一种荧光分子探针和纳米探针及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种荧光分子探针及纳米探针，特别涉及一种具有水溶性以及具有聚集诱导发射效应的荧光分子探针和荧光纳米探针，及它们的制备方法，特别还涉及到该荧光分子探针在白蛋白的检测方面的应用，属于化学分析、生物分析检测技术领域。

背景技术：

人血清白蛋白(HSA)是人体血液中一种主要的蛋白，在维持血浆胶体渗透压，运输内源性和外源性分子包括许多药物起着关键的作用。研究证明，HSA在体液中的浓度与许多疾病包括癌症、类风湿性关节炎、心肌缺血和肝功能衰竭的进展密切相关(G.Fanali,A.di Masi,V.Trezza,M.Marino,M.Fasano,P.Ascenzi,Mol Aspects Med.2012,33,209；V.Arroyo,R.Garcia-Martinez,X.Salvatella,J.Hepatol.2014,61,396；C.-E.Ha,N.V.Bhagavan,BBA-Gen.Subjects 2013,1830,5486；J.Rozga,T.Piatek,P.Malkowski,Ann.Transpl.2013,18,205.)。人体中HSA的含量作为一个可靠的健康指标，其正常水平约为35–55g L^-1(527-828μmolL^-1)。血浆中低水平的白蛋白与肝硬化、慢性肝炎和肝衰密切相关。相反，尿液中过量的HSA存在，被公认为是诊断糖尿病、高血压、心血管疾病和肾脏疾病的一个指标。因此，高选择性、高灵敏度、准确的检测人体液中HSA的含量，尤其是血清中的含量，在临床诊断中具有重要的意义。

目前为止，包括染料结合荧光分析法，基于抗体(免疫组化)方法，以及质谱为基础的蛋白质组学技术，用于血液样品中白蛋白的定量检测。在众多的方法中，基于荧光的分析法由于其快速、灵敏、非破坏性和适用于高通量检测的优异特点，已被广泛的应用于不同样品中HAS含量的检测。但是，已经报道的荧光探针具有一些局限性，例如，一些探针在水溶液中溶解性差，使得它很难在生物系统中应用(X.Fan,Q.He,S.Sun,H.Li,Y.Pei,Y.Xu,Chem.Commun.2016,52,1178.)。另外，一些文献报道的探针检测白蛋白，是通过共价键与蛋白的巯基或者是氨基结合来实现的(P.Anees,S.Sreejith,A.Ajayaghosh,J.Am.Chem.Soc.2014,136,13233；M.Cieplak,K.Szwabinska,M.Sosnowska,B.K.C.Chandra,P.Borowicz,K.Noworyta,F.D’Souza,W.Kutner,Biosens.Bioelectron.2015,74,960.)。但是，这种不可逆的结合可能会导致蛋白的变性。此外，大部分检测白蛋白的荧光探针利用传统的有机染料分子作为荧光发射基团，这类分子在生理缓冲液中容易产生聚集，然而，聚集之后由于聚集体的激发态非辐射弛豫导致荧光淬灭。研究者们为了克服这一缺陷，不得不使用极稀的探针溶液和溶解度高的探针来用于蛋白的检测。然而，稀溶液的探针同样面临发射荧光弱、灵敏度差等问题。此外，即使在稀溶液中聚集导致淬灭的影响也无法完全避免，因为，在生物分析中荧光探针分子可能积聚在生物大分子和蛋白质的疏水腔的表面，导致荧光淬灭。因此，设计荧光探针具有完全水溶性，并且能够克服聚集诱导淬灭的缺陷来检测人血清白蛋白是非常关键的。

技术实现要素：

针对现有检测血清蛋白的荧光探针的性能存在的不足，本发明的第一个目的是在于提供一种水溶性好，且同时具有聚集诱导效应的荧光分子探针。

本发明的第二个目的是在于提供一种由水溶性好且具有聚集诱导效应的荧光分子探针在水溶液中自组装形成荧光纳米探针。

本发明的第三个目的是在于提供一种操作简单、原料易得的制备所述荧光分子探针的方法。

本发明的第四个目的是在于提供一种操作简单、条件温和的制备荧光纳米探针的方法。

本发明的第五个目的是在于提供一种所述的荧光纳米探针在检测血液中白蛋白的应用；所述的荧光分子探针在水溶液中自组装形成疏松的纳米粒，与白蛋白作用后发生脱组装，探针分子进入蛋白的疏水性空腔而限制探针分子的旋转而发射荧光来实现对蛋白的检测，表现出灵敏度高、选择性好的特点。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有水溶性及聚集诱导发射效应的荧光分子探针，具有式1结构：

其中，

R₁、R₂和R₃独立选自氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、羧基或胺基；

R₄选自C₁～C₁₃脂肪链或C₈～C₁₃含芳基的烷链。

优选的方案，R₂和R₃均选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、羟基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基；较优选的方案，R₂和R₃均选自氢。

优选的方案，R₄选自C₂～C₈烷链或1,4-二亚甲基苯基基团。

优选的方案，R₁选自氢、氟、氯、溴、碘、甲基、羟基、甲氧基、硝基、羧基或二甲胺基，较优选的方案，R₁选自氢。

本发明还提供了一种荧光纳米探针，是由所述荧光分子探针自组装形成。式1结构的荧光分子探针在水溶液中通过自组装形成聚集态纳米粒，聚集态纳米粒主要由荧光分子探针单体、寡聚体和多聚体构成。

本发明还提供了一种制备所述的具有水溶性及聚集诱导发射效应的荧光探针分子的方法，该方法包括以下步骤：

1)4-甲酰基吡啶、式2苯胺类化合物和式3苯偶酰类化合物在醋酸/醋酸铵体系中进行环化反应，得到式4中间体；

2)式4中间体与式5二溴代化合物进行亲核取代反应，得到式6中间体；

3)式6中间体与吡啶发生亲核取代反应，即得；

其中，

R₁、R₂和R₃独立选自氢、卤素、烷基、羟基、烷氧基、硝基、羧基或胺基；

R₄选自C₁～C₁₃脂肪链或C₈～C₁₃含芳基的烷链。

优选的方案，1)中的反应过程为：将4-甲酰基啶和苯胺类化合物在冰醋酸溶剂中搅拌0.5～1.5h，再加入苯偶酰类化合物和醋酸铵，在110～130℃温度下反应8～16h。

优选的方案，2)中的反应条件为：采用乙腈作为溶剂，在80～95℃反应6～10小时。

优选的方案，3)中的反应条件为：采用吡啶作为溶剂，在80～95℃反应6～10小时。

本发明还提供了一种制备所述的荧光纳米探针的方法，该方法是将所述的荧光分子探针溶于有机溶剂后，加入到水溶液中，超声处理，即得荧光纳米探针。

优选的方案，有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺、二甲亚砜、四氢呋喃、乙腈中的至少一种。

优选的方案，水溶液选自纯水、生理盐水、磷酸缓冲溶液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液或三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。

本发明还提供了一种所述荧光纳米探针的应用，将荧光纳米探针应用于血清白蛋白的检测。

优选的方案，将荧光纳米探针应用于化学溶液体系、患者血液或生物组织中白蛋白的荧光定量分析检测。

本发明的荧光探针分子是一种典型的bola型分子，具有多苯基取代咪唑环和四级铵盐结构，中间通过疏水性烷基链连接。探针分子具有良好的水溶性，在水中自组装形成有机纳米粒，且没有荧光。与白蛋白识别之后，发生脱组装，探针分子进入蛋白的疏水性空腔，与蛋白的氨基酸残基发生氢键作用和疏水作用，最终导致限制探针分子的旋转而产生荧光。其检测原理如图5。

本发明的具有水溶及聚集诱导效应荧光分子探针制备路线如下(以R₁、R₂，和R₃为氢，R₄＝C₂、C₄、C₆、C₈、C₁₀、C₁₂烷链为例进行具体说明)：

本发明的具有水溶性及聚集诱导效应的荧光分子探针的具体制备方法通过如下步骤实现：

a、将4-甲酰基吡啶和苯胺溶解于冰醋酸中，常温搅拌1小时，然后依次加入苯偶酰和醋酸铵混合均匀，继续加热120℃回流反应过夜，TLC检测反应完全后用氢氧化钠溶液调pH至近中性有沉淀产生，减压过滤得滤饼，干燥，柱色谱分离纯化得到化合物1；

b、将化合物1溶解于乙腈中，加入二溴化合物(1,2-二溴乙烷、1,4-二溴丁烷、1,6-二溴己烷、1,4-二(溴甲基)苯、1,8-二溴辛烷、1,10-二溴癸烷或1,12-二溴十二烷)；体系混合均匀后，90℃加热回流，反应结束后，减压蒸馏除掉溶剂，柱色谱分离纯化得到化合物2、化合物4、化合物6、化合物8、化合物10、化合物12或化合物14；

c、将化合物2、化合物4、化合物6、化合物8、化合物10、化合物12或化合物14溶解在吡啶中，体系加热90℃回流反应，反应结束后，减压蒸馏除掉溶剂，柱色谱分离纯化得到目标产物。

本发明的荧光纳米探针的制备方法通过如下步骤实现：

将目标产物充分溶解于有机溶剂中制备成母液，然后用移液枪吸取母液，在超声条件下加入到一定量的水溶液中，体系常温搅拌30min后即得检测血清白蛋白用的有机纳米粒。利用动态光散射(DLS)、和投射电镜(TEM)来观察形成纳米粒的粒径和形貌。

本发明的技术方案基于荧光纳米探针检测白蛋白的方法是充分利用了荧光分子探针在水溶液中自组装形成纳米粒，且形成的纳米粒溶液没有荧光，而在白蛋白存在时，发生脱组装，探针分子进入蛋白的疏水性空腔，与蛋白的氨基酸残基发生氢键作用和疏水作用，最终导致限制探针分子的旋转而产生荧光。本发明正是基于此而建立检测白蛋白的方法，该方法抗干扰强、灵敏度高，可以广泛推广应用。

本发明的荧光纳米探针能够用于化学模拟生物体系中白蛋白的检测；也可用临床医学上血清中白蛋白的检测。

相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的荧光分子探针具有水溶性好，可以在水中自组装形成无荧光的纳米粒的特点，且其具有聚集诱导发射效应，与白蛋白作用时发生脱组装，产生480nm的荧光，特别适用于荧光检测。

2)本发明的荧光探针分子及荧光纳米探针的制备方法简单、成本低，有利于大规模生产。

3)本发明的荧光纳米探针用于检测血清等中的白蛋白，该探针对白蛋白具有很好的选择性，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、组氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、谷胱甘肽、ATP、葡萄糖等对白蛋白的检测没有干扰，该纳米探针溶液的荧光强度与白蛋白的浓度在一定的浓度范围内(白蛋白的浓度范围0-15μM)具有良好的线性关系，显示出定量检测特性，完全可以满足临床上对患者血液中白蛋白的含量检测的要求。

4)本发明的荧光纳米探针对白蛋白的响应时间短(15s)，测定的灵敏度高，抗干扰能力强，操作简单，成本低廉，使得其适合推广运用。

附图说明

【图1】本发明实施例1中制备的荧光纳米探针动态光散射图。

【图2】本发明实施例1中制备的荧光纳米探针的投射电镜图。

【图3】本发明实施例1中荧光纳米探针的荧光强度与白蛋白浓度的线性关系，横坐标为白蛋白浓度，纵坐标为荧光强度。

【图4】本发明实施例1中荧光纳米探针对白蛋白的选择性。

【图5】为荧光纳米探针用于白蛋白检测的原理图。

具体实施方式

以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。

实施例1

本发明的聚集诱导荧光发射增强的目标物3(实例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₂)的合成，合成路线如下：

化合物1的合成：分别称取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸当中，室温搅拌一小时。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸铵(3.55g，46mmol)顺序加入到反应体系中，化合物在120℃条件下反应过夜，反应结束后反应体系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氢氧化钠溶液调解体系pH至中性，混合物过滤用水洗三遍，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化得到产物。产率为42％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:计算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；发现374.1651[M+H]⁺.

化合物2的合成：称取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,2-二溴乙烷(93mg,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流10小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物2。产率为45％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.09–9.11(d,2H),7.81-7.82(d,2H),7.51-7.55(m,7H),7.25-7.42(m,8H),3.48-3.50(t,2H),3.40-3.43(t,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):145.39,144.84,141.81,140.85,140.41,137.23,137.04,136.75,135.92,133.49,133.41,131.35,130.79,129.16,128.96,127.06,123.72,123.48,60.74,32.08.

化合物3的合成：称取化合物2(110mg，0.20mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物3。产率为53％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):9.14-9.15(d,2H),8.94-8.96(d,2H),8.68-8.72(t,1H),8.19-8.23(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.50-7.55(m,7H),7.27-7.37(m,8H),5.29-5.32(t,2H),5.20-5.23(t,2H),1.88-1.92(m,4H),1.23-1.32(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):147.08,145.80,145.48,144.77,140.57,140.43,136.80,135.84,133.45,131.37,130.66,130.47,130.11,129.78,129.15,128.93,128.87,128.58,128.06,127.01,124.12,59.58,59.05.

实施例2

本发明的聚集诱导荧光发射增强的目标物5(实例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₄)的合成，合成路线如下：

化合物1的合成：分别称取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸当中，室温搅拌一小时。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸铵(3.55g，46mmol)顺序加入到反应体系中，化合物在120℃条件下反应过夜，反应结束后反应体系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氢氧化钠溶液调解体系pH至中性，混合物过滤用水洗三遍，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化得到产物。产率为42％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:计算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；发现374.1651[M+H]⁺.

化合物4的合成：称取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,4-二溴丁烷(0.106g,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流10小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物4。产率为51％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):8.90-8.92(d,2H),7.79-7.81(d,2H),7.48-7.53(m,7H),7.26-7.36(m,8H),4.50-4.54(t,2H),3.54-3.57(t,2H),1.98-2.01(m,2H),1.79-1.82(m,2H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):144.99,144.17,140.55,140.33,136.51,135.96,133.54,131.38,130.63,129.71,129.30,129.12,128.98,128.91,127.99,127.01,124.12,59.60,34.36,29.61,29.16.

化合物5的合成：称取化合物4(120mg，0.20mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物5。产率为53％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.29-9.30(d,2H),9.10-9.12(d,2H),8.61-8.65(t,1H),8.16-8.20(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.49-7.53(m,7H),7.26-7.37(m,8H),4.76-4.80(t,2H),4.65-4.69(t,2H),1.91-1.98(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):144.67,144.05,143.82,142.73,139.19,138.93,135.12,134.58,132.18,130.01,129.29,129.07,128.35,127.94,127.76,127.54,127.21,126.61,125.63,122.61,58.62,57.91,26.25,25.89.

实施例3

本发明的聚集诱导荧光发射增强的目标物7(实例中R₁、R₂、R₃＝H、R₄＝C₆)的合成，合成路线如下：

化合物1的合成：分别称取4-甲酰基吡啶(1.06g,10mmol)和苯胺(0.91ml，10mmol)溶解在100mL冰醋酸当中，室温搅拌一小时。苯偶酰(2.1g，10mmol)和醋酸铵(3.55g，46mmol)顺序加入到反应体系中，化合物在120℃条件下反应过夜，反应结束后反应体系倒入到300mL冰水中，用0.1mmol/L的氢氧化钠溶液调解体系pH至中性，混合物过滤用水洗三遍，真空干燥后硅胶柱层析分离纯化得到产物。产率为42％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ):8.48–8.47(d,J＝2H),7.58-7.60(d,J＝2H),7.31-7.35(m,4H),7.22-7.29(m,7H),7.13-7.14(d,2H),7.09-7.10(d,2H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl3,δ):149.71,143.84,139.20,137.78,136.65,133.96,132.46,131.05,130.00,129.48,129.01,128.47,128.34,128.30,128.27,127.32,126.97,122.32.HRMS(ESI)m/z:计算值C₂₆H₁₉N₃,373.1579[M]；发现374.1651[M+H]⁺.

化合物6的合成：称取化合物1(0.19g,0.50mmol)和化合物1,6-二溴己烷(0.12g,0.50mmol)溶解在15mL乙腈中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流10小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物6。产率为54％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆,δ):8.91-8.93(d,2H),7.79-7.80(d,2H),7.49-7.54(m,7H),7.28-7.37(m,8H),4.46-4.50(t,2H),3.51-3.54(t,2H),1.78-1.91(m,2H),1.78-1.81(m,2H),1.24-1.43(m,4H)；¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆,δ):143.36,142.41,138.93,138.61,134.80,134.32,131.90,129.74,129.00,128.78,128.08,127.67,127.51,127.35,127.29,126.35,125.36,122.40,58.74,33.83,30.66,30.14,25.66,23.30.

化合物7的合成：称取化合物6(110mg，0.21mmol)溶解在10mL吡啶溶液中，室温充分搅拌，反应体系在90℃充分回流8小时，TLC板监测反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，硅胶柱层析分离得到产物3。产率为53％。核磁共振分析结果为：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆,δ):9.29-9.30(d,2H),9.10-9.12(d,2H),8.61-8.65(t,1H),8.16-8.20(t,2H)7.77-7.79(d,2H),7.49-7.53(m,7H),7.26-7.37(m,8H),4.76-4.80(t,2H),4.65-4.69(t,2H),1.91-1.98(m,4H)；¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆,δ):145.13,144.56,144.34,143.21,139.78,139.43,135.62,135.15,132.74,130.58,129.85,129.62,128.91,128.52,128.33,128.19,128.11,127.71,127.17,126.18,123.15,59.97,59.24,29.97,29.65,24.24,24.20.

实施例4

荧光有机纳米探针的制备：

用移液枪取20μL化合物7(1mM)的二甲亚砜溶液，超声条下中加入到2mL的磷酸缓冲溶液(10mM，pH＝7.4)中使化合物3的最终浓度为10μM。室温条件下搅拌30min体系有乳光产生，为了验证其纳米聚集行为，动态光散射实验测定其平均粒径为101nm，如附图1所示。

实施例5

制备的荧光纳米探针的投射电子显微镜(TEM)测试：

吸取一滴实施例4中所制备的溶液，滴于铜网上，用滤吸干水分，自然晾干，置于投射电镜中进行观察。投射电镜图片如附图2所示。

实施例6

荧光纳米探针的荧光强度与白蛋白浓度的线性关系：

向实施例4中所制备的体系中分别加入10μL的白蛋白溶液液，使白蛋白的最终浓度分别达到，1.5μM、3.0μM、4.5μM、6.0μM、7.5μM、9.0μM、10.5μM、12.0μM、13.5μM、15.0μM、18.0μM、21μM。所有测试溶液配制完成后，利用涡旋仪使其混合均匀。室温孵育1min后测量其在480nm处的荧光发射强度。所得结果如附图3所示，体系中480nm的荧光强度与白蛋白的浓度在0–15μM之间具有很好的线性关系。

实施例7

荧光纳米探针对白蛋白检测的选择性：

使用实施例4中所制备的溶液作为荧光纳米探针，并评价该探针对白蛋白的选择性，该纳米探针的激发波长为380nm。该体系中化合3的浓度为10μM，分别向该体系加入白蛋白使其浓度为15μM，以及5倍摩尔当量的胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、免疫球蛋白、葡萄糖氧化酶、组氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、赖氨酸、谷胱甘肽、ATP、葡萄糖混合充分后，室温孵育1min后，测其荧光发射光谱并记录480nm处荧光发射的强度。结果如附图5所示，只有加入白蛋白的体系中产生强的蓝绿色荧光，而加入其它物种的溶液中几乎观察不到蓝绿色荧光。上述结果表明，该荧光有机纳米粒检测白蛋白具有良好的选择性和实际应用性。

最后，特别需要说明的是，以上举例仅是本发明的若干具体实施例。本发明显然不限于以上实例，本领域的相关技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。