Sox2‑CDP蛋白结合结构域及其鉴定方法与流程

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及Sox2-CDP蛋白结合结构域及其鉴定方法。

背景技术：

双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中定位和相互作用的技术，该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用。该技术已用于不同蛋白间相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。

免疫共沉淀技术是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础，用于蛋白质之间相互作用研究的经典方法。该技术基于在溶液状态下或细胞中，蛋白X如能和蛋白Y相互作用，该复合物能被其中任一蛋白的抗体结合发生沉淀的原理，已被广泛用于蛋白质之间相互作用的鉴定实验。

Sox2蛋白是一个强大的转录因子，在干细胞干性维持和自我更新、多个肿瘤的恶性进程（如肿瘤发生、肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭转移，肿瘤干细胞特性维持、化疗药物抗性等）的多个方面具有促进作用。Sox2与CDP不仅在组织器官的发育方面具有很重要的作用，而且它们都和肿瘤恶性进程关系密切。Sox2与CDP在肿瘤恶性进程中具有功能重叠，即细胞增殖、迁移、侵袭和转移，抗凋亡，以及上皮间叶转化等方面。

因此，筛选获得能靶向与Sox2蛋白相互作用的蛋白结合结构域的小分子药物对于食管鳞癌治疗靶点的确立具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供Sox2-CDP蛋白结合结构域及其鉴定方法，一个利用双分子荧光互补技术快速确定Sox2-CDP复合物中结合结构域的方法及利用免疫共沉淀技术进行蛋白质相互作用结合结构域的鉴定方法。

Sox2-CDP相互作用结合结构域为：CDPΔC(101-1516)，其序列如下：MAANVGSMFQYWKRFDLQQLQRELDATATVLANRQDESEQSRKRLIEQSREFKKNTPEDLRKQVAPLLKSFQGEIDALSKRSKEAEAAFLNVYKRLIDVP。

利用载体构建获得了多个用于双分子荧光互补的表达载体，我们初步确定了Sox2-CDP相互作用结合结构域；通过表达载体构建和免疫共沉淀技术，我们进一步验证了Sox2-CDP相互作用结合结构域的正确性。

所述的用于双分子荧光互补的Sox2全长和截短表达载体，具体为：pBiFc-VN173-SOX2 、pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)、pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)、 pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体。

所述的用于双分子荧光互补的CDP全长和截短表达载体，具体为：pBiFc-VC155-CDP、pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)、pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516)、pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体。

另外，ΔN、ΔC为通用指的是删除N端和C端，Δ指的是删除（delete）的意思，如SOX2ΔN(1-167)指的是删除N端1-167氨基酸位点的截短SOX2蛋白。

pBiFcVN173载体中带有FLAG标签，分别将与pBiFcVC155载体连接的CDP各截短突变体pBiFcVC155-CDPΔC（759-1516）、pBiFcVC155-CDPΔC（401-1516）、pBiFcVC155-CDPΔC（201-1516）、pBiFcVC155-CDPΔC（101-1516）和pBiFcVN173-SOX2共转染HEK293T细胞后，提取细胞蛋白用FLAG-Tag免疫共沉淀试剂盒进行免疫共沉淀实验，共沉淀产物分别用FLAG和CDP抗体进行Western blot检测。

Sox2-CDP复合物中蛋白结合结构域确定，包括以下步骤：

1）应用设计引物，以Sox2 cDNA为模板，对Sox2表达阅读框全长进行高保真PCR扩增；

2）利用酶切连接方法将Sox2表达阅读框全长转移入pBiFc-VN173表达载体，获得pBiFc-VN173-SOX2表达载体；

3）应用设计引物，以CDP cDNA为模板，对Sox2表达阅读框全长行高保真PCR扩增；

4）利用酶切连接方法将CDP表达阅读框全长转移入pBiFcVC155表达载体，获得pBiFc-VC155-CDP表达载体；

5) 通过共转染HEK293T细胞，确认Sox2与CDP蛋白之间的相互作用；

6）应用设计引物，以pBiFc-VN173-SOX2载体为模板，对截短的Sox2表达阅读框进行高保真PCR扩增；

7）利用酶切连接方法将Sox2截短表达阅读框转移入pBiFc-VN173表达载体，分别获得pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)、pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)、pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体；

8）应用设计引物，以pBiFc-VC155-CDP载体为模板，对截短的CDP表达阅读框进行高保真PCR扩增；

9）利用酶切连接方法将CDP截短表达阅读框转移入pBiFc-VC155表达载体、分别获得pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)、pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516) 、pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体；

10) 通过共转染HEK293T细胞，确认Sox2与CDP蛋白之间的相互作用结合结构域；

11) 利用共转染方法，以分组形式分别将pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（759-1516）、pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（401-1516）、pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（201-1516）、pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（101-1516）转染入HEK293T 细胞，利用Flag抗体进行免疫共沉淀并联合利用CDP抗体鉴定；

利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的Sox2开放全长和截短阅读框定向插入至pBiFc-VN173中，获得pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167), pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237), pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体。

利用克隆技术和载体构建技术，将经过高保真PCR和酶切获得的具有特定黏性末端的CDP开放全长和截短阅读框定向插入至pBiFc-VC155中，获得pBiFc-VC155-CDP和pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516) ，pBiFc-VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc- VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体。

将所有目的质粒抽提后送测序公司测序并确认序列的正确性和一致性。

利用双分子荧光互补技术，将所有表达载体分配成25个组合进行共转染HEK293T细胞，24小时后，检测荧光的出现，初步确定其蛋白结合结构域。

将表达载体分配成四个组合进行共转染HEK293T细胞，组合一为：pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（759-1516）；组合二为：pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（401-1516）；组合三为：pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（201-1516）；组合四为：pBiFcVN173-SOX2和pBiFcVC155-CDPΔC（101-1516）。48小时后，利用Flag抗体进行免疫共沉淀并联合利用CDP抗体鉴定。

本发明的有益效果在于：

（1）构建了Sox2全长和截短的表达载体，分别为pBiFc-VN173-SOX2 , pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167), pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237), pBiFc-VN173- SOX2 ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体，Sox2全长和截短蛋白与VENUS蛋白的1-172氨基酸残基进行融合表达；

（2）构建了CDP全长和截短的表达载体，分别为：pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516) ，pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体，Sox2全长和截短蛋白与VENUS蛋白的C155氨基酸残基进行融合表达；

（3）利用双分子荧光互补技术，初步筛选获得Sox2和CDP结合结构域为CDPΔC(101-1516) ；

（4）在测序结果正确的基础上，利用去内毒素质粒抽提试剂盒将相应的表达载体进行抽提，将它们按四个组合的方式共转染HEK293T细胞，免疫共沉淀结果表明验证了Sox2和CDP蛋白相互作用的结合结构域，该结合结构域序列为CDPΔC(101-1516)。

附图说明

图1为Sox2和CDP全长及相应的截短突变体的克隆以及双分子荧光互补载体的构建示意图。A：SOX2和CPD的全长及截短突变体的设计。B：样品1为DNA Marker；样品2、4、6分别代表SOX2全长、SOXΔN（1-167）和SOXΔN（1-237）；样品8、10、12分别代表CDP全长、CDPΔC（759-1516）以及CDPΔC（401-1516）；样品3、5、7为SOX2全长及截短突变体与pBiFcVN173连接后的载体构建鉴定；样品9、11、13为CDP全长及截短突变体与pBiFcVC155连接后的载体构建鉴定。C：样品1、3分别代表CDPΔC（201-1516）以及CDPΔC（101-1516）；样品5、7分别代表SOXΔN（1-277）和SOXΔN（1-257）；样品2、4为CDP截短突变体与pBiFcVC155连接后的载体构建鉴定；样品6、8为SOX2截短突变体与pBiFcVN173连接后的载体构建鉴定。

图2为双分子荧光互补实验确定Sox2-CDP结合结构域示意图（红色荧光为内参）。A：全长和截短的Sox2以及全长和截短的CDP表达载体通过组合共转染HEK293T细胞后荧光图。B：Sox2-CDP复合物形成模型图。

图3 为 免疫共沉淀实验验证CDP各截短突变体与Sox2蛋白间的相互作用示意图。Western blott结果显示泳道1Control作为空白对照既无FLAG也无CDP条带；FLAG抗体检测到4个实验组样品在35KD附近都有条带；泳道2-5处用CDP抗体分别检测到约100KD、70KD、35KD和25KD大小条带。表明各CDP截短突变体可被带有FLAG标签的SOX2蛋白沉淀下来，说明CDP各截短突变体与SOX2蛋白之间都存在相互作用，确定CDP蛋白与SOX2蛋白间发生相互作用的结构域存在于CDPΔC(101-1516)，即CDP蛋白的1-100氨基酸位点之间。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂销售店获取。以下实施例中的定量实验，均设置为独立的三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

双分子荧光互补技术确定Sox2-CDP蛋白相互作用结合结构域包括以下步骤：

步骤1）pBiFc-VN173-Sox2表达载体构建：以人食管鳞癌细胞系KYSE450的RNA反转录的cDNA为模板，设计使用表1引物对Sox2 cDNA进行高保真PCR扩增，并使用限制性内切酶EcoRI和XbaI对扩增产物进行酶切后，将其插入pBiFcVN173载体，以形成pBiFcVN173-Sox2表达载体。扩增引物序列如表1所示。经酶切鉴定和测序结果表明：获得了预期的表达Sox2靶标并可用于双荧光互补的载体（图1，表2）。

PCR反应条件如下：

步骤2）Sox2截短蛋白表达载体构建：以pBiFc-VN173-Sox2表达载体为模板，分别设计使用表1引物对截短Sox2进行高保真PCR扩增，并使用限制性内切酶EcoRI和XbaI对扩增产物进行酶切后，将其插入pBiFcVN173载体，以形成pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167), pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237), pBiFc-VN173- SOX2ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体。扩增引物序列如表1所示。经酶切鉴定和测序结果表明：获得了预期的表达Sox2截短蛋白并可用于双荧光互补的载体（图1，表2）。

PCR反应条件如下：

步骤3）pBiFc-VC155-CDP表达载体构建：以人食管鳞癌细胞系KYSE450的RNA反转录的cDNA为模板，设计使用表1引物对CDP cDNA进行高保真PCR扩增，并使用限制性内切酶SalI和KpnI对扩增产物进行酶切后，将其插入pBiFcVC155载体，以形成pBiFc-VC155-CDP表达载体。扩增引物序列如表1所示。经酶切鉴定和测序结果表明：获得了预期的表达CDP靶标并可用于双荧光互补的载体（图1，表2）。

PCR反应条件如下：

步骤4）CDP截短蛋白表达载体构建：以pBiFc-VC155-CDP为模板，分别设计使用表1引物对截短CDP进行高保真PCR扩增，并使用限制性内切酶SalI和KpnI对扩增产物进行酶切后，将其插入pBiFcVC155载体，以形成pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516) ，pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc- VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体。扩增引物序列如表1所示。经酶切鉴定和测序结果表明：获得了预期的表达CDP靶标并可用于双荧光互补的载体（图1，表2）。

PCR反应条件如下：

步骤5）使用去内毒素质粒提取试剂盒抽提测序正确的以上用于双分子荧光互补载体和pDsRED2-C1载体，，使用Lipofectamine 2000转染试剂，将200ng pBiFc-VN173-SOX2 , pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167), pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237), pBiFc-VN173- SOX2 ΔN(1-257)和pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)表达载体，200ng pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516) ，pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)表达载体和50ng pDsRED2-C1（pDsRed2-C1转染的红色荧光作为内参）载体分别形成25个不同组合共转染于12孔板的HEK293T细胞中。25种组合分别如下：

pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)和pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)， pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)和pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)和pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-167)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)，pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)和pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)和pBiFc-VC155-CDPΔC(401-1516)，pBiFc-VN173-SOX2 ΔN(1-237)和pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-237)和 pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-257)和 pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-257)和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)， pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-257) 和BiFc-VC155-CDPΔC(401-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-257)和pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-257)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277) 和 pBiFc-VC155-CDP，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)， pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277) 和BiFc-VC155-CDPΔC(401-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277) 和pBiFc- VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-SOX2ΔN(1-277)和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)。

步骤6）将转染的HEK293T细胞放置于细胞培养箱中培养24小时后，在荧光显微镜下观察到荧光的出现。初步结果表明：SOX2与CDP相互作用的区域定位在CDPΔC(101-1516) 和 SOX2ΔN(1-257)，即CDP蛋白的1-100氨基酸与SOX2蛋白的278-317氨基酸是两个蛋白相互结合的区域（图2）。

表 1：PCR所用扩增引物

表 2：PCR获得的CDP与SOX2全长及截短突变体

实施例2

免疫共沉淀技术验证Sox2-CDP蛋白相互作用结合结构域包括以下步骤

步骤1）转染：按照以下四种组合方式： pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(759-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC (401-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(201-1516)，pBiFc-VN173-Sox2和pBiFc-VC155-CDPΔC(101-1516)，将质粒转染至HEK293T细胞，48h后可提取细胞蛋白用于免疫共沉淀。

步骤2）免疫共沉淀：使用SIGMA FLAG-免疫共沉淀试剂盒，按照说明书进行标准操作，收获蛋白，因为pBiFc-VN173-Sox2中Sox2与Flag标签融合表达，因此使用Flag标签抗体做免疫共沉淀。

步骤3）Western blot验证Sox2与截短CDP的相互作用：免疫共沉淀的样品跑SDS电泳，使用Flag一抗（鼠源）和CDP一抗（兔源）分别孵育转印膜，并使用稀释二抗（羊抗兔）和二抗（羊抗鼠）进行鉴定。

步骤4）免疫共沉淀验证Sox2-CDP蛋白相互作用结合结构域的正确性：结果显示Control作为空白对照既无FLAG也无CDP条带；FLAG抗体检测到4个实验组样品在35KD附近都有条带；CDP抗体检测到4个实验组样品分别在100KD、70KD、35KD和25KD附近有条带（图3）。表明各CDP截短突变体可被带有FLAG标签的SOX2蛋白沉淀下来，说明CDP各截短突变体与SOX2蛋白之间都存在相互作用，确定CDP蛋白与SOX2蛋白间发生相互作用的结构域存在于CDPΔC(101-1516)，即CDP蛋白的1-100氨基酸位点之间。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军南京军区福州总医院

<120> Sox2-CDP蛋白结合结构域及其鉴定方法

<130> 21

<160> 21

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 100

<212> PRT

<213> CDPΔC(101-1516)

<400> 1

Met Ala Ala Asn Val Gly Ser Met Phe Gln Tyr Trp Lys Arg Phe Asp

1 5 10 15

Leu Gln Gln Leu Gln Arg Glu Leu Asp Ala Thr Ala Thr Val Leu Ala

20 25 30

Asn Arg Gln Asp Glu Ser Glu Gln Ser Arg Lys Arg Leu Ile Glu Gln

35 40 45

Ser Arg Glu Phe Lys Lys Asn Thr Pro Glu Asp Leu Arg Lys Gln Val

50 55 60

Ala Pro Leu Leu Lys Ser Phe Gln Gly Glu Ile Asp Ala Leu Ser Lys

65 70 75 80

Arg Ser Lys Glu Ala Glu Ala Ala Phe Leu Asn Val Tyr Lys Arg Leu

85 90 95

Ile Asp Val Pro

100

<210> 2

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cggaattcaa tgtacaacat gatggagac 29

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgctctagac atgtgtgaga ggggcag 27

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggaattcaa acggcagcta cagcatga 28

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgctctagac atgtgtgaga ggggcag 27

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cggaattcag gctccatggg ttcggtg 27

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctctagac atgtgtgaga ggggcag 27

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggaattcat cctcccactc cagggcg 27

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgctctagac atgtgtgaga ggggcag 27

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggaattcac tccccggcgc cgaggt 26

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tgctctagac atgtgtgaga ggggcag 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggggtaccga actcccattc gataggt 27

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ggggtaccgg acagaagctt gggggt 26

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ggggtaccgt tcttctccag caacagcac 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ggggtaccct ttgaggtggt ggacatct 28

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

acgcgtcgac catggcggcc aatgtgggat 30

<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggggtacctg ggacgtcaat caatctttt 29