从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用与流程

文档序号:12411382阅读:来源:国知局

技术特征:

1.从胎盘羊膜制备人羊膜间充质干细胞的方法,该方法包括以下步骤:

(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘,置于白瓷盘中,使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面,对胎盘进行消毒处理;

(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血,剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块;用300目滤网过滤,生理盐水冲洗残血,组织块转移至50ml离心管;

(3)组织消化:在37℃恒温摇床中,将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min;消化结束后,加2ml胎牛血清混匀终止;用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗,收集滤液;

(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养:

滤液部分:收集的滤液以1500rpm离心5min,去上清,用生理盐水重悬清洗细胞沉淀;以1500rpm离心5min,去上清,将细胞沉淀用完全培养基重悬;计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率;以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中,添加20ml完全培养基,晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养;定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

组织块部分:将收集的组织块置于75cm2培养瓶中,使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积,添加完全培养基没过组织,晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养;2d后补液10ml完全培养基,继续培养;较多间充质干细胞爬出后去组织,定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

(5)P1代细胞收获:用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后,收集细胞,计数并测定细胞活率,冻存,即得P1代的羊膜间充质干细胞,必要时对其进行传代培养。

2.根据权利要求1的方法,其中:

所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素;

所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的:将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;和/或

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型胶原酶,0.3mg/ml的II型胶原酶,0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

3.根据权利要求1的方法,其中:

所述完全培养基包括:DMEM-F12培养基、FBS、青霉素、链霉素;

所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1:1配制的培养基;和/或

所述完全培养基包括:DMEM-F12(1:1)培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素;例如,所述的完全培养基中还添加了0.01~0.05%硝酸硫胺和0.05~0.1%麦芽糖。

4.根据权利要求1的方法,其中:

步骤(4)中,通常是培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代;和/或

步骤(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

5.一种人羊膜间充质干细胞,其是通过包括如下步骤的方法制备得到的:

(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘,置于白瓷盘中,使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面,对胎盘进行消毒处理;

(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血,剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块;用300目滤网过滤,生理盐水冲洗残血,组织块转移至50ml离心管;

(3)组织消化:在37℃恒温摇床中,将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min;消化结束后,加2ml胎牛血清混匀终止;用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗,收集滤液;

(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养:

滤液部分:收集的滤液以1500rpm离心5min,去上清,用生理盐水重悬清洗细胞沉淀;以1500rpm离心5min,去上清,将细胞沉淀用完全培养基重悬;计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率;以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中,添加20ml完全培养基,晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养;定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

组织块部分:将收集的组织块置于75cm2培养瓶中,使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积,添加完全培养基没过组织,晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养;2d后补液10ml完全培养基,继续培养;较多间充质干细胞爬出后去组织,定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

(5)P1代细胞收获:用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后,收集细胞,计数并测定细胞活率,冻存,即得P1代的羊膜间充质干细胞,必要时对其进行传代培养。

6.根据权利要求5的人羊膜间充质干细胞,其中:

所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素;

所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的:将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型胶原酶,0.3mg/ml的II型胶原酶,0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶;

所述完全培养基包括:DMEM-F12培养基、FBS、青霉素、链霉素;

所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1:1配制的培养基;和/或

所述完全培养基包括:DMEM-F12(1:1)培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素。

7.根据权利要求5的人羊膜间充质干细胞,其中:

步骤(4)中,通常是培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代;

步骤(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

8.人羊膜间充质干细胞在制备作为细胞治疗剂的药物中的用途,所述人羊膜间充质干细胞是通过包括如下步骤的方法制备得到的:

(1)从胎盘样品采集盒中取出胎盘,置于白瓷盘中,使用基础平衡盐溶液反复冲洗表面,对胎盘进行消毒处理;

(2)用手术镊慢慢撕取胎膜外层羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基础平衡盐溶液反复清洗表面污血,剪碎成直径为5mm的羊膜组织小块;用300目滤网过滤,生理盐水冲洗残血,组织块转移至50ml离心管;

(3)组织消化:在37℃恒温摇床中,将组织块用1倍组织体积的混合酶消化液以100rpm振荡消化30~60min;消化结束后,加2ml胎牛血清混匀终止;用200目滤网过滤并用大量生理盐水清洗,收集滤液;

(4)分别对滤液部分和组织块部分进行细胞培养:

滤液部分:收集的滤液以1500rpm离心5min,去上清,用生理盐水重悬清洗细胞沉淀;以1500rpm离心5min,去上清,将细胞沉淀用完全培养基重悬;计数仪计取有核细胞数并用台盼兰染色测定细胞活率;以每瓶2×106个细胞接种于75cm2培养瓶中,添加20ml完全培养基,晃匀后在5%CO2、37℃培养箱中培养;定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

组织块部分:将收集的组织块置于75cm2培养瓶中,使组织块能够覆盖培养瓶中一半的培养面积,添加完全培养基没过组织,晃匀后于5%CO2、37℃培养箱中培养;2d后补液10ml完全培养基,继续培养;较多间充质干细胞爬出后去组织,定期换液;培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代,继续用完全培养基培养;

(5)P1代细胞收获:用胰酶消化液将上一步骤中的两部分合并后的P1代细胞消化后,收集细胞,计数并测定细胞活率,冻存,即得P1代的羊膜间充质干细胞,必要时对其进行传代培养。

9.根据权利要求1的用途,其中:

所述基础平衡盐溶液中包括链霉素和青霉素两种抗生素;

所述基础平衡盐溶液是通过如下方式配制得到的:将0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的链霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型胶原酶,0.3mg/ml的II型胶原酶,0.1mg/ml的透明质酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶;

所述完全培养基包括:DMEM-F12培养基、FBS、青霉素、链霉素;

所述DMEM-F12培养基是DMEM-F12以体积比1:1配制的培养基;和/或

所述完全培养基包括:DMEM-F12(1:1)培养基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL链霉素。

10.根据权利要求1的用途,其中:

步骤(4)中,通常是培养10~15天(通常可以是12天左右)后传代至P1代;和/或

步骤(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

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