一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒及其检测方法与流程

文档序号：11148141阅读：425来源：国知局

本发明涉及材小蠹属昆虫检疫鉴定技术领域，具体涉及一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒；本发明还涉及应用该试剂盒进行材小蠹属昆虫基因条形码检测的方法。

背景技术：

材小蠹属(非中国种)是中国进境植物检疫性有害生物,我国口岸多次检疫截获国外的材小蠹种类。其主要分布于亚热带和热带地区,是一类具有重要经济意义的林木蛀干害虫。国内外材小蠹的研究多数集中于形态学分类,有关该类群分子系统进化方面的研究还较少。

随着国际贸易与旅游业的发展以及气候变化等因素的影响，有害生物的传播风险加剧，生物安全已逐渐成为全球关注的重要问题。加强防控物种入侵首先要加强有害生物风险预测与监测，对口岸截获样品的准确快速鉴定是其中一项重要内容。分子鉴定的方法能实现外来有害物种的有效鉴定，DNA条形码的出现能够很好地应对检疫生物名录不断更新变化，国内国际分子鉴定的方法难以统一化、标准化的问题。Foottit 等(2008)对13属300种蚜虫研究，证明 DNA 条形码序列能够有效区分其中96% 的物种，种内的序列差异平均仅为 0. 2% ，对于入侵蚜虫物种的监测与防控具有重要意义；陈念和赵树进(2009)以毒蛾和果蝇为例综述并讨论了在入侵物种分子鉴定中，DNA 条形码的方法比物种特异性 PCR 或 PCR-RFLP 鉴定方法更具有可操作性，在成本、周期和稳定性方面具有明显的优势，认为 COⅠ条形码是对入侵昆虫准确和灵活鉴定的首选方法。但是关于材小蠹属昆虫的基于条形码快速检测技术研究，国内外相关报道并不多。因此，建立准确可靠的材小蠹属昆虫条形码检测技术，不仅能为材小蠹属昆虫的分类鉴定提供一种新的方法，还能对我国防范外来物种入侵、筑牢国门生物安全防线具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提出一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒，实现快速高效的检测材小蠹属昆虫。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供了一种利用前述试剂盒进行材小蠹属昆虫基因条形码检测的方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒，其特征在于：用于快速检测材小蠹属昆虫，该试剂盒包括基因条形码序列盘和引物试剂，所述的引物试剂的序列如下：

上游引物C1-J-2183：5,-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3,；

下游引物TL2-N-3014：5,-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3,；

所述基因条形码序列盘存有37条标准条码序列，其序列见基因序列表中序列3－序列39所示。

优选的试剂盒还包括下列试剂：Taqbuffer，MgC12，dNTPmix，TaqDNA聚合酶，ddH2O，DNA模板。

本发明试剂盒所述的引物试剂和其它试剂最好有10次以上的用量。

本发明所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒，所适用的小蠹属昆虫为12种，分别为：赤材小蠹、阔面材小蠹、单刻材小蠹、细点材小蠹、对粒材小蠹、伴随材小蠹、暗翅材小蠹、四粒材小蠹、北方材小蠹、伪材小蠹、双齿材小蠹和栗粒材小蠹。

本发明还公开了一种利用权利要求1所述的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒检测材小蠹属昆虫的方法，其特点是，该方法包括以下步骤：

（一）DNA的提取；提取步骤如下：

（1）将待检虫体放入适量蒸馏水中，适当晃动，将虫体内的酒精置换出来，然后将虫体置于吸水纸上吸干虫体体表的水分；

（2）将虫体放入离心管中，用小杵研磨；加入100μL pH8.3的CTAB分离缓冲液，研磨，再加入100μL上述分离液缓冲液中，继续研磨，直至研磨充分；

（3）加入200μL pH8.3的CTAB分离缓冲液，漩涡混匀，加入3μL 20mg/mL Pro-k，轻柔混和，55℃保温3-5小时，直到组织完全解体，离心管中液体清亮为止；

（4）13000rpm离心10分钟，取上清液置于离心管中；

（5）加等体积的25:24:1的酚：氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒十次，13000rpm离心5分钟，重复抽提1-2次，直至水相与有机相界面处几乎看不到白色的蛋白质为止；

（6）取上清液于新离心管，加入等体积-20℃异丙醇，颠倒混合沉淀DNA，-20℃冰箱沉淀过夜或-70℃冰箱放置1-2小时；形成白色絮状DNA沉淀；12000rpm离心10-20分钟；

（7）弃上清液；将沉淀用500μL -20℃的70%乙醇溶液清洗，10000 rpm离心5分钟，倾去液体，洗涤2次，将离心管倒置于吸水纸上晾干；

（8）沉淀晾干后，溶解于20-30μL的TE溶液中，-20℃保存；

（二）PCR反应条件与反应体系：

PCR反应总体积为50μL，含1U Taq聚合酶，反应缓冲液，2.5mmol/L MgCl2，0.25mmol/L dNTP，50ng 上游引物C1-J-2183，50ng TL2-N-3014TL2-N-3014，模板NDA为2 μL；

在200 μL的薄壁管中依次加入如上体系，混合均匀，置于PCR仪进行PCR反应，扩增条件如下：94℃变性45s，51℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；反应前94℃预变性3min，反应后72℃延伸5min；

（三）PCR结果判定：

扩增反应结束后，将PCR特异性扩增产物在1%琼脂糖胶上进行电泳检测；电泳结束后，将凝胶置于紫外分析仪上观察，并用凝胶成像仪拍照后记录结果；

照片显示材小蠹与标准DNA样品在450bp位置有清晰的扩增条带；即为目标条带；

（四）PCR产物测序获得基因序列，得到待测材小蠹测序的序列；

（五）材小蠹属昆虫基因比对：

将待测材小蠹测序得到的序列与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比对，结果按以下方式运行：

（1）与标准基因条码序列相似度100%，则认定其为该种类；

（2）没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将待测材小蠹基因序翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列比对计算遗传距离，与未知种类材小蠹基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类，即为目标种类；当遗传距离都大于2%，判定未知材小蠹种类不在此12种材小蠹范围内。

步骤（五）材小蠹属昆虫基因比对的优选技术方案是：没有与任何标准条码序列相似度达100%，则将待测材小蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸，与标准基因条码序列所对应的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离，与未知种类材小蠹基因序列遗传距离小于2%的标准基因条码种类，即为目标种类；当遗传距离都大于2%，判定未知材小蠹种类不在此12种材小蠹范围内。

步骤（三）PCR结果判定中优选的技术特征是：将PCR特异性扩增产物在含有0.5ug/mL EB Free的1%琼脂糖胶上进行电泳检测。

与现有技术相比，本发明提出的材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒，以及一种高效、准确、便捷的材小蠹属昆虫分子检测方法，可在分子水平将材小蠹属12种昆虫种类区分，并具有如下特点：

（1）操作简单，对物种分类鉴定知识缺乏的人也可以通过标准技术流程对材小蠹属物种进行鉴定；

（2）不受个体发育阶段和形态特征的限制，只要个体存在完整的目标DNA片段即可满足鉴定需求；

（3）目标基因足够短，仅为450bp，降低了实验对标本质量的需求，扩增效率高；

（4）种间变异大而种内变异小以区分不同物种；包含足够的系统进化信息以定位物种在分类系统中的位置。能满足使用需求。

附图说明

图1是部分引物C1-J-2183/ TL2-N-3014 PCR扩增结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1，一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒，包括基因条形码序列盘和10次用量以上的引物试剂引物序列如下：

上游引物C1-J-2183(5^,-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3^,)

下游引物TL2-N-3014(5^,-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3^,)

所述基因条形码序列盘存有37条标准条码序列，其序列见基因序列表中序列3－序列39所示，适用于下述12种材小蠹属昆虫检测：

表1材小蠹属种类名称

其配套组分，还包括10次用量以上的下列试剂：Taqbuffer，MgC1₂，dNTPmix，TaqDNA聚合酶，ddH₂O，DNA模板。

实施例2，材小蠹属昆虫基因条形码检测方法：

选取赤材小蠹、竹蠹、阔面材小蠹、双棘长蠹、单刻材小蠹、四粒材小蠹、栗粒材小蠹七份样品作为待检测样品。采用实施例1的试剂盒检测，步骤如下：

（1）DNA的提取：采用常规蛋白酶K消化法提取总DNA。提取步骤如下：

将虫体（处）放入适量蒸馏水中，适当晃动，将虫体内的酒精置换出来，然后将虫体置于吸水纸上吸干虫体体表的水分；将虫体放入1.5ml的离心管中，用特制的小杵快速研磨几下；加入100μL无毒CTAB分离缓冲液（PH8.3），研磨，再加入100μL上述分离液中，继续研磨，直至研磨充分；加入200μL CTAB分离缓冲液（PH8.3），漩涡混匀，加入3μL 20mg/ml Pro-k，轻柔混和，55℃保温3-5小时，直到组织完全解体，离心管中液体清亮为止；13000rpm离心10分钟，取上清液于新离心管中；加等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提，上下颠倒十次，13000rpm离心5分钟，重复抽提1-2次，直至水相与有机相界面处几乎看不到白色的蛋白质为止；取上清液于新离心管，加入等体积冰冷的异丙醇（预先置于-20℃冰箱内），颠倒混合沉淀DNA，-20℃冰箱沉淀过夜或-70℃冰箱放置1-2小时；形成白色絮状DNA沉淀；12000rpm离心10-30分钟，弃上清液；将沉淀用500μL -20℃冰冷的70%乙醇溶液清洗，10000rpm离心5分钟，小心倾去液体，洗涤2次，将离心管倒置于吸水纸上晾干；沉淀晾干后，溶解于20-30μL的TE溶液中，-20℃保存。

试验过程可以使用由V-gene biotechnology limited生产的基因组提取试剂盒。

（2）序列扩增与测定

PCR反应总体积为50μL，含1UTaq聚合酶，反应缓冲液，2.5mmol/L MgCl₂,0.25mmol/LdNTP, 50ng C1-J-2183, 50ngTL2-N-3014,模板NDA为2 μL。扩增条件如下：94℃变性45s,51℃退火1min,72℃延伸1min，共35个循环。反应前94℃预变性3min，反应后72℃延伸5min。扩增反应结束后，将PCR特异性扩增产物在含有0.5ug/mlEB Free的1%琼脂糖胶上进行电泳检测。电泳结束后，将凝胶置于紫外分析仪上观察，并用凝胶成像仪拍照后记录结果并分析。

电泳图，如图1所示，7个样品中（8为空白对照），5种材小蠹都扩增出450bp大小的条带，竹蠹、双棘长蠹未扩增出条带，排除的这两个种不在材小蠹昆虫之内，符合实际，排除准确。扩增出条带的产物以引物作为测序引物进行双向测序，由上海捷瑞生物科技有限公司采用常规技术完成。

（3）基因比对

利用现有的比对软件和计算机技术，未知种类材小蠹测序得到的序列结果与基因条形码序列盘中标准基因条码序列进行比较，结果按以下方式运行：

A:与标准基因条码序列相似度100％，则认定其为该种；

B:没有与任何标准条码序列相似度达，则将未知种类材小蠹基因序列按“无脊椎动物密码子”翻译为氨基酸，与标准基因条码的氨基酸序列使用“P-distance模型”计算遗传距离，与未知种类材小蠹基因序列遗传距离小于2％的标准基因条码种类，即为目标种类；如果遗传距离都大于2％，说明未知材小蠹种类不在此12种材小蠹范围内。

所得5条序列依次输入基因条形码序列盘进行计算比对，结果如下:

1.赤材小蠹序列与序列盘中赤材小蠹标准条码基因相似度为99％，与序列盘中赤材小蠹标准条码基因遗传距离0.4％，按结果认定规则认定为赤材小蠹，鉴定结果准确。

2. 阔面材小蠹序列与序列盘中阔面材小蠹标准条码基因相似度为100％，鉴定结果准确。

3. 单刻材小蠹序列与序列盘中单刻材小蠹标准条码基因相似度为98％，与序列盘中单刻材小蠹标准条码基因遗传距离0.6％，按结果认定规则认定为单刻材小蠹，鉴定结果准确。

4. 四粒材小蠹序列与序列盘中四粒材小蠹标准条码基因相似度为100％，鉴定结果准确。

5. 栗粒材小蠹与序列盘中栗粒材小蠹标准条码基基因相似度为100％，鉴定结果准确。

所有结果与供试的样本种类相符，结果符合要求，表明该试剂盒可以准确鉴定这5种材小蠹。

SEQUENCE LISTING

<110> 中华人民共和国连云港出入境检验检疫局

<120> 一种材小蠹属昆虫基因条形码检测试剂盒

<130> 2016

<160> 39

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物C1-J-2183

<400> 1

caacatttat tttgattttt tgg 23

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物TL2-N-3014

<400> 2

tccaatgcac taatctgcca tatta 25

<210> 3

<211> 533

<212> DNA

<213> 赤材小蠹（Xyleborus ferrugineus）

<400> 3

gcttcttttt tacctctttc ttgcctaatg atatgagaga ttataccaaa tcctggtaga 60

atgagaatgt atacttctgg gtggccaaag aatcagaata gatgttgata aaggattgga 120

tcacctcccc cggctgggtc aaagaaggat gtgttaatgt ttcgatctgt tagtaatata 180

gtgattcctc cagctaatac tggtaaggaa aggagaagta gaattgctgt aatctttaca 240

gcccaagtga agagggaaag ttgctcaggc tttatccctg aaggatgtat attaataatg 300

gtagagataa agttgatagc ccctaagatg gaggaaactc cagatatatg aagactaaaa 360

attgccaagt caattgatgc tccttcatga gcaatatttg cggctaaagg ggggtagaca 420

gttcaccctg tccctgctcc tttgtcaata attcttctta ttaataataa tgatagactt 480

ggcggaagaa gtcagaatct tatgttgtta agtcgtggga aagctaaatg tgg 533

<210> 4

<211> 556

<212> DNA

<213> 赤材小蠹（Xyleborus ferrugineus）

<400> 4

ctccaaaggc ttcttttttc ccgctttctt gtctaatgat atgggagatt atgccaaatc 60

ctggtagaat gagaatgtat acttctgggt gaccaaagaa tcaaaataag tgctgataaa 120

ggattgggtc ccctcctccg gctgggtcaa agaaggaggt gttaatattt cgatctgtta 180

gcaatattgt aattcctcca gctagaactg gcagggagag aagaagtagg attgctgtaa 240

tttttacggc tcaagtaaaa agggagagtt gttcaggctt tatgcctgtt gggtgcatat 300

taataatggt agaaataaag ttgatagccc ctaagatgga tgaaacccca gatatatgta 360

gactaaaaat agctaggtcg attgaagctc cttcatgggc aatgtttgca gctaaaggag 420

ggtagacggt tcatcctgtt cctgctcctt tatcaataat tcttcttatt agaaggagtg 480

ataggcttgg gggaaggagc cagaatctta tgttgtttag tcgcgggaat gctatgtctg 540

gtgctcctaa tattaa 556

<210> 5

<211> 556

<212> DNA

<213> 赤材小蠹（Xyleborus ferrugineus）

<400> 5

ctccaaaggc ttctttcttt ccactttctt gtctgatgat atgagagatt ataccaaatc 60

ctggtaaaat aagaatatat acttctggat gaccaaaaaa tcaaaatagg tgttgataaa 120

gaattgggtc ccctcctcct gctgggtcaa agaaggatgt gttaatgttt cggtctgtta 180

gtaatattgt gattcctcca gctagtactg gtaaagaaag aagaagtaga attgctgtga 240

tttttacagc tcatgtaaaa agggaaagtt gttcaggctt tattcctgtt gggtgtatat 300

taataatagt agaaataaag ttgatggctc ctaagatgga ggaaactcca gatatgtgaa 360

gactgaaaat tgctaaatcg attgatgctc cttcgtgagc gatgtttgcg gctaaaggcg 420

ggtaaacagt tcaacctgtt cctgcgcctt tgtcaataat tcttcttatt aataagagtg 480

atagtctggg gggaaggagc caaaatctta tgttgttaag tcgtggaaaa gctatatctg 540

gcgctcctag cattaa 556

<210> 6

<211> 542

<212> DNA

<213> 赤材小蠹（Xyleborus ferrugineus）

<400> 6

tttttacctc tttcttgtct aataatatgg gagattatac caaatcctgg taggattaga 60

atatatactt ctgggtgacc aaagaatcaa aatagatgtt gataaagaat tggatctccc 120

cctccggctg ggtcaaagaa ggatgtgttg atgtttcgat ctgtcagtaa tattgtaatt 180

cctccagcta gtactggtaa agaaagaaga agtagaattg ctgtaatttt cacagctcag 240

gtgaaaaggg aaagttgctc aggcttcatt cctgaggggt gtatattaat aatggtagag 300

ataaagttga tagcccctag gatggaagag accccagaca tgtgaagact aaaaattgct 360

aaatcgattg atgctccttc gtgagcaata tttgcggcta atgggggata aacggttcat 420

cctgtccctg ctcctttgtc gataattctt cttattaata atagtgatag gcttggtgga 480

agaagtcaaa atcttatgtt gttaagtcgt gggaatgcta tatctggtgc ccctagtatt 540

aa 542

<210> 7

<211> 544

<212> DNA

<213> 赤材小蠹（Xyleborus ferrugineus）

<400> 7

tttttttacc tctttcttgt ctaatgatat gagagattat accaaatcct ggtaaaataa 60

gaatatatac ttctggatgg ccaaaaaatc aaaatagatg ttgataaaga attgggtccc 120

caccccctgc tgggtcaaag aaggatgtgt taatgtttcg gtctgttagt aatattgtga 180

ttccaccagc tagtactggt aaagaaagaa ggagtagaat tgctgtaatt tttacagctc 240

atgtaaaaag ggaaagttgc tcgggcttta ttcctgttgg gtgtatatta ataatagtag 300

aaataaagtt gatggcccct aggatggagg aagctccaga tatgtgaaga ctaaaaattg 360

ctaaatcgat tgatgcccct tcatgggcaa tgtttgcggc taaaggtgga taaacagttc 420

aacctgttcc tgcgcctttg tcaataattc ttcttattaa taagagtgac agtctggggg 480

gaaggagtca aaatcttatg ttgttaagtc gtggaaatgc tatatctggt gctcctagca 540

ttaa 544

<210> 8

<211> 629

<212> DNA

<213> 阔面材小蠹（Xyleborus validus）

<400> 8

cctacaggaa ttaaaatttt tagttgatta gcaacctacc atggaacaca aatcaatcca 60

aatccatcat ctctttgagc cctaggattc ctattcctat ttaccatagg aggattaaca 120

ggagtagttt tagccaattc ttctcttgat attattttac atgatactta ctacgtggtt 180

gcacatttcc actatgtttt atctataggg gcagtattcg ctattatagc aggcttagta 240

caatgattcc cattatttac aggactaacc ttaaataata aatatctgaa aacccaattt 300

atctctatat ttattggagt aaatttaaca ttcttccctc aacatttctt aggactaagt 360

ggtataccac gacgatattc agattatcct gacgcatata tcatatgaaa tattatctca 420

tcaattggta gactaatttc attagtaaga atcatatttt tcatcttcat tctttgagaa 480

agattctcag taaaacgtct agctatctct tccctcaaca tatcttcctc aattgaatga 540

ttacaaaaat tttcccctgc agagcataga tacaatgaac tacctgccat tacctcaagc 600

ttctaatatg gcagattagt gcattgaaa 629

<210> 9

<211> 658

<212> DNA

<213> 单刻材小蠹（Xyleborus monographus）

<400> 9

aactctatac ttcatttttg gagcatgggc cggaatagta ggaacatctc ttagtgtact 60

aattcgaaca gaattaggaa ctccaggaag actaattata gatgaccaaa tctttaacac 120

tattgtcaca gcccatgcat tcattataat tttctttata gttataccaa ttttaatcgg 180

aggatttggt aattgactcg tgcctctaat actaggagca cctgatatag cattcccccg 240

ccttaacaac ataaggttct ggctcctccc gccaagcctt tcactcttac taataagtag 300

aattatcgac aaaggagcag gtacaggatg aacagtttac ccccctttag cagctaatat 360

tgctcacgaa ggagcttcca tcgacctagc aattttcaga ctacatatat caggagtctc 420

ttctattcta ggggcaatta actttatttc aacaatcatc aatatacacc caacaggaat 480

aaagccagag caactctctc tatttacctg agctgtaaaa atcacagcag ttctgctgct 540

cctatcactc ccagttttag caggaggaat cacaatatta ttgacagacc gaaacattaa 600

tacctcattt tttgacccag caggaggggg agatcctatt ttataccaac acctattt 658

<210> 10

<211> 594

<212> DNA

<213> 单刻材小蠹（Xyleborus monographus）

<400> 10

ggaatagtag gaacatctct tagtgtacta attcgaacag aattaggaac tccaggaaga 60

ctaattatag atgatcaaat ctttaacact attgtcacag cccatgcatt cattataatt 120

ttctttatag ttataccaat tttaatcgga ggatttggta attgactcgt gcctctaata 180

ctaggagcac ctgatatagc attcccccgc cttaacaaca taaggttctg gctcctcccg 240

ccaagccttt cactcttact aataagtaga attatcgaca aaggagcagg tacaggatga 300

acagtttacc cccctttagc agctaatatt gctcacgaag gagcttccat cgacctagca 360

attttcagac tacatatatc aggagtctct tctattctag gggcaattaa ctttatttca 420

acaatcatca atatacaccc aacaggaata aagccagagc aactctccct atttacctga 480

gctgtaaaaa tcacagcagt tctgctgctc ctatcactcc cagttttagc aggaggaatc 540

acaatattat tgacagaccg aaacattaat acctcatttt ttgacccagc agga 594

<210> 11

<211> 585

<212> DNA

<213> 细点材小蠹（Xyleborus pelliculosus）

<400> 11

aatagtagga acatcactaa gagtactaat tcgaacagaa ctaggaactc caggtagtct 60

aattagagat gatcaaatct tcaacacaat tgttacagct catgcattca tcataatctt 120

ttttatagtt ataccaatcc taatcggagg atttggaaat tgattagtac ccctaatatt 180

aggagcccca gatatagcct tcccacgact caacaacata agcttttgat tactacctcc 240

cagtctatca cttcttttaa tgagaagaat aattgacaaa ggagcaggaa caggatgaac 300

agtctatccc cctcttgctg ctaacatcgc ccatgaagga gcatctgtag acttagcaat 360

ctttagactt catatatcag gagcatcctc aattctagga gcaatcaact tcatttcaac 420

catcattaac atacatccat caggaataaa accagaacaa ttatccctat ttacatgagc 480

agtaaaaatt acagccattc tattactatt gtccctacca gttttagcag gaggaatcac 540

aatactactc acagaccgaa atattaatac ttcattcttt gaccc 585

<210> 12

<211> 523

<212> DNA

<213> 对粒材小蠹（Xyleborus perforans）

<400> 12

ttttttttac ctctttcttg tctaataatg tgggaaatta taccaaatcc tggtaaaata 60

agaatataaa cttctgggtg gccaaaaaat cagaataagt gttgatatag aattggatca 120

ccccctcctg ctggatcaaa aaaagatgta ttgatatttc gatctgttag tagtatagta 180

attcctccag ctaatactgg tagggaaagt agaagtagaa ttgctgtaat tttcacagct 240

caggtgaaca gggaaagttg ttctggcttt attcctgttg gatgtatatt aataattgtt 300

gaaatgaaat tgatggcccc caggattgat gagataccag atatatgaag tctgaaaata 360

gctaaatcaa ttgatgctcc ttcatgagca atgtttgcag ctagtggtgg gtatacagtt 420

caacctgttc cagctccttt atcaacaata cttcttatta gaaggagtga taagcttggg 480

ggaagaagtc agaatcttat attgtttagt cgtgggaaag cta 523

<210> 13

<211> 532

<212> DNA

<213> 对粒材小蠹（Xyleborus perforans）

<400> 13

aatggcttct tttttacctc tttcttgtct aataatgtgt gaaattatac caaatcctgg 60

taaaataaga atataaactt ctgggtggcc aaaaaatcag aataaatgtt gatatagaat 120

tgggtcccca cctcctgctg gatcaaaaaa agatgtattg atgtttcgat ctgttagtag 180

tatagtaatt cccccggcta atactggtag ggagagtaga agtagaattg ctgtaatttt 240

tacagctcag gtgaacaggg aaagttgttc tggctttatc cctgttggat gtatattaat 300

aattgttgaa atgaaattga tggcccctag gattgatgag acaccagata tgtgaagtct 360

gaaaatagct aaatcaattg atgctccttc atgagcaatg tttgcagcta gtggtgggta 420

cacagttcaa cctgtcccag ctcctttgtc aacaatactt cttattagaa gtagtgatag 480

gcttggggga agaagtcaga atcttatatt gtttagtcgt gggaaggcta ta 532

<210> 14

<211> 521

<212> DNA

<213> 对粒材小蠹（Xyleborus perforans）

<400> 14

tttttttacc tctttcttga ctaataatgt gcgagattat accaaaacca gggagaataa 60

gaatataaac ttctgggtgt ccgaaaaacc aaaagagatg ttgataaaga attgggtctc 120

ctcctcctgc aggatcaaag aaagaggtgt taatatttcg atctgttagc aatattgtaa 180

ttcctcctgc taatacaggt agggaaagta ataacaaaat tgctgtgatt tttacagctc 240

aggtaaagag agagagttgt tcaggcttta tacctgttgg atgtatattg atgatggtag 300

agataaaatt aattgctcct aagattgaag agactcctga tatatgcaat ctgaagatgg 360

ccaggtcaat tgaggctcct tcatgagcga tatttgcggc taaaggggga taaacagttc 420

atcctgttcc ggctccttta tcaataattc ttcttataag aagaagagac aatcttgggg 480

gaagaagtca aaatcttatg ttgttaagtc gtgggaatgc t 521

<210> 15

<211> 555

<212> DNA

<213> 对粒材小蠹（Xyleborus perforans）

<400> 15

gccaaaggtt ctttttttcc ctctttcttg actaataatg tgagagatta taccaaatcc 60

aggaagaata aggatataaa cttctgggtg tccgaaaaat caaaataggt gctggtatag 120

aattggatct cctcctccgg caggatcaaa gaaagaggtg ttaatatttc gatctgttag 180

taatattgta attccgcctg ctaatactgg cagggaaagt aataacaaaa ttgctgtgat 240

ttttacagct caggtaaaga gagagagttg ttcaggcttt attcctgttg gatgtatatt 300

gatgatagta gaaataaaat taattgctcc taggattgaa gagattcctg acatgtgtaa 360

tctgaagatg gctaggtcaa ttgaggctcc ttcgtgagcg atatttgcgg ctaacggtgg 420

gtagacagtt catcctgttc cagctccttt atcaataatt cttcttataa gaagaaggga 480

taatcttggg ggaagaagtc aaaatcttat gttgttaagt cgtgggaatg ctatatctgg 540

ggctcctagt attaa 555

<210> 16

<211> 556

<212> DNA

<213> 对粒材小蠹（Xyleborus perforans）

<400> 16

cgccaaaggc ttcttttttc cctctttctt gactaataat gtgagagatt ataccaaatc 60

caggaagaat aaggatataa acttctgggt gtccgaaaaa tcaaaatagg tgctggtata 120

gaattggatc tcctcctccg gcaggatcaa agaaagaggt gttaatattt cgatctgtta 180

gtaatattgt aattccgcct gctaatactg gcagggaaag taataacaaa attgctgtga 240

tttttacagc tcaggtaaag agagagagtt gttcaggctt tattcctgtt ggatgtatat 300

tgatgatagt agaaataaaa ttaattgctc ctaggattga agagattcct gacatgtgta 360

atctgaagat ggctaggtca attgaggctc cttcgtgagc gatatttgcg gctaacggtg 420

ggtagacagt tcatcctgtt ccagctcctt tatcaataat tcttcttata agaagaaggg 480

ataatcttgg gggaagaagt caaaatctta tgttgttaag tcgtgggaat gctatatctg 540

gggctcctag tattaa 556

<210> 17

<211> 525

<212> DNA

<213> 伴随材小蠹（Xyleborus affinis）

<400> 17

actgatgata tgggaaatta taccgaatcc tgggagaatg agaatgtata tttttgggtg 60

tccaaagaat cagaaaagat gstgataaag aattggatct ccccctccag ctgggtcaaa 120

aaatgacgta ttaatattac ggtctgttaa tagtattgta atcccccctg ctaatacagg 180

caatgataat aaaagtaaaa ttgctgkgat tttcacagyt caggkgaata gggagagttk 240

ttctggtttt attcmtgttg ggtgtatatt aataawagta gaaataawgt tgattgctcc 300

caggattgat garactcctg atatatgtaa gctaaaaayg gctaartcaa ttgaggcgcc 360

ttcatgggcg atatttgcag ctaggggagg gtagacagtt caacctgtcc cagctccttt 420

gtcaataatt cttcttatta ataataagga taatcttggc ggtaagagtc agaaccttat 480

attgttgagc cgtggnaagg ctatatctgg ggcccctaac attaa 525

<210> 18

<211> 525

<212> DNA

<213> 伴随材小蠹（Xyleborus affinis）

<400> 18

actgatgata tgggaaatta taccgaatcc tgggagaatg agaatgtata cttctggatg 60

cccaaagaat cagaaaagat gttgataaag gattggatct ccccctcctg ctgggtcaaa 120

aaatgacgta ttaatattac ggtctgttaa tagtattgta atccctccag ctaatacagg 180

caatgataat aaaagtaaaa ttgctgtgat tttcacggct caggtgaata gggagagctg 240

ttctggtttt attcctgttg ggtgtatatt aataatagta gaaataaagt tgattgcccc 300

caggattgat garactcctg atatatgtaa gctaaaaatg gctaagtcaa ttgaggcccc 360

ttcgtgggcg atatttgcag ctagaggggg gtagacagtt caacctgtcc cagctccttt 420

gtcaataatt cttcttatta gtaataagga taatcttggt ggtaggagcc agaaccttat 480

attgttgagc cgtgggaagg ctatatctgg ggctcccagc attaa 525

<210> 19

<211> 556

<212> DNA

<213> 伴随材小蠹（Xyleborus affinis）

<400> 19

caccaaaggc ttcttttttt cctctttctt gactgatgat atgggaaatt ataccgaatc 60

ctgggagaat gagaatgtat acttctggat gcccaaagaa tcagaaaaga tgttgataaa 120

ggattggatc tccccctcct gctgggtcaa aaaatgacgt attaatatta cggtctgtta 180

atagtattgt aatccctcca gctaatacag gcaatgataa taaaagtaaa attgctgtga 240

ttttcacggc tcaggtgaat agggagagct gttctggttt tattcctgtt gggtgtatat 300

taataatagt agaaataaag ttgattgccc ccaggattga tgagactcct gatatatgta 360

agctaaaaat ggctaagtca attgaggccc cttcgtgggc gatatttgca gctagagggg 420

ggtagacagt tcaacctgtc ccagctcctt tgtcaataat tcttcttatt agtaataagg 480

ataatcttgg tggtaggagc cagaacctta tattgttgag ccgtgggaag gctatatctg 540

gggctcccag cattaa 556

<210> 20

<211> 536

<212> DNA

<213> 伴随材小蠹（Xyleborus affinis）

<400> 20

caccaaaggc ttcttttttt cctctttctt gactgataat atgggaaatt ataccgaatc 60

ctgggagaat gagaatgtat acttctgggt gtccaaagaa tcagaaaaga tgctgataaa 120

gaattggatc tccccctcca gctgggtcaa aaaatgacgt attaatatta cggtctgtta 180

atagtattgt aatcccccct gctaatacag gcaatgataa taaaagtaaa attgctgtga 240

ttttcacagc tcaggtgaat agggagagtt gttctggttt tattcctgtt gggtgtatat 300

taataatagt agaaataaag ttgattgctc ccaggattga tgagactcct gatatatgta 360

agctaaaaat ggctaaktca attgaggcgc cttcatgggc gatatttgca gctaggggag 420

ggtagacagt tcaacctgtc ccagctcctt tgtcaataat tcttcttatt aataataagg 480

ataatcttgg cggtaagagt cagaacctta tattgttgag ccgtgggaag gctata 536

<210> 21

<211> 622

<212> DNA

<213> 暗翅材小蠹（Xyleborus semiopacus）

<400> 21

gaattataat ttttagttga ttagcaactt accacggaac ccaaatcttg gctagaccaa 60

gatctctatg agctctaggt ttcctattcc tattcactat aggaggatta acaggagttg 120

ttctagctaa ttcctcttta gacatcattc ttcatgatac atattatgta gtagcccatt 180

ttcactacgt cttatctata ggggcagtat ttgcaattat agcaggccta gttcaatgat 240

tcccattatt tacaggacta acattgaata ataaatatct aaaaacccaa tttatcgcca 300

tatttattgg agtaaacata acattttttc cccaacattt tttaggattg agaggaatac 360

cacgacgata ttcagattac cctgatgcat acataatatg aaatattatc tcctcaattg 420

gaagactaat ttcattatta agaattctat ttttcatctt cattatatga gaaagattct 480

cagtaaaacg attatcaatt acatcactaa atatatcttc atcaattgaa tgattacaaa 540

aattcgcccc agcagaacat agctataatg aactacctgc tattgcttca tatttctaat 600

atggcagatt agtgcattga aa 622

<210> 22

<211> 622

<212> DNA

<213> 暗翅材小蠹（Xyleborus semiopacus）

<400> 22