丝氨酸蛋白酶抑制剂‑3及其功能、制备方法和应用与流程

文档序号:12162362阅读:来源:国知局

技术特征:

1.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3,其特征在于:氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3,其特征在于:成熟肽的氨基酸及核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段,其特征在于:包含SEQ ID NO:1所示的序列或全序或片段;优选:Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-组氨酸标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-His6标签氨基酸序列、Met-His6标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-His6标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-His6标签氨基酸序列、Met-GST标签-凝血酶酶切位点-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-凝血酶酶切位点-GST标签氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3成熟肽氨基酸序列、Met-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列-Flag标签氨基酸序列、Met-Flag标签-丝氨酸蛋白酶抑制剂-3全序列氨基酸序列。

4.如权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3的制备方法,其特征在于:利用鳞翅目天蚕蛾科昆虫的血淋巴,以昆虫血液或血细胞裂解物和淋巴液的混合物或/和昆虫压榨或匀浆的体液作为分离纯化的原料液;该原料液经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂-3;再通过离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤分离纯化方法中的两个或多个的组合以及其分离纯化方法顺序的重排组合,分离纯化获得纯度达到电泳纯乃至HPLC纯度的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3。

5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的离子交换层析、疏水层析、亲和层析、凝胶过滤、盐析或超滤方法中(1)操作温度在0℃-45℃,优选0℃-10℃;(2)溶液的酸碱度在pH2-pH10,优选pH4-pH9;(3)调节溶液酸碱度的试剂为是常规、通用的酸、碱、酸溶液或碱溶液,酸或酸溶液优选HCl、HAc、磷酸、柠檬酸、硫酸、硼酸或它们的溶液,碱或碱溶液优选NaOH、KOH、Tris、柠檬酸钠或钾盐、磷酸钠或钾盐、硼砂或它们的溶液;(4)缓冲液是常规、通用缓冲离子对缓冲液,优选柠檬酸根缓冲离子对、HCl-Tris缓冲离子对、柠檬酸根-磷酸根缓冲离子对、磷酸根缓冲离子对、醋酸根缓冲离子对、硼酸根缓冲离子对、硼酸-Tris缓冲离子对或上述各缓冲离子的组合;(5)溶液或缓冲液的离子强度在0.001mol/L-0.5mol/L,优选0.01mol/L-0.1mol/L。

6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述的鳞翅目天蚕蛾科昆虫,选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕,所述的昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。

7.权利要求1所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3及其类似物或活性片段的重组表达产物的基因表达方法,其特征在于,它包括(1)利用基因工程技术表达丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段(2)从上述表达体系中分离纯化重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段,(3)上述表达产物经过单独的离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物活性组分,(4)上述表达产物通过离子交换层析或疏水层析或亲和层析或凝胶过滤或盐析或超滤分离纯化方法中两个或几个分离纯化方法的组合以及分离纯化方法顺序的重排组合获得电泳纯至HPLC纯度的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段。

8.如权利要求7所述的基因表达方法,其特征在于,所述的基因表达体系包括(1)原核生物系统的表达载体,表达宿主细胞为大肠杆菌细胞或枯草杆菌细胞,(2)酵母细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为酵母细胞,(3)昆虫细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为昆虫细胞,(4)哺乳动物细胞系统的表达载体,表达宿主细胞为哺乳动物细胞;上述表达形式为细胞内表达或分泌形式表达,上述表达体系中的表达产物作为制备重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的来源。

9.权利要求1或2所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的抗体,其特征在于,以丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段作为抗原。

10.权利要求1或2所述的天然丝氨酸蛋白酶抑制剂-3或权利要求3所述的重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物的生物学功能,所述的功能为:(1)抑制丝氨酸蛋白酶的活性,(2)抑制昆虫多种抗菌肽的合成,(3)抑制酚氧化酶原系统,(4)抑制鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫的免疫防御系统,提高鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫的抗微生物能力的应用,(5)制备肿瘤、胃炎、胰腺炎、癌症等疾病药物的应用。

11.权利要求所述的丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段作为抗原所产生抗体的应用,所述的应用为:(1)丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3、重组丝氨酸蛋白酶抑制剂-3类似物或活性片段的检测与追踪,(2)促进昆虫多种抗菌肽的表达,提高抗菌肽在医药领域的应用,(3)所述的抗体在特异性识别结合并屏蔽抗原中的应用。

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