1.检测MAPT基因突变的探针,其特征在于包括但不限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针中的至少一种。
2.如权利要求1所述检测MAPT基因突变的探针,其特征在于所述探针的5’端标记荧光基团,3’端标记相应的淬灭基团,用于检测MAPT基因编码蛋白R5L突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;用于检测MAPT基因编码蛋白A152T突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;用于检测MAPT基因编码蛋白L284R突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;用于检测MAPT基因编码蛋白S285R突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示;用于检测MAPT基因编码蛋白N296del突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示;用于检测MAPT基因编码蛋白G303V突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示;探针序列可由其碱基互补序列替换。
3.检测MAPT基因突变的试剂盒,其特征在于包括扩增引物、荧光探针、扩增试剂和参照试剂;
所述扩增引物包括特异性扩增MAPT基因编码蛋白R5位点的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示;特异性扩增MAPT基因编码蛋白A152位点的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示;特异性扩增MAPT基因编码蛋白L284、S285、N296和G303位点的引物,其碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示;引物序列可由其碱基互补序列替换;
所述试剂盒采用两种不同荧光基团标记的核酸探针在一个反应管内可以同时指示两个目标片段的存在情况,常用的荧光基团包括但不限于现有的各种荧光标记物,现有的各种荧光标记物包括但不限于ALEX-350、FAM、HEX、VIC、TET、JOE、ROX、TEXAS RED、CY3、CY5、CY5.5;常用的淬灭基团包括但不限于现有的各种淬灭剂,现有的各种淬灭剂包括但不限于DABCYL、BHQ1、BHQ2、BHQ3、TAMRA、ECLIPE;
所述荧光探针的5’端标记荧光基团,3’端标记相应的淬灭基团,用于检测MAPT基因编码蛋白R5L突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示;用于检测MAPT基因编码蛋白A152T突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示;用于检测MAPT基因编码蛋白L284R突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;用于检测MAPT基因编码蛋白S285R突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示;用于检测MAPT基因编码蛋白N296del突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示;用于检测MAPT基因编码蛋白G303V突变的探针,其碱基序列如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示;探针序列可由其碱基互补序列替换;
所述荧光探针包括但不限于TaqMan探针、TaqMan-MGB探针、分子信标、改良分子信标、双链荧光置换探针、LightCycler探针、双环探针中的至少一种;
所述扩增试剂包括:PCR反应缓冲液;MgCl2;热启动Taq酶;dATP、dCTP、dGTP、dTTP;
所述参照试剂包括阳性对照和阴性对照;所述阳性对照为分别包含MAPT基因编码蛋白的R5、A152、L284、S285、N296和G303位点的阳性标准品1、阳性标准品2和阳性标准品3。
4.如权利要求3所述检测MAPT基因突变的试剂盒,其特征在于所述MgCl2的浓度为1~5mmol/L;所述dATP、dCTP、dGTP、dTTP的浓度均为50~400μmol/L;所述热启动Taq酶的单位为1~3U/反应。
5.如权利要求3所述检测MAPT基因突变的试剂盒,其特征在于所述阴性对照选自ddH2O、Nuclease-free Water、Tris-HCl缓冲液中的一种。
6.检测MAPT基因突变的方法,其特征在于包括以下步骤:
1)样本的选择
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型为WT/WT的样本,基因型为R5L/R5L的样本,基因型为WT/R5L的样本,所有的样本均已通过DNA测序的方法进行验证;
2)基因组DNA的提取
用常规分子生物学方法或市售试剂盒从抗凝全血中提取人基因组DNA;
3)实时荧光PCR扩增与检测
实时荧光PCR反应体系包括1×PCR buffer,1.5mmol/L Mg2+,200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP,0.5μmol/L的上、下游引物,0.5μmol/L各荧光探针,1U热启动Taq酶,25ng人基因组DNA;
实时荧光PCR反应在Roche LightCycler 480Ⅱ仪器上进行,按以下条件进行扩增检测:
第一阶段:95℃2min;
第二阶段:95℃20sec,64℃20sec(荧光采集),72℃30sec,38个循环;
两个荧光检测频道分别为FAM和HEX;
4)结果分析
MAPT基因编码蛋白R5位点基因型判定:只在FAM频道中有扩增信号产生的样本为WT/WT纯合子;只在HEX频道中有扩增信号产生的样本为R5L/R5L突变纯合子;在FAM和HEX频道中都有扩增信号产生的样本为WT/R5L杂合子。