本发明属于木质纤维素资源化利用和白腐菌规模化培养
技术领域：
，具体地涉及一种半固体培养基及其制备方法，尤其是涉及一种可快速测定白腐菌生长周期内各项监测指标的半固体培养基及其制备方法。
背景技术：
：菌类微生物在培养基培养周期内的各项生长指标的监测体系的建立有着极其重要的意义。在培养周期内各项指标监测体系的建立可以方便、快速的了解微生物的生长状况，并对有利因素或不利因素进行及时响应，调整培养工艺，可增加微生物培养成功率并减少工艺成本，对菌类微生物的工业化培养意义重大。固体培养基和液体培养基培养周期内的各项指标监测的确立有着其天然的优势和不可避免的缺陷。固体培养基即在一般培养温度下呈固体状态的培养基。固体培养基可大体分为两类，一类是用天然的固体状物质为原料，如马铃薯块、麸皮、米糠等常用于酒精厂、酿造厂的微生物培养过程中；另一类是在液体培养基中加入凝固剂而制成，如实验室中常用的琼脂固体斜面和固体平面培养基。这种培养基广泛用于微生物的分离、鉴定、保藏、计数及群落特征的观察等。液体培养基与固体培养基相对应，是微生物或动植物细胞的液状培养基。液体培养基具有可同时进行通气培养和振荡培养的优点。此外，液体培养基可消除在静止时在菌体或培养细胞的周围形成的阻碍透过养分的壁障，增加供氧量，有利于细胞的生长和提高产量。液体培养基因营养物质分布均匀，与菌体表面接触充分，还能大量溶解微生物的代谢产物等优点，广泛用于微生物的生理、代谢研究以及大规模的工业化生产中。传统固体培养基和液体培养基在培养周期内的各项指标监测体系的建立存在一定的缺陷。固体培养基对生长过程中的计数、群落特征的观察以及固质指标的响应更加敏感，只需进行简单地处理就可快速监测；但是对液质类指标如菌类微生物产酶特性的监测响应缓慢，必须经过反复的溶剂溶解等预处理才能进行测定，溶解过程中还需面对操作误差增大的情况。反之，液体培养基在对固质类指标的检测也存在缺陷，如，在测定基质中木质纤维素降解率就必须进行真空冷冻干燥预处理24h，一般的真空冷冻干燥耗时长，干燥器容积小等缺点，这就制约了对微生物生长状况的及时了解和工艺调整，导致微生物培养工艺复杂、周期长以及生产成本居高不下。我国是农业大国，每年有大量的农作物秸秆废弃物的产生，这些秸秆中含有大量可用作饲料和造纸原料的纤维素和半纤维素。在植物组织中木质素与半纤维素以共价键的形式结合，并将纤维素分子包埋其中，形成一种坚固的天然屏障，使一般微生物很难降解利用，制约了农作物秸秆的资源化利用。白腐菌作为自然界中迄今为止最有效、最主要的可降解木质纤维素的真菌类微生物，可彻底降解木质纤维素为CO2和H20。木质纤维素是由苯丙烷单元通过醚键和碳碳键连接而成的聚酚类三维网状高分子化合物。木质纤维素由于具有各种生物学稳定的复杂键型而不易被微生物降解。如何高效利用木质纤维素原料其关键在于有效降解包裹在纤维素晶体外面的木质素以及半纤维素，从而增加纤维素表面积，使纤维素易于降解，从而生成可发酵性糖，以及应用于生物制浆过程中。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种可快速测定白腐菌生长周期内各项监测指标的半固体培养基，并提供其制备方法。本发明提供一种固液比适中的半固体培养基，既具有传统固体培养基在培养过程中微生物的分离、鉴定、保藏、计数及群落特征的观察等优点，又具有营养物质分布均匀，与菌体表面接触充分，还能大量溶解微生物的代谢产物等优点。同时可完善培养周期各项指标的监测体系，进行简单地预处理后既可对固液质类指标进行测定，实验室阶段的验证中，可节约三分之一的检测时间并可有效减少测定过程的操作误差。本发明所涉及的白腐菌的半固体培养基的制备，可在保证白腐菌生长过程所需养分供给的同时，缩短培养过程中各项指标的监测时间，并对不利因素进行快速响应，及时调整培养条件，缩短培养周期，简化培养工艺，降低生产成本以及有利于推广白腐菌生物预处理农作物秸秆工业化的利用。为达到上述目的，本发明的技术方案是：本发明一种半固体培养基，培养基按重量组分包括以下组分：秸秆50-75份麸皮20-40份琼脂粉3-5份(NH4)2SO41份KH2PO40.5份葡萄糖2.5份上述组分的总和为100份。优选的，所述培养基的固液比为1∶4.5～1:6.5。(固液比为培养基中固态物质与水的质量比)。优选的，所述培养基的pH值为6.9-7.2。优选的，所述半固体培养基，培养基按重量组分包括以下组分：秸秆55-70份麸皮23-36份琼脂粉3-5份(NH4)2SO41份KH2PO40.5份葡萄糖2.5份上述组分的总和为100份。培养基为半固体形态，所有组分添加完毕后调节pH值为6.9-7.2，可进行白腐菌培养，并可方便快速测定培养过程中的各项指标。本发明所提供的一种可快速测定培养指标的半固体培养基及其配制方法，是以农作物秸秆作为主体。所述秸秆为麦草秸秆、稻草秸秆和玉米秸秆，与其它的秸秆培养基相比，具备更好地生长率和基质利用率。本发明还提供所述培养基的制备方法，包括下列步骤：(1)预处理：用粉碎机将已剥净粗皮的秸秆粉碎过筛，筛子的大小为80-100目；(2)将上述组分按照所述重量组分充分混合；(3)根据固液比加入水后，调节pH值为6.9-7.2。本发明还提供所述培养基的用途，用于快速测定微生物生长周期内各项监测指标。本发明还提供所述培养基的用途，用于微生物培养基。优选的，本发明的微生物主体为担子菌纲(Basidiomycete)白腐菌微生物，适用于黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)。所述培养基的用途，将混合均匀的培养基放入恒温生物培养箱中，设定温度32～37℃，转速70～90rpm。更优选的，转速80rpm。本发明的有益效果一：本发明所提供的半固体培养基的制备，可在保证白腐菌生长过程所需养分供给的同时，缩短培养过程中各项指标的监测时间，并对不利因素进行快速响应，及时优化调整培养条件。本发明的有益效果二：本发明所提供的白腐菌培养基，可使营养物质分布均匀，与白腐菌菌体表面接触充分，还能大量溶解微生物的代谢产物，缩短培养周期，简化培养工艺，降低生产成本。本发明的有益效果三：培养基基质主体为农作物秸秆，尤其是产量巨大的麦草秸秆、稻草秸秆和玉米秸秆，为农作物秸秆的资源化利用以及工业化应用提供可能，有利于推广白腐菌生物预处理农作物秸秆工业化的利用。附图说明图1为麦草秸秆两种培养基降解30d木质素降解率(PSD为本发明所提供的半固体培养基；PSC为传统液体培养基)图2为玉米秸秆两种培养基降解30d木质素降解率(PSD为本发明所提供的半固体培养基；PSC为传统液体培养基)具体实施方式实施例1：一种含麦草秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)半固体培养基包括以下重量份的组分：麦草秸秆70g(NH4)2SO41g葡萄糖2.5g麸皮23gKH2PO40.5g琼脂粉3g固液比1:4.5制备方法为：将麦草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为7.2，即可使用。培养过程中，培养基置于32℃恒温培养箱中，转速80rpm。培养过程中各项指标的监测以测定木质纤维素降解率为例：在无菌条件下，取出经过一段时间培养的培养基5g,真空冷冻干燥8h，既可按照Klason法测定基质中木质素含量，与培养前含量进行对比既可得到培养过程中木质素降解率。实验结果见图.1。实验证明，本发明所提供的半固体真菌培养基与传统液体培养基相比，冷冻干燥时间缩短三分之二，因此可在培养过程中快速测定基质中木质纤维素降解率。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势粗壮的多，而且菌丝的生长速度提前3-5天。实施例2：一种含稻草秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)半固体培养基包括以下重量份的组分：稻草秸秆55g(NH4)2SO41g葡萄糖2.5g麸皮36gKH2PO40.5g琼脂粉5g固液比1:5.5制备方法为：将稻草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为6.9，即可使用。培养过程中，培养基置于37℃恒温培养箱中，转速80rpm。培养过程中各项指标的监测以测定黄孢原毛平革菌培养过程产酶特性为例。具体实施方式：(1)粗酶液的制定无菌条件下，将第一个十天保温箱内摇床内的稻草秸秆的PSC(传统液体培养基)、PSD(本发明所提供的半固体培养基)培养基各取出一个，准备六个小烧杯，六个培养皿，将每个培养基平均划分成两半，其中一半连同另一半表面上的菌转移到小烧杯中，加入40ml蒸馏水，室温下浸提4h，用4层纱布过滤后10000rpm/min离心10min，上清液即为粗酶液，置4℃冰箱备用。另一半转移到培养皿中铺平，用保鲜膜将培养皿包好，扎若干小孔，放入-20℃冰箱中备用。(2)酶活性的测定黄孢原毛平革菌能够产生胞外氧化酶来降解秸秆中的木质素，其主要包括锰过氧化物酶(MnP)、木质素过氧化物酶(LiP)、漆酶(Lac)。在此以锰过氧化物酶为例进行说明。MnP取50mmol/L的乳酸钠缓冲液(pH4.5)3.4mL，1.6mmol/L的MnSO4溶液0.1mL，0.4mL的粗酶液预热至37℃加入1.6mmol/L的过氧化氢溶液0.1mL启动反应。测定最初3min内240nm处吸光度，1个酶活力单位用min-1·g-1粗酶液增加0.1OD来表示。表1黄孢原毛平革菌在不同培养基上Mnp酶活性活动变化(U/mL)Table4PhanerochaetechrysosporiumMnpactivitychangesofactivity(U/mL)ondifferentmedia从表1中可以分析得到，在培养后的5-10d时，开始表现出Mnp活性，并在不同培养基中均呈现升高-降低的趋势，在培养的第15d达到高峰，稻草的PSC和PSD酶活高达49.70U/mL和51.81U/mL。此后酶活性均出现下降趋势。实验证明，本发明所提供的半固体真菌培养基在培养过程中与传统固体培养基相比，简化实验操作步骤和溶剂使用量，可明显减少测定时间以及减少操作误差率。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势一样浓密、粗壮，而且菌丝的生长速度略有提前。实施例3一种含玉米秸秆的黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)培养基包括以下重量份的组分：玉米秸秆65g，(NH4)2SO41g，葡萄糖2.5g，麸皮28g，KH2PO40.5g，琼脂粉3g固液比1:6.5制备方法为：将麦草秸秆除去外表的粗皮，用剪刀减去秸节，粉碎至80-100目，按照上述配比将各物料充分混合，调节水分含量并修正pH值为7.0，即可使用。培养过程中，培养基置于32℃恒温培养箱中，转速80rpm。在无菌条件下，取出经过一段时间培养的玉米秸秆的PSC(传统液体培养基)、PSD(本发明所提供的培养基)培养基5g移入同样组分的菌包培养基中，置于32℃恒温培养箱中连续培养30天。每隔5天记录菌丝生长状况，使用记号笔标出菌丝覆盖位置，30天后以菌丝覆盖菌包表面面积变化值计数。实验结果见图2。实验证明，通过对比PSC与PSD两种不同培养基菌丝净生长速度可以得知，本发明所提供的培养基PSD菌丝净生长速度要快传统培养基PSC，并在第15天达到最大生长速度，在30天时达到最大生长面积。实验证明本发明所提供的培养基中，黄孢原毛平革菌生长更加旺盛，生物量更加丰富。并且菌丝长势要比传统固体培养基的长势浓密、粗壮，菌丝的生长速度提前3-5天提前。当前第1页1 2 3