一种从烟草中提取东莨菪内酯化合物的方法与流程

本发明涉及一种从烟草中提取东莨菪内酯化合物的方法，属于烟草化学技术领域。

背景技术：

东莨菪内酯，又名东莨菪素，属于香豆素类化合物，常作为镇痛、抗炎、降血压和缓解肌肉痉挛等药物。已经有报道称可从多种植物中提取获得，如当归、颠茄等。东莨菪内酯对不同种类的细菌有抑菌活性，其中包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌属以及肺炎克雷伯菌和绿脓杆菌等。东莨菪内酯具有抗炎活性，可用于治疗支气管疾病和哮喘。还具有调节激素血清素，帮助减轻焦虑和抑郁症。

但是东莨菪内酯的合成工艺较为复杂，成本高。想要大量获得只能从植物组织中提取。虽然有报道称可以从当归、颠茄等植物中提取，但是还没有成熟完善的工业提取方法，特别是从烟草中提取东莨菪内酯的方法，目前还未见报道。同时限制东莨菪内酯为烟用香精香料添加。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种具有抗氧化活性的东莨菪内酯化合物及其制备方法，具有较好的抗氧化活性，可扩大东莨菪内酯化合物的应用范围，尤其的作为烟用香精香料，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案：一种从烟草中提取东莨菪内酯化合物的方法，该方法采用下述步骤：

(1)用乙醇水溶液浸提烟草样品后，通过减压浓缩得烟草浸膏；

(2)将烟草浸膏水溶后，采用有机溶剂萃取后，减压浓缩萃取液至十分之一体积，得到萃取液；

(3)将D101大孔树脂活化后，装入层析柱中，纯净水冲洗至无醇味，将上一步骤中得到的萃取液至上而下倒入大孔树脂层析柱中，然后，以不同浓度梯度的乙醇对大孔树脂柱进行洗脱；

(4)收集洗脱液后，对洗脱液进行减压浓缩，浓缩至十分之一体积后进行毛细管取样薄层层析，展开系统为氯仿：甲醇，显色剂为5％硫酸乙醇溶液，显示方法为加热显色，将含有相似成分的洗脱液进行合并；减压浓缩洗脱液至干得烟草极性提取物；

(5)采用薄层层析法，展开剂为氯仿：丙酮，合并显示出棕黑色斑点的样品减压浓缩后得到致香类粗提物浸膏；

(6)致香类粗提物浸膏与硅胶搅拌均匀后，采用正相硅胶色谱柱进行分离，流动相为氯仿：甲醇梯度洗脱；收集各部分洗脱液；

(7)通过薄层层析法，展开剂为氯仿：丙酮，根据不同的Rf值，按照不同极性合并致香类物质，得到致香类细提物；

(8)对烟草细提物进行正相柱层析，以甲醇：氯仿为流动相梯度洗脱，TLC检测分段为A-E5个部分，将其中的B段通过凝胶柱层析后，进样至半制备色谱系统中进行分离；在色谱条件：流动相为甲醇:水，体积比33:67，保留时间7.23分钟，分离得到该单体化合物。

所述的步骤(5)展开剂中氯仿：丙酮体积比为5:1。

所述的步骤(7)展开剂中氯仿：丙酮体积比为10:1。

所述的步骤(5)和(7)中显色剂为α-萘酚5％乙醇溶液，显色方法为加热显色。

本发明的有益效果是：在本发明工艺中，各个步骤的提取手段，尤其是步骤8中对TLC检测分段中B段通过反相硅胶柱层析后，进样至半制备色谱系统中进行分离；在各色谱条件下，保留时间7.23分钟得到东莨菪内酯是及其重要的步骤，尤其是其中的保留时间，保留时间的长短，甚至是0.1-0.2分的差别，都会导致分离产物的变化，这是发明人在实验中不断摸索反复试验得到的。

该化合物是烟草中的天然存在物质，将其作为烟用香精香料添加剂，能降低吸烟对人体造成的危害，作为卷烟添加剂能降低卷烟的气相自由基，其可能机理是中草药中的有效成分阻断了卷烟在燃烧时自由基的产生或是对生成的自由基进行迅速的淬灭。同时，由于是烟草自身的物质，在添加至卷烟产品中后，不会由于添加非烟草制品类物质而给卷烟产品产生不好的气味等不良影响。

附图说明

图1为本发明化合物的核磁共振氢谱(1H-NMR)；

图2为本发明化合物的核磁共振碳谱(13C-NMR)；

图3为本发明化合物的异核多量子相干谱；

图4为本发明化合物双量子过滤的1H 1H COSY谱；

图5为本发明化合物异核多糖相关谱；

图6为本发明中YC-24(东莨菪内酯)和VC的体外抗氧化活性图；

图7为本发明化合物半制备色谱分析检测结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

一种具有抗氧化活性的东莨菪内酯化合物，所述化合物具有下述结构式：

白色粉末(CD₃OD)，Chemical Formula:C10H8O4 Exact Mass:192.04 Molecular Weight:192.17m/z:192.04(100.0％),193.05(11.1％),194.05(1.4％)Elemental Analysis:C,62.50；H,4.20；O,33.30。

一种从烟草中提取东莨菪内酯化合物的方法，该方法采用下述步骤：

(1)用75％乙醇水溶液浸提烟草样品后，通过减压浓缩得烟草浸膏；

(2)将烟草浸膏用水，超声波助溶后，采用乙酸乙酯或石油醚萃取后，减压浓缩萃取液至十分之一体积，得到萃取液；

(3)将D101大孔树脂按照说明书要求活化后，装入适当尺寸的层析柱中，纯净水冲洗至无醇味，将上一步骤中得到的萃取液至上而下倒入大孔树脂层析柱中，然后，以不同浓度梯度的乙醇(10％-100％)对大孔树脂柱进行洗脱；

(4)收集多瓶洗脱液后，对每一瓶洗脱液进行减压浓缩，浓缩至十分之一体积后进行毛细管取样薄层层析，展开系统为氯仿：甲醇，显色剂为5％硫酸乙醇溶液，显示方法为加热显色。将含有相似成分的洗脱液进行合并；；减压浓缩洗脱液至干得烟草极性提取物；

(5)采用薄层层析法，展开剂为氯仿：丙酮(5:1)，显色剂为α-萘酚5％乙醇溶液，显色方法为加热显色，合并显示出棕黑色斑点的样品减压浓缩后得到致香类粗提物浸膏；

(7)致香类粗提物浸膏与硅胶搅拌均匀后，采用正相硅胶色谱柱进行分离，流动相为氯仿：甲醇梯度洗脱，洗脱液比例为100:0-0:100；收集各部分洗脱液；

(8)通过薄层层析法，展开剂为氯仿：丙酮(10:1)，显色剂为α-萘酚5％乙醇溶液，显色方法为加热显色，根据不同的Rf值，按照不同极性合并致香类物质，得到致香类细提物；

(9)对烟草细提物进行正相柱层析，以甲醇：氯仿为流动相梯度洗脱，TLC检测分段为A-E5个部分，将其中的B段通过凝胶柱层析后，进样至半制备色谱系统中进行分离；在色谱条件下(流动相为甲醇:水，33:67)，保留时间7.23分钟，分离得到该单体化合物。

抗氧化活性实验：

(1)DPPH储备液的配制准确称取1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)0.078g，用无水乙醇溶解定容至100ml棕色容量瓶中，摇匀，得浓度为2mmol/L母液，4℃保存。用时取10ml母液稀释定容到100ml容量瓶中，得浓度为0.2mmol/L。

(2)VC溶液的配制精密称取VC 0.25g，水溶解得母液浓度2.5mg/ml，分别取母液0.01ml、0.02ml、0.03ml、0.05ml、0.08ml、0.1ml、0.15ml定容至25ml容量瓶中，得一定浓度梯度0.001mg/L、0.002mg/L、0.003mg/L、0.005mg/L、0.008mg/L、0.01mg/L、0.015mg/L摇匀，室温放置。分别吸取2ml样品溶液按照“1.1.4”项下方法测定。

(3)供试品溶液配制取一定量所分离的单体化合物，按照一定浓度梯度稀释，再分别取2ml供试溶液，按照“1.1.4”项下方法测定。

(4)自由基清除率测定方法取2ml不同浓度供试品溶液与2ml 0.2mmol/L DPPH溶液加入比色管中，混匀后室温放置30min，于517nm处测定A值，平行测定三次，以VC为阳性对照。利用DPPH溶液的特征棕黑色基团的吸收，用紫外－可见分光光度法测定反应后的供试溶液在517nm吸收的下降程度表示其对有机自由基的清除能力。

试样对DPPH清楚率按照以下公式计算：

DPPH清除率＝1－(A_i－A_j)/A₀

A_i为样品+DPPH吸光度的平均值；

A_j为样品溶液吸光度的平均值；

A₀为DPPH吸光度的平均值。

结果

表1 YC-24(东莨菪内酯)和VC的体外抗氧化活性