一种酸性磷酸酯酶基因AP4的克隆表达及应用的制作方法

本发明涉及一种酸性磷酸酯酶基因(AP4)的克隆表达，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质及在水解磷矿石粉中的应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：酸性磷酸酯酶(Acidphosphatase，EC3.1.3.2，AcPase)是能够水解磷酸单酯键断裂生成Pi和相应脂肪酸的一类酶。酸性磷酸酯酶通过催化磷蛋白的水解参与生物磷代谢及其调节，在细胞中是能量转换和信号传导等生命活动的重要酶类。1991年，Williamson等发现抗线虫类番茄的第一个AcPase基因；LiuJ等发现了由cDNA编码运输AcPase的基因；MillerS等报道了编码的分泌AcPase基因；T.shinano等也发现了洋葱鳞片细胞中由AcPase编码的PEP磷酸酯酶基因，ZhangC等提纯出三叶草根细胞壁中的四种AcPase同工酶。近些年国内外己对一些动植物酸性磷酸醋酶也进行了研究，如对虾，草鱼文昌鱼，刺参，背角无齿蚌，小麦等；微生物中的研究主要是在大肠杆菌和酵母上；在动物组织细胞主要集中在珍珠贝，淡水锅牛，小鼠，公猪的生殖腺，人类前列腺、肝脏、血浆等。AcPase普遍存在于植物中，如根和根的节结，块茎，鳞茎，种子，胚芽鞘，叶子，幼芽和子叶等都有存在，该酶在植物体内可以分解有机磷化合物，促进磷的再吸收和利用，体外可以对土壤中有机磷进行分解以供根系吸收。TurnerWL等在香蕉果实中测得的最适pH为5.8，GranjeiroPA等研究蓖麻子AcPase的最适pH是5.5，MiernykJA以玉米胚乳为试材，测得AcPase最适为5.5，最适温度为50°；GellatlyKS等测定马铃薯块茎的AcPase最适pH是5.8，张剑铭等通过氟化钠对大豆AcPase进行研究，得到的AcPase最适pH为5.6，最适温度为37℃。费美娟等对小麦叶片AcPase的生化性质研究得到其最适pH是6.8，最适作用温度为45°；董登峰等研究大豆叶片的得到其最适pH4.8，温度在60°以下都保持有较高酶活。酸性磷酸酯酶通过水解底物生成磷酸盐，这对大多植物来说是非常必要的，因为磷是植物生长所必须的元素，是植物花芽分化及形态形成时结构物质的必要构成，农业生产上采用在花芽分化前增施磷肥可促进成花，然而磷素在早期就容易缺乏，且植物无明显缺素症状，使得生产中会出现植物的营养生长不良等现象。对于磷酸盐吸收受限，细胞就会通过磷酸酯酶将核酸、磷酸化糖、有机磷化合物及蛋白质等水解，从而使有机体满足磷酸盐的需要。因此，大多植物受到磷营养胁迫时，磷酸酯酶活性增强，作为磷酸酯酶的竞争性抑制在体内调节磷酸水平至关重要。磷酸酯酶可水解已代谢的磷酸酯类物质，释放的又可以转移到胞质再次参与细胞代谢。本发明从贵州磷矿上生长的植物根际筛选产磷酸酯酶的细菌，并对其基因组序列进行对比分析。并利用大肠杆菌工程菌异源表达酸性磷酸酯酶基因以验证其活性，分离纯化重组酸性磷酸酯酶酶并对其酶学性质进行研究。技术实现要素：本发明目的在于提供一种高活性的酸性磷酸酯酶(AP4)，并利用大肠杆菌工程菌对其进行异源表达，公开了相关的酶学性质，并对其进行了部分应用。1菌株本发明从贵州磷矿上生长的植物根际筛选产磷酸酯酶的细菌BacillusamyloliquefaciensYP6(YP6,Accession：KP326355.1)。2酸性磷酸酯酶基因(AP4)的克隆表达提取BacillusamyloliquefaciensYP6的全基因组DNA，设计酸性磷酸酯酶基因的特异性引物，扩增出酸性磷酸酯酶全长编码框序列，并构建重组序列。3酸性磷酸酯酶基因的表达及纯化将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达，菌体破碎后得到粗酶液经Ni柱纯化后备用。4磷酸酯酶酶学性质以磷酸苯二钠为底物研究pH对酸性磷酸酯酶活性的影响。以磷酸苯二钠为底物研究温度对酸性磷酸酯酶活性的影响。以磷酸苯二钠为底物研究金属离子Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Ni2+，Co2+对酸性磷酸酯酶活性的影响。底物动力学参数，所用底物为磷酸苯二钠及对硝基磷酸苯二钠(pNPP)。1)以磷酸苯二钠为底物酶活测定方法为：柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝5.0。0.02mol/L磷酸苯二钠溶液称取磷酸苯二钠2.18g，加入煮沸的400mL蒸馏水中，使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水定容至500mL，再加氯仿2mL，置冰箱保存。铁氰化钾溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17.0g，分别溶于400mL蒸馏水中，二液混合后，加蒸馏水定容至1000mL，置棕色瓶中避光保存。将100μL纯化后的酶液加入1mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中40℃保温5min,再加入已预热的磷酸苯二钠溶液1mL,在40℃下反应15min，然后加入铁氰化钾溶液3mL，显色并终止反应，在分光光度计510nm下测定，重复3次。酶活定义：最适条件下，每分钟催化磷酸苯二钠转化1μmol产物为一个酶活单位。2)以对硝基磷酸苯二钠为底物酶活测定方法为：0.25mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH＝5.0)补足蒸馏水至0.8mL，加入0.03mL酶液，40℃预热5min，加入0.2mL底物反应30min，加入0.5mL1MNaOH终止反应，在405nm处测吸光值。酶活定义：最适条件下，每分钟催化pNPP转化1μmolp-NP为一个酶活单位。5酸性磷酸酯酶在水解磷矿石粉中的应用利用重组菌株发酵磷矿石粉，测定其解磷能力。具体实施方式下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。一般性说明：实施例所涉及的酶均购自TaKaRa公司，质粒试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海生物工程有限公司，操作完全按照相应说明进行。引物合成与质粒测序由上海桑尼公司完成。实施例1本实施例为本发明所述的酸性磷酸酯酶基因的克隆及大肠杆菌工程菌的构建1BacillusamyloliquefaciensYP6全基因组抽提将BacillusamyloliquefaciensYP6菌株接种于3mLLB培养基培养12h，12000r/min离心10min得到菌体，利用细菌基因组DNA抽提试剂盒按步骤得到全基因组备用。2大肠杆菌感受态制备从LB平板上分别挑取DH5α和BL21(DE3)单菌落,接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。将该菌悬液以1:100的比例接种于50mLLB液体培养基中，37℃振荡培养2.5小时至OD600＝0.5。细菌培养液冰浴5分钟后，4℃5000r/min离心5min。用预冷的去离子水洗涤沉淀，4℃5000r/min离心5min。沉淀加入2ml预冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，轻吹散，冰浴5分钟，4℃5000r/min离心min。沉淀加入2mL预冷的0.05mol/LCaCl2-15％甘油混合溶液，轻吹散，即成为感受态细胞悬液。分装成50μL的小份，贮存于-70℃可保存半年。3PCR扩增酸性磷酸酯酶基因1)引物设计根据BacillusamyloliquefaciensYP6的16SrDNA，与NCBI中已知的酸性磷酸酯酶基因的对比，设计引物为：S:5’-GCCGGGATCCATGAATAAAGTCCGTGTGCGTCTGTTCG-3’；A:5’-GCCGTCTAGATCACGCTTCCGGCTGCCGC-3’2)PCR扩增扩增体系为：PCR反应液组成(25μl)PremixTaq(ExTaqVersion2.0)25μlDNA模板1μlPrimerF1μlPrimerR1μl灭菌蒸馏水22μlPCR反应条件98℃10s，55℃30s，72℃2min，30个循环，最后保存于10℃中。PCR产物送华大基因测序后得到该酸性磷酸酯酶基因如SEQIDNO.1所示。3)双酶切和连接将pColdⅡ质粒与PCR产物进行双酶切，酶切体系为上述反应液在37℃反应1h后，经过核酸胶验证后进行割胶回收，回收产物再次进行核酸胶验证正确后进行pColdⅡ质粒片段与目的基因的连接。连接体系为：反应液在16℃过夜连接12h后，转入感受态。4)转化1.取DH5α感受态一管100μl，加入20μl上述连接反应液。2.冰浴30min。3.在42℃下反应90s，冰浴1min。4.加入LB培养基890ml，37℃下培养1h复壁。5.在12,000×g离心1min，取出900ml上清倒掉，剩余菌体和培养液混合均匀，涂布含Amp抗性的平板。6.挑选10个单菌落37℃倒置培养，进行菌落PCR验证并送去华大基因进行测序。菌落PCR方法如上所述，引物采用pColdⅡ上通用引物pCold-Fprimer和pCold-Rprimer。阳性重组子提取质粒导入BL21(DE3)感受态备用。实施例2本实施例为本发明所述的重组菌株的诱导表达1.将10μl重组菌株加入3mlLB培养基，加入3μl氨苄溶液，以空菌(原始菌BL21(DE3))和空载(转入pColdⅡ质粒)作对照，37℃，200rpm，培养12h。2.取上述种子液加入含50mlLB的三角瓶，加50μl氨苄溶液，培养2-2.5h，至OD600＝0.4-0.6，摇床调至15℃，静置30min。3.每瓶加入50μl0.5mol/L的IPTG20μl，以不加IPTG诱导作对照15℃培养24h。4.将菌液收集，4℃，8000rpm离心10min，弃上清，加入5ml磷酸缓冲液(pH＝7.0)重悬菌体，超声波破碎，破2s，停3s，30％功率，10min。5.离心取上清，4℃，8000rpm离心10min。6.测酶活及跑胶验证。将上述得到的粗酶液采用AKTAavant150蛋白纯化系统进行镍柱纯化，洗脱方法为将A1、A2、B1、B2、四根管路都放到水里，设置systemflow20ml/min进行排气。然后设置systemflow1ml/min、flowpath(columnposition3)、deltapressure0.5、Gradient0、insetA1，待水滴均匀流出后装镍柱，平衡10min后将A1放入结合液中，B1放入洗脱液中，再排气一次，平衡20min，然后上样粗酶液，用500mM的高浓度咪唑缓冲液B1梯度洗脱目的蛋白，将吸附在柱子上的蛋白洗脱下来手机有酶活的洗脱液备用。实施例3本实施例为本发明所述的酸性磷酸酯酶的最适pH及pH稳定性。以磷酸苯二钠为底物，在37℃的条件下，分别测定不同pH(3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,7.0,8.0,9.0,10.0)以及在各个pH下保存1h后的酶活，分别如图1，图2所示，可知该酸性磷酸酯酶的最适pH为5.0。实施例4本实施例为本发明所述的酸性磷酸酯酶的最适温度及温度稳定性。以磷酸苯二钠为底物，在pH＝5.0的条件下，分别测定不同温度(4,20,25,30,35,40,45,50,55,60,70,80℃.)以及在各个温度下保存1h后的酶活，分别如图3，图4所示。可知该酸性磷酸酯酶的最适温度为30℃。实施例5本实施例为不同金属离子(Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Cu2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+，Ni2+，Co2+)在不同浓度下对该酸性磷酸酯酶的影响，结果如图5所示，可知，Co2+、Mg2+和Mn2+对该酶有明显的促进作用，Fe3+和Fe2+有明显的抑制作用。实施例6本实施例为以磷酸苯二钠和pNPP为底物的动力学参数的测定在最适反应pH和反应温度下测定该酸性磷酸酯酶催化不同浓度的磷酸苯二钠和pNPP的反应速率，反应体系中含10mMMgSO4，参照Linewear-Burk双倒数作图法，计算Vmax和Km值，进而算出Kcat/Km值。如图6所示，可知在以磷酸苯二钠和pNPP为底物的条件下，该酸性磷酸酯酶均表现出很高活性。实施例7本实施例为酸性磷酸酯酶AP4水解磷矿石粉的应用重组菌株制成种子液以3％的比例加入含1％磷矿石粉的LB培养基中，30℃，200r/min，发酵培养3d，取发酵液离心后上清用钼酸铵比色法测定其水解能力为57.2ug/mL。附图说明图1：最适pH(摘要附图)图2：pH稳定性图3：最适温度图4：温度稳定性图5：不同金属离子对碱性磷酸酯酶活性的影响图6：以磷酸苯二钠和pNPP为底物动力学参数。SEQIDNO.1ATGAATAAAGTCCGTGTGCGTCTGTTCGCTTTACTCGTTGTATGTATCATATTGGTTTTCAGTGTTCTCGGCCTTTTTCTACAGCAGCTTATTTCTTCATCTGCTAAAGAAAGAACGGCGGATTAGCTAAAAAAGGAAGCGGTATACATAGCGGGCCTTCTTGACACCGGCTGAATCGGCAATAAAAGCAATGACACGGTGATTCACGACGCCGGCCGCACCCTCGGTATAAACGTCTCCGTGCTTAATGAGAAGGGTGACACCGTATATCATTCCGGCAGTCATGCCGATGATTCAGCCGTAAAGGAGTTCATGTCTCACAATAAAAATGAGGCGGCCATAGAGGCGAGAAGCAAAGTGATCCGTGGGACTGCCGTGAAAAATGACGCCGGGCAAACGGCGGGATATGTAGTCGTTTCTTCGGAGATCAACGGCGGTTCAAGCATCACCGGAGAAATGTGGGGCATGCTGGCGGCAAGTCTTTGTACCGCTTTTATCATTATCGTTTTCTTTTATACAAACATGACGTCCCGTTACAAAAAATCAATCGACGCCGCGACAAAAGTGGCGACGGAGCTGTCCAAAGGGAATTATGACGCCCGCTCCTACAGCGGTTACGCAAGGCGGTCGGACCGTCTCGGGCGTGCGATGAACAGTCTGGCGGTCGATCTGATGGAAATGACGAGAACGCAGGATATGCAGCGCGACCGTCTGTTAACCGTCATTGAAAATATCGGATCCGGTTTGATTTTAATAGACGGAAGAGGCTTTATTAATCTCGTGAACCGGTCGTACACGAAGCAGTTTCATACAAAGCCTGAACGTCTGCTTCGCCGCCTTTATCATGATGCGTTTGAGCATGAGGAAATTATTCGGCTTGTCGAAGATATATTTATGACGGAGACGAAAAAATGCCAGCTGCTCAGACTGCCCATCAACATTGAACGGCGGTACTTTGAAGTTGACGGCGTTCCGATTATGGGCCCTGATGATGAATGGAAGGGCATCGTTCTCGTCTTTCACGATATGACGGAAATTAAAAAATTGGAGCAGATAAGAAAGGACTTCGTCGCCAATGTCTCCCATGAACTGAAAACGCCGATCACCTCCATTAAAGGTTTTACGGAAACGCTGTTAGACGGGGCGATGAAAGACGATAAGGCGCTTTCAGACTTTCTTTCTATCATTCTGAAAGAAAGTGAACGGCTCCAATCGCTCGTGCAGGATTTATTGGATTTATCCAAAATGGAACAGCAAAACTTTACGATGCGTGTAGAATCCTTTGACGCCGCAAAAATTCTGCATGAAATTGAAGCGCTTTTGCAGCATAAGGCTGCGGAAAAAGGCATCAGCTTTGAGCTCGACCTCCCGGAAGAGCCGATATTTGTGACGGGTGATGCGCACAGGCTGAAGCAGGTATTTCTGAACTTGGCGAACAATGCTTTAACCTATACCCCTGAAAAAGGGACGGTGGGAATTTCGGTAAACGTGAAAGAAACTGTTGTCGATATCAAAGTGTCCGATACGGGAATCGGCATTCAGAAGGAAGAGATTCCGCGTATATTTGAGAGATTCTACCGTGTGGATAAAGACAGAAGCCGCAACTCAGGCGGAACGGGGCTCGGCCTCGCCATCGTAAAGCATTTAATAGAAGCCCATGAAGGCCATATCGAGGTCACAAGCGAACCGGGACAGGGGACTGTGTTTACCGTGACGCTGAAGCGGCAGCCGGAAGCGTGASEQIDNO.2MNKVRVRLFALLVVCIILVFSVLGLFLQQLISSSAKERTAD*LKKEAVYIAGLLDTG*IGNKSNDTVIHDAGRTLGINVSVLNEKGDTVYHSGSHADDSAVKEFMSHNKNEAAIEARSKVIRGTAVKNDAGQTAGYVVVSSEINGGSSITGEMWGMLAASLCTAFIIIVFFYTNMTSRYKKSIDAATKVATELSKGNYDARSYSGYARRSDRLGRAMNSLAVDLMEMTRTQDMQRDRLLTVIENIGSGLILIDGRGFINLVNRSYTKQFHTKPERLLRRLYHDAFEHEEIIRLVEDIFMTETKKCQLLRLPINIERRYFEVDGVPIMGPDDEWKGIVLVFHDMTEIKKLEQIRKDFVANVSHELKTPITSIKGFTETLLDGAMKDDKALSDFLSIILKESERLQSLVQDLLDLSKMEQQNFTMRVESFDAAKILHEIEALLQHKAAEKGISFELDLPEEPIFVTGDAHRLKQVFLNLANNALTYTPEKGTVGISVNVKETVVDIKVSDTGIGIQKEEIPRIFERFYRVDKDRSRNSGGTGLGLAIVKHLIEAHEGHIEVTSEPGQGTVFTVTLKRQPEA当前第1页1 2 3