一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法与流程

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种微生物一步发酵转化生产地塞米松环氧水解物(即8DM)的方法。

背景技术：

地塞米松环氧水解物（即8DM）是一种非常重要的医药中间体，市场需求量巨大，作为起始原料可用于合成地塞米松（Dexamethasone ）、氟米松、糠酸莫美松等多种高端糖皮质激素等药物。地塞米松是临床上应用广泛的糖皮质激素类药物，具有抗炎、抗过敏和抑制免疫等多种药理作用，主要用于胶原性疾病，如风湿性关节炎、红斑性狼疮、风湿性心脏病、心肌炎等，还可用于垂危病人的抢救。

地塞米松环氧水解物（即8DM）的CAS号为：24916-90-3，其结构式如下所示：

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目前国内生产地塞米松常用的起始原料以双烯衍生物霉菌氧化物为主，或其后续中间体如奥氏氧化物、甲基四烯物等。在经过C₁₁位消除和C_1，2位脱氢得到霉菌脱氢物后，经C₁₆位甲基化、侧链上碘置换得到地塞米松中间体，再经过溴羟环氧等反应得到8DM。比如公开号为CN101979399A的中国发明申请公开了一种以霉菌脱氢物制备甲基四烯物的方法；又如公开号为CN101397320A的中国发明申请公开了一种以甲基四烯物制备地塞米松的方法，这两种方法的起始物料都来源于双烯衍生物，8DM是其中的一个中间产物，由于双烯价格上涨导致霉菌氧化物、霉菌脱氢物等中间体的价格大幅上升，因此以上述工艺生产出的8DM生产成本偏高。

随着植物甾醇微生物转化技术的发展，4AD、9a-OH-AD等甾醇衍生物均实现了工业化生产，市场价格远低于薯蓣皂素衍生物双烯。以9a-OH-AD制备8DM的工艺路线具有路线短、成本低的双重优势，已实现了产业化推广。具体反应步骤如下：

上述制备方法中从中间体I(16a-甲基-9,11-环氧-17α，21-二羟基孕甾-4烯-3,20-二酮-21醋酸酯)制备8DM是分两步进行的，即C_1、2位脱氢和C₂₁位水解反应。现有技术的C_1、2位脱氢是采用单一的简单节杆菌进行生物转化完成的，由中间体I先转化为8DM醋酸酯，投料浓度在10~15g/L的情况下生物转化率约为80%~90%，8DM醋酸酯重量总收率在85~87%之间；脱氢后采用化学方法进行C₂₁位醋酸酯水解制备8DM，水解反应的重量总收率约为82%。另外每一步反应都存在提取、精制、烘干、包装等工序，生产周期长，设备投入多，生产过程收率损失大。两步合并重量收率计算：8DM的一次收率60%左右，总收率约为70%。

技术实现要素：

针对上述现有技术存在的不足和缺点，本发明旨在提供一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法，该方法可以一锅法连续发酵制备地塞米松环氧水解物（又称8DM，即16a-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-9,11-环氧-3,20-二酮），简化现有技术中8DM的制备工艺，提高投料浓度到30g/L，同时也解决生物转化率低的问题，提高8DM的一次收率和总收率。

具体说来，发明人提供如下的技术方案：

一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法，所述的地塞米松中间体是指地塞米松环氧水解物（即8DM），该方法包括如下步骤：

（1）菌种培养

将简单节杆菌(Arthrobacter simplex，ATCC6946）和巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) 的斜面培养物分别做摇瓶种子培养，得到简单节杆菌种子培养液和巨大芽孢杆菌种子培养液，备用；

（2）发酵转化

将步骤（1）得到的简单节杆菌种子培养液接入已灭菌的发酵培养基中，接种量为10~15%；随后将巨大芽孢杆菌种子培养液接入发酵培养基中，接种量为1~5%，于温度30±1℃下培养18~24hr后投入底物中间体I，在转化温度为33±1℃下继续培养，至底物中间体I含量≤1.0%（HPLC面积归一化法）；

（3）提取、精制

发酵转化结束后，发酵液灭活后冷却到室温，抽滤得到滤饼，用二氯甲烷和甲醇的混合溶剂反复萃取滤饼，萃取液加活性炭脱色过滤后，滤液浓缩至干得到8DM粗品，再经精制得到8DM精品。

研究发现，与单一采用简单节杆菌发酵做脱氢比较，本发明采用的简单节杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌种，利用简单节杆菌产生的脱氢酶和巨大芽孢杆菌产生的醋酸酯水解酶，在发酵转化中发挥协同作用，将脱氢、水解两步反应合并为一步，直接得到产物地塞米松环氧水解物即8DM。由于C₂₁位醋酸酯水解后会增加底物的溶解性，因此底物转化更彻底，生物转化率可达到95%以上，产物一次收率更高，生产成本更低。另外，不同于传统投料方式的是，本发明的投料过程不使用有机溶剂；同时本发明的方法将原来现有技术中的一步发酵、一步化学合成两步反应合并为一步生物转化完成，使生产操作更为简便。本发明的生产工艺是目前生产8DM的最经济、简便及环保的方法。

简单来说，本发明的方法是以地塞米松置换物（即中间体Ⅰ）为底物，经简单节杆菌和巨大芽孢杆菌混合发酵直接生产8DM，本发明的反应路线如下：

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本发明产物的结构确认图谱见图4-19。

作为优选，所述的步骤（1）中摇瓶种子培养是指将简单节杆菌或巨大芽孢杆菌的斜面培养物接种于种子培养基中，于转速为160~180rpm和温度为30±1℃条件下培养18~30hr。

作为优选，所述的步骤（1）中摇瓶种子培养中采用的种子培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2。

作为优选，所述的步骤（2）中发酵培养基配比为：葡萄糖5g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L 、水1L、pH7.0~7.2。

作为优选，所述的步骤（2）中投入粉碎细度在80目以上的底物中间体I，底物投料浓度不超过30g/L。

作为优选，所述的步骤（3）中：发酵液于温度85~95℃下灭活。

作为优选，所述的步骤（3）中：滤饼用15~20倍（重量比）的二氯甲烷和甲醇混合溶剂反复萃取滤饼，其中，二氯甲烷和甲醇混合比例为4:1（体积比）。

作为优选，所述的步骤（3）中的精制按下述方法操作：将8DM粗品用二氯甲烷和甲醇混合溶剂全溶后，常压浓缩至无二氯甲烷，继续减压浓缩至甲醇剩余1~1.5倍量，冷却到25℃以下离心或抽滤，重复精制若干次后得到白色晶体，即为8DM精品（HPLC含量在98.5%以上）。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明通过采用简单节杆菌和巨大芽孢杆菌的混合菌种，实现了一步微生物转化发酵制备8DM，使水解脱氢的转化率能达到95%以上。

（2）相对于脱氢与水解两步反应分别进行的现有技术，本发明以中间体I制备8DM的总收率可达到76%以上，提高近5个百分点；一次收率可达到70%以上，提高近10个百分点。

（3）本发明使脱氢与水解反应在同一个发酵体系中同步进行，减少了一步化学反应也减少了一步中间提取过程，降低了能耗，提高了生产效率。

附图说明

图1是本发明生物转化结束时8DM 的HPLC检测图谱。

图2是本发明得到的8DM精品HPLC检测图谱。

图3是现有方法（比较例1）生物转化结束时HPLC检测图谱。

图4-图19是本发明8DM产品结构确认图谱。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

主要原料说明：

简单节杆菌(Arthrobacter simplex，ATCC6946)，购于美国模式培养物集存库(ATCC)；

巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，XL1501)，自行分离得到。

实施例1：

一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法，所述的地塞米松中间体是指地塞米松环氧水解物（即8DM），包括以下步骤：

（1）菌种培养

将简单节杆菌斜面培养物接种于200ml种子培养基中，采用的种子培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上160rpm、30±1℃培养30hr；

将巨大芽孢杆菌斜面培养物接种于另外一瓶200ml种子培养基中，采用的种子培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上160rpm、30±1℃培养30hr；

（2）发酵转化

在5L三角摇瓶中配制2000ml发酵培养基，发酵培养基配比为：葡萄糖5g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L 、水1L、pH7.0~7.2，灭菌后冷却至室温。分别取简单节杆菌种子培养液200ml（接种量10%）、巨大芽孢杆菌种子培养液20ml（接种量1%）接入2L已灭菌的发酵培养基中，将接种后的发酵培养基置于摇床上，30±1℃、180rpm培养22hr。加入粉碎好的中间体I 60g（投料浓度30g/l）开始转化，转化温度33±1℃，摇床转速180rpm，转化时间78hr。取样HPLC分析（面积归一化法），8DM含量95.6%，8DM醋酸酯含量1.7%，中间体I含量0.5%。

（3）提取、精制

发酵液90℃灭活后冷却到25℃，抽滤得到滤饼，用1000ml二氯甲烷/甲醇（4:1）混合溶剂反复萃取滤饼，收集萃取液加6g活性炭加热回流30分钟，过滤后浓缩至干，得到浅黄色8DM粗品，干燥后的8DM粗品用二氯甲烷/甲醇（4:1）混合溶剂全溶后，常压浓缩至无二氯甲烷，继续减压浓缩至甲醇剩余1倍量，冷却到25℃以下抽滤，重复精制4次得到白色晶体8DM精品，干燥后称重41.83g（HPLC检测纯度为99.0%，单个杂质均小于0.3%）。母液浓缩后得到8DM母液结晶3.76g，一次收率69.72%，总收率76.13%。

实施例2

一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法，所述的地塞米松中间体是指地塞米松环氧水解物（即8DM），包括以下步骤：

（1）菌种培养

将简单节杆菌斜面培养物接种于400ml种子培养基中，种子培养采用的培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上170rpm、30±1℃培养24hr。

将巨大芽孢杆菌斜面培养物接种于200ml种子培养基中，种子培养采用的培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上170rpm、30±1℃培养24hr。

（2）发酵转化

在5L三角摇瓶中配制2000ml发酵培养基，发酵培养基配比为：葡萄糖5g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L 、水1L、pH7.0~7.2，灭菌后冷却至室温。分别取简单节杆菌种子培养液300 ml（接种量15%）、巨大芽孢杆菌种子培养液 60 ml（接种量3%）接入600ml已灭菌的发酵培养基中，将接种后的发酵培养基置于摇床上，30±1℃、180rpm培养 18 hr。加入粉碎好的中间体I 60g（投料浓度30g/L）开始转化，转化温度33±1℃，摇床转速180rpm，转化74hr。取样HPLC分析（面积归一化法），8DM含量96.2%，8DM醋酸酯含量1.5%，中间体I含量0.3%。

（3）提取、精制

发酵液90℃灭活后冷却到25℃，抽滤得到滤饼，用1000ml二氯甲烷/甲醇（4:1）混合溶剂反复萃取滤饼，收集萃取液加6g活性炭加热回流30分钟，过滤后浓缩至干，得到浅黄色8DM粗品，干燥后的粗品用二氯甲烷/甲醇（4:1）混合溶剂全溶后，常压浓缩至无二氯甲烷，继续减压浓缩至甲醇剩余1倍量，冷却到25℃以下抽滤，重复精制4次得到白色晶体8DM精品，干燥后称重42.13 g（HPLC检测纯度为98.9 %，单个杂质均小于0.3%）。母液浓缩后得到8DM母液结晶3.90g，一次收率70.2%，总收率76.7%。

实施例3

一种微生物一步发酵转化制备地塞米松中间体的方法，所述的地塞米松中间体是指地塞米松环氧水解物（即8DM），包括以下步骤：

（1）菌种培养

将简单节杆菌斜面培养物接种于400ml种子培养基中，种子培养采用的培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上30±1℃下于170rpm培养18hr。

将巨大芽孢杆菌斜面培养物接种于200ml种子培养基中，种子培养采用的培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上30±1℃下于170rpm培养18hr。

（2）发酵转化

在5L三角摇瓶中配制2000ml发酵培养基，发酵培养基配比：葡萄糖5g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L 、水1L、pH7.0~7.2，灭菌后冷却至室温。分别取简单节杆菌种子培养液300 ml（接种量15%）、巨大芽孢杆菌种子培养液 100ml（接种量5%）接入2000ml已灭菌的发酵培养基中，将接种后的发酵培养基置于摇床上，30±1℃、180rpm培养24hr。加入粉碎好的中间体I 60g开始转化，转化温度33±1℃，摇床转速180rpm，转化72hr。取样HPLC分析（面积归一化法），8DM含量96%，8DM醋酸酯含量1.1%，中间体I含量0.4%。

（3）提取精制

发酵液90℃灭活后冷却到25℃，抽滤得到滤饼，用1000ml二氯甲烷/甲醇（4:1））混合溶剂反复萃取滤饼，收集萃取液加6g活性炭加热回流30分钟，过滤后浓缩至干，得到浅黄色8DM粗品，干燥后的粗品用二氯甲烷/甲醇（4:1））混合溶剂全溶后，常压浓缩至无二氯甲烷，继续减压浓缩至甲醇剩余1倍量，冷却到25℃以下抽滤，重复精制 4次得到白色晶体8DM精品，干燥后称重42.1g（HPLC检测纯度为99.3%，单个杂质均小于0.3%）。母液浓缩后得到8DM母液结晶3.5g，一次收率70%，总收率76%。

比较例1

一种地塞米松中间体的方法，所述的地塞米松中间体是指地塞米松环氧水解物（即8DM），包括如下步骤：

（1）菌种培养

将简单节杆菌斜面培养物接种于400ml种子培养基中，采用的摇瓶种子培养基配比为：葡萄糖12g/L、酵母浸粉10g/L、KH₂PO₄ 1g/L、pH7.0~7.2，在摇床上30±1℃下于170rpm培养28hr。

（2）发酵转化

在5L三角摇瓶中配制2000ml发酵培养基，发酵培养基配比：葡萄糖5g/L、玉米浆10g/L、蛋白胨1g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L 、水1L、pH7.0~7.2，灭菌后备用。取简单节杆菌种子培养液300 ml(接种量15%)接入2000ml已灭菌的发酵培养基中，将接种后的发酵培养基置于摇床上，30±1℃、180rpm培养18hr。加入粉碎好的中间体I共30g（投料浓度15g/L），同时加入1.2ml的95%乙醇溶液开始转化，转化温度33±1℃，摇床转速180rpm。转化76hr，取样HPLC分析(面积归一化法)，8DM含量1.4%，8DM醋酸酯含量82.8%，中间体I含量14%。继续转化12hr,取样检测结果：8DM含量1.6%，8DM醋酸酯含量83.8%，中间体I含量12.6%。

（3）提取

发酵液90℃灭活后冷却到25℃，抽滤得到滤饼，用1000ml二氯甲烷/甲醇（4:1））混合溶剂反复萃取滤饼，收集萃取液加6g活性炭加热回流30分钟，过滤后浓缩至干，得到8DM醋酸酯粗品，烘干后总重量25.8g。

（4）水解

取全部8DM醋酸酯粗品25.8g，加入800ml甲醇，67℃回流30分钟后，滴加10%的亚硫酸氢钠溶液约60ml，保温反应2小时；加冰醋酸8ml、水80ml搅拌30分钟终止水解反应。浓缩后离心出料，干燥后得8DM粗品21.7g。HPLC检测结果：8DM含量85.1%，8DM醋酸酯含量0.2%，中间体I含量0.2%（中间体I醋酸酯水解物12.3%）。

（5）精制

取全部8DM粗品，用二氯甲烷/甲醇（4:1））混合溶剂全溶后，常压浓缩至无二氯甲烷，继续减压浓缩至甲醇剩余1倍量，冷却到25℃以下抽滤，重复精制 11次得到白色晶体8DM精品，干燥后称重18.1g（HPLC检测纯度为99%，单个杂质均小于0.3%）。母液浓缩后得到8DM母液结晶2.6g，一次收率60.3%，重量总收率69%。

工业实用性

本发明以中间体I（即16a-甲基-17α,21-二羟基孕甾-4烯-9,11-环氧-3,20-二酮-21醋酸酯）为原料，采用简单节杆菌和巨大芽孢杆菌混合菌种，一步发酵生产地塞米松中间体—8DM(即16a-甲基-17α,21-二羟基孕甾-1,4-二烯-9,11-环氧-3,20-二酮)，使脱氢与水解反应能同时进行。本发明发酵投料浓度可以达到30g/L，8DM生物转化率在95%以上，其一次收率（按重量计算）约70%，总收率（按重量计算）在76%以上。

现有方法（即比较例1所示）以中间体I为原料制备8DM，需先经过脱氢制备8DM醋酸酯、再经过水解反应得到。发酵投料浓度为15~20g/L，8DM醋酸酯的生物转化率约为85%，水解后制备8DM的一次收率约60%，总收率约70%左右。

综上比较，本发明以16a-甲基-17α,21-二羟基孕甾-4烯-9,11-环氧-3,20-二酮-21醋酸酯为原料，生产地塞米松中间体—8DM，比传统的两步生产法，在生物转化率、收率和成本上更具有优势。