的麦秸(作为碳源)和0.3g酵母膏，然后接种12mL复合菌剂。

另外，设置了四个对照处理组：a.不接任何菌剂；b.只接种12mL简青霉NAU-12菌剂；c.只接种12mL黑曲霉A80菌剂；d.接种12mL复合丝状菌剂但以10g蔗糖替代麦秸作为碳源。

随后，将上述不同处理置于30℃、150r/min回旋振荡器，好气培养15d。监测第15d土壤泥浆的pH值，接种复合丝状菌剂以麦秸作为碳源的土壤泥浆pH降至2.46，接种复合丝状菌剂以蔗糖作为碳源的土壤泥浆pH降至2.42左右，而单一接种简青霉NAU-12菌剂或黑曲霉A80菌剂的土壤泥浆pH降至3.52。

步骤(4)、将处理后的土壤泥浆倒出，3000r/min离心15min、滤纸过滤，得到含Cu²⁺滤液和土壤泥浆沉淀。

步骤(5)、向含Cu²⁺滤液中投入NaOH调节pH至8.0，使Cu²⁺转为Cu(OH)₂沉淀，废水排放；向土壤泥浆沉淀中加入生石灰调节pH至6.0，烘干样品，采用HCl-HNO₃-HClO₄消解、电感耦合等离子体发射光谱检测土样中残留Cu的含量(见表1)。依据处理前后土壤Cu含量的差值，计算Cu的去除率。经计算，接种复合菌剂的两组处理(以麦秸或以蔗糖作为碳源)的Cu去除率相近(82-83％)，均可达到我国土壤环境质量标准(GB15618-1995)，且明显高于接种单一NAU-12或A80处理的Cu去除率。

表1不同处理前后土壤中Cu含量的变化

实施例3处理复合重金属Pb-Zn-Cd污染土壤

复合丝状真菌生物沥浸处理复合重金属Pb-Zn-Cd污染土壤的方法，步骤如下：

步骤(1)、制备菌剂：同实施例2；

步骤(2)、制备水稻秸秆碳源：将风干的水稻秸秆(总固体含量90.2％)机械粉碎至1cm，置于1％的NaOH溶液、100℃下浸泡1.5h进行碱热预处理，备用；

步骤(3)、土壤中Zn、Pb和Cd的生物脱除：土样采自江西德兴某铅锌矿厂周边污染土壤，该土样为第四纪红壤，pH值为5.7。经检测，该土样中Zn、Pb和Cd含量分别为1520mg/kg、570mg/kg和28mg/kg，超出国家土壤环境质量标准(GB15618-1995)。

取250g的Pb-Zn-Cd复合污染土壤，加10L水稀释，将制成的土壤泥浆投入反应器中，添加700g稻秸(作为碳源)和15g酵母膏，然后，接种复合菌剂1L。参照实施例2，设置四个对照组：a.不接任何菌剂，b.只接种1L简青霉NAU-12菌剂，c.只接种1L黑曲霉A80菌剂，d.接种1L复合丝状菌剂但以700g蔗糖替代麦秸作为碳源。

随后，将各组处理的反应器在30℃和150r/min条件下，好氧搅拌处理20d。监测第20d土壤泥浆的pH值，接种复合丝状菌剂以麦秸作为碳源的土壤泥浆pH降至2.4左右，接种复合丝状菌剂以蔗糖作为碳源的土壤泥浆pH降至在2.5左右，而单一接种简青霉NAU-12菌剂或黑曲霉A80菌剂的土壤泥浆pH降至3.5左右。

步骤(4)、将处理后的土壤泥浆倒出，3000r/min离心15min、过滤，得到含Zn²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺的滤液和脱除了重金属的土壤泥浆沉淀。

步骤(5)、向含Zn²⁺、Pb²⁺和Cd²⁺的滤液中投加MgO调节pH至7.5，将重金属转化为氢氧化物沉淀，废水排放；向土壤泥浆沉淀物中加入生石灰调节pH至6.0，随后将样品烘干，用HCl-HNO₃-HClO₄消解，电感耦合等离子体发射光谱测定土样中残留Zn、Pb和Cd的含量(见表2)。依据处理前后土样中重金属含量的差值，计算重金属的去除率。经计算，接种复合菌剂的两组处理(以稻秸或以蔗糖作为碳源)的Zn、Pb和Cd去除率相差不大，分别为83-85％、40-45％和93-95％，均能达到我国土壤环境质量标准(GB15618-1995)，且明显高于接种单一NAU-12或A80处理的Cu去除率。

表2不同处理前后土壤中Zn、Pb和Cd含量的变化