本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分子及其应用。
背景技术：
人类cd19抗原是大小为95kda的跨膜糖蛋白，从属于免疫球蛋白超家族，除表达于正常b淋巴细胞表面，cd19也高表达于b细胞恶性肿瘤，因此抗cd19单克隆全长抗体已被开发应用于治疗急/慢性淋巴细胞性白血病以及b细胞淋巴瘤(wangk等人，experimentalhematology&oncology，1:36-42，2012)。鉴于抗cd19单克隆抗体无法有效募集细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte,ctl，该类cd3/cd8双阳性t细胞可特异性识别靶细胞表面的抗原肽/mhci类分子复合物，自身活化后释放穿孔素(peforin)，导致靶细胞裂解死亡，也可分泌细胞毒素和颗粒酶(granzyme)等致使靶细胞核的dna损伤，引起靶细胞凋亡)，人们进一步设计和开发了可衔接t细胞和淋巴瘤b细胞的双特异性抗体(bi-specificantibody,bsab)以及基因工程嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy,car-t)(zhukovskyea等人，currentopinioninimmunology，40:24–35，2016)。
目前一种比较成熟的靶向cd19的双特异性抗体类型是抗cd19/抗cd3的双特异性t细胞衔接器(bi-specifictcellengager,bite)，其结构是两个单链抗体(single-chainvariablefragment,scfv)功能域通过具有柔性的连接肽片段(linker)共价串联(goebelerme等人，leukemia&lymphoma,57：1021–1032，2016)。在机体的细胞免疫过程中，cd8阳性t细胞表面的tcr/cd3复合物与抗原递呈细胞(antigenpresentingcell，apc)表面的内源性抗原肽/mhci类分子复合物发生特异性识别，导致cd3与共受体cd8的胞质段相互作用，激活与胞质段尾部相连的蛋白质酪氨酸激酶，使cd3胞质区免疫受体酪氨酸激酶激活模体(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)中的酪氨酸磷酸化，启动信号传导分子级联反应，激活转录因子，使得t细胞初步活化。抗cd19/抗cd3bite双特异性抗体由于具有人类cd3和cd19两种抗原的结合活性，能够在t细胞与肿瘤b细胞间形成细胞衔接，同时给予t细胞初步活化信号，提高了其对肿瘤细胞的杀伤靶向性。但是，bite双特异性抗体不具有全长抗体的fc片段，蛋白分子量较小(～54kda)，因此在肿瘤治疗的过程中可穿越尿血屏障和脑血屏障，生物利用度低，需持续静脉注射给药，同时具有一定的神经毒性。
此外，人体内t细胞的活化需要依赖双信号传递途径(baxterag等人，naturereviewsimmunology，2：439-446，2002)。首先，apc细胞表面的抗原肽-mhc分子复合物与t细胞表面的tcr/cd3复合物相互作用产生第一信号，使得t细胞初步活化，之后apc细胞表面的共刺激分子配体(例如cd80、cd86、4-1bbl、b7rp-1、ox40l、gitrl、cd40、cd70、pd-l1、pd-l2、galectin-9和hvem等)与t细胞表面相应的共刺激分子(co-stimulatorymolecule，例如cd28、4-1bb、icos、ox40、gitr、cd40l、cd27、ctla-4、pd-1、lag-3、tim-3、tigit和btla等)相互作用产生第二信号(共刺激信号)：其中cd28、4-1bb、icos、ox40、gitr、cd40l和cd27等属于正共刺激分子，与相应配体(cd80、cd86、4-1bbl、b7rp-1、ox40l、gitrl、cd70等)相互作用所产生的第二信号(正共刺激信号)可导致t细胞的完全活化；而ctla-4、pd-1、lag-3、tim-3、tigit和btla等属于负共刺激分子，与相应配体(cd80、cd86、pd-l1、pd-l2、galectin-9、hvem等)相互作用所产生的第二信号(负共刺激信号)主要是下调和终止t细胞的活化。已有研究表明仅有第一信号传递途径无法充分活化t细胞，相反会导致其失能甚至产生激活诱导的t细胞死亡(activationinducedcelldeath，aicd)。为解决这一问题，可将抗肿瘤抗原/抗t细胞正(负)共刺激分子的双特异性抗体与抗肿瘤抗原/抗cd3的双特异性抗体联合使用，以提高t细胞的活化及肿瘤细胞杀伤效率(jungg等人，intjcancer，91：225-230，2001；kodamah等人，immunollett，81：99-106，2002)。但该方法在实际操作过程中存在诸多不便，例如会增加重组双特异性抗体表达与纯化的工作量及生产成本，活化扩增t细胞时还需优化两种双特异性抗体的相对比例。相比之下，car-t技术能更好地解决t细胞的活化问题。car的构建通常包括：肿瘤相关抗原结合区(例如cd19抗原结合区，通常来源于抗cd19单克隆全长抗体的scfv片段)、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号区。其中胞内信号区负责介导t细胞的激活，一方面通过cd3ζ链上的酪氨酸激活基序来完成第一刺激信号，一方面通过cd28共刺激信号实现第一刺激信号的扩大，促进t细胞增殖与活化，并导致细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟等。但car-t技术本身也存在着一些不足：首先，该技术依赖病毒转染对t细胞进行基因改造，步骤繁琐，对实验条件要求较高；其次，具体使用时需将体外扩增活化后的car-t细胞回输至病人体内，剂量把控相对抗体药物具有更大难度；此外，car-t细胞进入患者体内后数量急剧增加可导致细胞因子风暴(cytokinestorm)，短时期内产生超量的细胞因子，从而引起高烧、低压、休克甚至死亡等副反应。
技术实现要素：
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分子及其应用。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种三功能分子，其结构中包括能够结合于cd19的第一功能域、能够结合并激活t细胞表面cd3分子的第二功能域和能够结合并激活t细胞正共刺激分子的第三功能域。
优选地，所述三功能分子，能够在结合于cd19的同时，结合并激活t细胞表面cd3分子和t细胞正共刺激分子，从而产生t细胞活化所需的第一信号和第二信号。
优选地，所述第一功能域为抗cd19的抗体，所述第二功能域为抗cd3的抗体，所述第三功能域为t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
优选地，所述抗体为小分子抗体。
优选地，所述抗体选自fab抗体、fv抗体或单链抗体(scfv)。
优选地，所述第一功能域和所述第二功能域之间通过连接片段1连接，所述第二功能域和所述第三功能域之间通过连接片段2连接。
优选地，所述连接片段1和连接片段2选自以g4s为单位的连接片段或免疫球蛋白igd的铰链区片段。
所述g4s具体为ggggs。所述以g4s为单位的连接片段包括一个或多个g4s单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的g4s单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以g4s为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过以g4s为单位的连接片段2连接。所述连接片段1含有一个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.1所示。所述连接片段2含有三个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.3所示。
所述免疫球蛋白igd的铰链区片段可以为免疫球蛋白igd的铰链ala90-val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以g4s为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过免疫球蛋白igd的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白igd的铰链区片段为免疫球蛋白igd的铰链ala90-val170。所述连接片段1含有一个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.5所示。所述连接片段2的氨基酸序列如seqidno.7所示。所述连接片段2可通过二硫键相互连接形成二聚体。
优选地，所述第一功能域的c末端与所述第二功能域的n末端连接；所述第二功能域的c末端与所述第三功能域的n末端连接。
优选地，所述第一功能域为抗cd19的单链抗体，所述抗cd19的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
优选地，所述抗cd19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。所述抗cd19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。
优选地，所述第二功能域为抗cd3的单链抗体，所述抗cd3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。
优选地，所述抗cd3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。所述抗cd3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。
本发明一些实施例中，列举了所述抗cd19的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.39所示。所述抗cd3的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.42所示。
优选地，所述第三功能域为t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。
优选地，所述t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域选自4-1bbl胞外区结构域、b7rp-1胞外区结构域、ox40l胞外区结构域、gitrl胞外区结构域或cd70胞外区结构域之任一。
优选地，所述4-1bbl胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.45所示。
优选地，所述b7rp-1胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.46所示。
优选地，所述ox40l胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.47所示。
优选地，所述gitrl胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.48所示。
优选地，所述cd70胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.49所示。
在本案的较佳案例中，单体形式的三功能分子的氨基酸序列如seqidno.19、seqidno.23、seqidno.27、seqidno.31或seqidno.35之任一所示。二聚体形式的三功能分子的氨基酸序列如seqidno.21、seqidno.25、seqidno.29、seqidno.33或seqidno.37之任一所示。
本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，其编码前述三功能分子。
本发明的第三方面，提供一种表达载体，其含有前述多核苷酸。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其被前述表达载体所转化。
本发明的第五方面，提供一种制备前述三功能分子的方法，包括：构建含有三功能分子基因序列的表达载体，然后将含三功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的三功能分子。
本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcdna3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovaryce1l，cho)。
本发明的第六方面，提供前述三功能分子用于制备肿瘤治疗药物的用途。
本发明的第七方面，提供一种肿瘤治疗药物组合物，含有前述三功能分子及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。所述肿瘤为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。
本发明的第八方面，公开了一种体外治疗肿瘤的方法，包括将前述三功能分子或肿瘤治疗药物组合物施用于肿瘤患者。所述方法可以是非治疗目的的。所述肿瘤为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明所述的三特异性分子将能够结合于cd19的第一功能域、能够结合并激活t细胞表面cd3分子的第二功能域和能够结合并激活t细胞正共刺激分子的第三功能域融合于同一蛋白肽链形成三功能分子，采用真核细胞表达系统生产，表达产物结构单一，纯化工艺简便，蛋白产量高，制备工艺及产品稳定，使用方便；而抗cd19/抗cd3双特异性抗体与抗cd19/抗t细胞正共刺激分子双特异性抗体如果联合使用，两个双特异性抗体需分别表达纯化，制备工艺更复杂，工作量和生产成本显著增加，且使用时需优化两者的相对比例。
(2)本发明所述的三功能分子，能够产生t细胞活化的第二(正)刺激信号，在赋予t细胞靶向性的同时进一步提高了对t细胞的激活功效，使得细胞因子和抗细胞凋亡蛋白分泌增加，有效避免了t细胞失能及死亡的现象，所介导的t细胞对cd19阳性靶细胞的杀伤能够达到甚至优于抗cd19/抗cd3bite双特异性抗体的效果，且蛋白用量更少。
(3)本发明所述的三功能分子，与靶向cd19的car-t技术相比，不涉及病毒介导转基因、体外t细胞培养及回输等操作步骤，使用更方便，剂量可控，进入病人机体后引起细胞因子过量释放的风险小，避免了使用car-t时的毒副作用。
附图说明
图1：a.单体形式抗cd19/抗cd3/t细胞正共刺激分子配体tsm的结构图；b.二聚体形式抗cd19/抗cd3/t细胞正共刺激分子配体tsm的结构图。
图2：a.纯化的cd19-cd3-4-1bbltsm_msds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-4-1bbltsm_m；泳道3：非还原性cd19-cd3-4-1bbltsm_m；b.纯化的cd19-cd3-4-1bbltsm_dsds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-4-1bbltsm_d；泳道3：非还原性cd19-cd3-4-1bbltsm_d。
图3a：cd19-cd3-4-1bbltsm_m的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白4-1bb-hfc；
图3b：cd19-cd3-4-1bbltsm_d的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白4-1bb-hfc；
图4：cd19-cd3-4-1bbl三特异分子介导的细胞杀伤实验。以raji淋巴瘤细胞作为cd19阳性的靶细胞，cik(cytokineinducedkiller)细胞作为cd3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度cd19-cd3-4-1bbltsm_m、cd19-cd3-4-1bbltsm_d以及cd19-cd3bsab所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(e:t比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图5：a.纯化的cd19-cd3-b7rp-1tsm_msds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-b7rp-1tsm_m；泳道3：非还原性cd19-cd3-b7rp-1tsm_m；b.纯化的cd19-cd3-b7rp-1tsm_dsds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-b7rp-1tsm_d；泳道3：非还原性cd19-cd3-b7rp-1tsm_d。
图6a：cd19-cd3-b7rp-1tsm_m的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白icos-hfc；
图6b：cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白icos-hfc；
图7：cd19-cd3-b7rp-1三特异分子介导的细胞杀伤实验。以raji淋巴瘤细胞作为cd19阳性的靶细胞，cik细胞作为cd3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度cd19-cd3-b7rp-1tsm_m、cd19-cd3-b7rp-1tsm_d以及cd19-cd3bsab所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(e:t比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图8：a.纯化的cd19-cd3-ox40ltsm_msds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-ox40ltsm_m；泳道3：非还原性cd19-cd3-ox40ltsm_m；b.纯化的cd19-cd3-ox40ltsm_dsds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-ox40ltsm_d；泳道3：非还原性cd19-cd3-ox40ltsm_d。
图9a：cd19-cd3-ox40ltsm_m的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白ox40-hfc；
图9b：cd19-cd3-ox40ltsm_d的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白ox40-hfc；
图10：cd19-cd3-ox40l三特异分子介导的细胞杀伤实验。以raji淋巴瘤细胞作为cd19阳性的靶细胞，cik细胞作为cd3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度cd19-cd3-ox40ltsm_m、cd19-cd3-ox40ltsm_d以及cd19-cd3bsab所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(e:t比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图11：a.纯化的cd19-cd3-gitrltsm_msds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-gitrltsm_m；泳道3：非还原性cd19-cd3-gitrltsm_m；b.纯化的cd19-cd3-gitrltsm_dsds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-gitrltsm_d；泳道3：非还原性cd19-cd3-gitrltsm_d。
图12a：cd19-cd3-gitrltsm_m的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白gitr-hfc；
图12b：cd19-cd3-gitrltsm_d的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白gitr-hfc；
图13：cd19-cd3-gitrl三特异分子介导的细胞杀伤实验。以raji淋巴瘤细胞作为cd19阳性的靶细胞，cik细胞作为cd3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度cd19-cd3-gitrltsm_m、cd19-cd3-gitrltsm_d以及cd19-cd3bsab所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(e:t比)＝1：1，杀伤时间：3h。
图14：a.纯化的cd19-cd3-cd70tsm_msds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-cd70tsm_m；泳道3：非还原性cd19-cd3-cd70tsm_m；b.纯化的cd19-cd3-cd70tsm_dsds-page分析图，泳道1：分子量蛋白marker；泳道2：还原性cd19-cd3-cd70tsm_d；泳道3：非还原性cd19-cd3-cd70tsm_d。
图15a：cd19-cd3-cd70tsm_m的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白cd27-hfc；
图15b：cd19-cd3-cd70tsm_d的elisa鉴定结果，图中的曲线分别代表4种检测结果：■包被1μg/ml重组抗原cd19-hfc；●包被1μg/ml重组抗原cd3-hfc；▲包被1μg/ml重组蛋白cd27-hfc；
图16：cd19-cd3-cd70三特异分子介导的细胞杀伤实验。以raji淋巴瘤细胞作为cd19阳性的靶细胞，cik细胞作为cd3阳性的杀伤效应细胞，分别检测不同浓度cd19-cd3-cd70tsm_m、cd19-cd3-cd70tsm_d以及cd19-cd3bsab所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率；效应细胞：靶细胞(e:t比)＝1：1，杀伤时间：3h。
具体实施方式
一、术语和缩略语：
ctl：细胞毒性t淋巴细胞(cytotoxictlymphocyte)
bsab：双特异性抗体(bi-specificantibody)
tsm：三特异性分子(tri-specificmolecule)
bite:双特异性t细胞衔接器(bi-specifictcellengager)
tite：三特异性t细胞衔接器(tri-specifictcellengager)
fab：抗原结合片段(fragmentofantigenbinding)
fv：可变区片段(variablefragment)
scfv:单链可变区片段(single-chainvariablefragment)，又称为单链抗体
vh：重链可变区(heavychainvariableregion)
vl：轻链可变区(lightchainvariableregion)
linker1：连接片段1
linker2:连接片段2
extracellulardomain：胞外区
co-stimulatorymolecule：共刺激分子
4-1bbl：t细胞正共刺激分子4-1bb的配体
b7rp-1：t细胞正共刺激分子icos的配体
ox4ol：t细胞正共刺激分子ox40的配体
gitrl：t细胞正共刺激分子gitr的配体
cd70：t细胞正共刺激分子cd27的配体
cd19-cd3-4-1bbltsm_m:单体形式的抗cd19/抗cd3/4-1bbl三特异性分子
cd19-cd3-4-1bbltsm_d:二聚体形式的抗cd19/抗cd3/4-1bbl三特异性分子
cd19-cd3-b7rp-1tsm_m:单体形式的抗cd19/抗cd3/b7rp-1三特异性分子
cd19-cd3-b7rp-1tsm_d:二聚体形式的抗cd19/抗cd3/b7rp-1三特异性分子
cd19-cd3-ox40ltsm_m:单体形式的抗cd19/抗cd3/ox40l三特异性分子
cd19-cd3-ox40ltsm_d:二聚体形式的抗cd19/抗cd3/ox40l三特异性分子
cd19-cd3-gitrltsm_m:单体形式的抗cd19/抗cd3/gitrl三特异性分子
cd19-cd3-gitrltsm_d:二聚体形式的抗cd19/抗cd3/gitrl三特异性分子
cd19-cd3-cd70tsm_m:单体形式的抗cd19/抗cd3/cd70三特异性分子
cd19-cd3-cd70tsm_d:二聚体形式的抗cd19/抗cd3/cd70三特异性分子
二、三功能分子
本发明所述的三功能分子，其结构中包括能够结合于cd19的第一功能域、能够结合并激活t细胞表面cd3分子的第二功能域和能够结合并激活t细胞正共刺激分子的第三功能域。
进一步地，所述三功能分子，能够在结合于cd19的同时，结合并激活t细胞表面cd3分子和t细胞正共刺激分子，从而产生t细胞活化所需的第一信号和第二信号。所述t细胞正共刺激分子包括但不限于人类4-1bb、icos、ox40、gitr、cd40l或cd27。
本发明对于第一功能域、第二功能域和第三功能域并无特殊限制，只要能够在识别cd19的同时，结合并激活t细胞表面cd3分子和t细胞正共刺激分子，从而产生t细胞活化所需的第一信号和第二信号即可。例如，所述第一功能域可以是抗cd19的抗体，所述第二功能域可以是抗cd3的抗体，所述第三功能域可以是t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。所述抗体可以是任意形式。但无论是何种形式的抗体，其抗原结合部位均含有重链可变区和轻链可变区。所述抗体优选地可以是小分子抗体。所述小分子抗体是分子量较小的抗体片段，其抗原结合部位包括重链可变区和轻链可变区。所述小分子抗体的分子量虽小但保持了亲本单抗的亲和力，具有亲本单抗一样的特异性。所述小分子抗体的种类主要包括fab抗体、fv抗体、单链抗体(scfv)等。fab抗体由完整的轻链(可变区vl和恒定区cl)和重链fd段(可变区vh和第一恒定区ch1)通过二硫键连接形成。fv抗体仅由轻链和重链的可变区通过非共价键连接，是抗体分子保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体(scfv)是重链可变区和轻链可变区通过连接片段连接而成的单一蛋白肽链分子。
所述第一功能域和所述第二功能域之间通过连接片段1连接，所述第二功能域和所述第三功能域之间通过连接片段2连接。本发明对于连接顺序没有特殊要求，只要不限制本发明的目的即可。例如，可以是所述第一功能域的c末端与所述第二功能域的n末端连接；所述第二功能域的c末端与所述第三功能域的n末端连接。本发明对于连接片段1和连接片段2也没有特殊的限制，只要是不限制本发明的目的即可。
进一步地，所述连接片段1和连接片段2选自以g4s为单位的连接片段或免疫球蛋白igd的铰链区片段。
所述g4s具体为ggggs。所述以g4s为单位的连接片段包括一个或多个g4s单位。例如，可以包括是一个、二个、三个或四个以上的g4s单位。本发明的一些实施例中，列举了一单体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以g4s为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过以g4s为单位的连接片段2连接。所述连接片段1含有一个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.1所示。所述连接片段2含有三个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.3所示。
所述免疫球蛋白igd的铰链区片段可以为免疫球蛋白igd的铰链ala90-val170。本发明的一些实施例中，列举了一二聚体形式的双功能分子中，第一功能域和第二功能域之间通过以g4s为单位的连接片段1连接，第二功能域和第三功能域之间通过免疫球蛋白igd的铰链区片段连接，所述免疫球蛋白igd的铰链区片段为免疫球蛋白igd的铰链ala90-val170。所述连接片段1含有一个g4s单位，所述连接片段的氨基酸序列如seqidno.5所示。所述连接片段2的氨基酸序列如seqidno.7所示。所述连接片段2可通过二硫键相互连接形成二聚体。
在本发明的较佳实施例中，所述三功能分子的结构示意图如图1所示。所述三功能分子可以是单体形式也可以是二聚体形式。本发明的单体形式的三功能分子的结构示意图如图1中a所示，所述三功能分子的结构中含有一个与cd19抗原结合的第一功能域，一个与cd3抗原结合的第二功能域，一个与t细胞正共刺激分子结合的第三功能域，所述第一功能域为与cd19抗原结合的单链抗体(scfv)，所述第二功能域为与cd3抗原结合的单链抗体(scfv)，所述第三功能域为t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。本发明的二聚体形式的三功能分子的结构示意图如图1中b所示，所述三功能分子的结构中含有两个与cd19抗原结合的第一功能域，两个与cd3抗原结合的第二功能域，两个与t细胞正共刺激分子结合的第三功能域，所述第一功能域为与cd19抗原结合的单链抗体(scfv)，所述第二功能域为与cd3抗原结合的单链抗体(scfv)，所述第三功能域为t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。本发明的二聚体形式的三功能分子的抗原结合效价是单体形式的二倍。由于t细胞活化第一信号(cd3)和第二信号(正共刺激信号)的加倍，致使t细胞活化更为充分，对靶细胞的杀伤效果更强；cd19scfv结构域的加倍使其对靶细胞的识别也更为精准，因此二聚体较单体具有更好的使用效果。
进一步地，所述t细胞正共刺激分子可以是人类4-1bb(uniprotid：q07011)，氨基酸序列如seqidno.9所示，其配体为人类4-1bbl(uniprotid：p41273)，氨基酸序列如seqidno.10所示。
seqidno.9：
lqdpcsncpagtfcdnnrnqicspcppnsfssaggqrtcdicrqckgvfrtrkecsstsnaecdctpgfhclgagcsmceqdckqgqeltkkgckdccfgtfndqkrgicrpwtncsldgksvlvngtkerdvvcgpspadlspgassvtppaparepghspqiisfflaltstallfllffltlrfsvvkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel。
seqidno.10：
meyasdasldpeapwppapraracrvlpwalvaglllllllaaacavflacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。
所述t细胞正共刺激分子可以是人类icos(uniprotid：q9y6w8)，氨基酸序列如seqidno.11所示，其配体为人类b7rp-1(uniprotid：o75144)，氨基酸序列如seqidno.12所示。
seqidno.11：
eingsanyemfifhnggvqilckypdivqqfkmqllkggqilcdltktkgsgntvsikslkfchsqlsnnsvsfflynldhshanyyfcnlsifdpppfkvtltggylhiyesqlccqlkfwlpigcaafvvvcilgcilicwltkkkysssvhdpngeymfmravntakksrltdvtl。
seqidno.12：
dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaatwsilavlcllvvvavaigwvcrdrclqhsyagawavspeteltghv。
所述t细胞正共刺激分子可以是人类ox40(uniprotid：p43489)，氨基酸序列如seqidno.13所示，其配体为人类ox40l(uniprotid：p23510)，氨基酸序列如seqidno.14所示。
seqidno.13：
lhcvgdtypsndrcchecrpgngmvsrcsrsqntvcrpcgpgfyndvvsskpckpctwcnlrsgserkqlctatqdtvcrcragtqpldsykpgvdcapcppghfspgdnqackpwtnctlagkhtlqpasnssdaicedrdppatqpqetqgpparpitvqpteawprtsqgpstrpvevpggravaailglglvlgllgplaillalyllrrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki。
seqidno.14：
mervqpleenvgnaarprfernklllvasviqglglllcftyiclhfsalqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl。
所述t细胞正共刺激分子可以是人类gitr(uniprotid：q9y5u5)，氨基酸序列如seqidno.15所示，其配体为人类gitrl(uniprotid：q9ung2)，氨基酸序列如seqidno.16所示。
seqidno.15：
qrptggpgcgpgrlllgtgtdarccrvhttrccrdypgeeccsewdcmcvqpefhcgdpccttcrhhpcppgqgvqsqgkfsfgfqcidcasgtfsggheghckpwtdctqfgfltvfpgnkthnavcvpgsppaeplgwltvvllavaacvllltsaqlglhiwqlrsqcmwpretqlllevppstedarscqfpeeergersaeekgrlgdlwv。
seqidno.16：
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所述t细胞正共刺激分子可以是人类cd27(uniprotid：p26842)，氨基酸序列如seqidno.17所示，其配体为人类cd70(uniprotid：p32970)，氨基酸序列如seqidno.18所示。
seqidno.17：
atpapkscperhywaqgklccqmcepgtflvkdcdqhrkaaqcdpcipgvsfspdhhtrphcescrhcnsgllvrnctitanaecacrngwqcrdkectecdplpnpsltarssqalsphpqpthlpyvsemleartaghmqtladfrqlpartlsthwppqrslcssdfirilvifsgmflvftlagalflhqrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacsp。
seqidno.18：
mpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp。
具体地，所述第一功能域为抗cd19的单链抗体。所述抗cd19的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述抗cd19的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。所述抗cd19的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。进一步地，所述抗cd19的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.39所示。
所述第二功能域为抗cd3的单链抗体。所述抗cd3的单链抗体包括重链可变区和轻链可变区。所述抗cd3的单链抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。所述抗cd3的单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。进一步地，所述抗cd3的单链抗体的氨基酸序列如seqidno.42所示。
所述第三功能域为t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域。所述t细胞正共刺激分子的配体胞外区结构域可以是4-1bbl胞外区结构域、b7rp-1胞外区结构域、ox40l胞外区结构域、gitrl胞外区结构域或cd70胞外区结构域之任一。
所述4-1bbl胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.45所示。
所述b7rp-1胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.46所示。
所述ox40l胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.47所示。
所述gitrl胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.48所示。
所述cd70胞外区结构域的氨基酸序列如seqidno.49所示。
在本案的较佳案例中，单体形式的三功能分子的氨基酸序列如seqidno.19、seqidno.23、seqidno.27、seqidno.31或seqidno.35之任一所示。二聚体形式的三功能分子的氨基酸序列如seqidno.21、seqidno.25、seqidno.29、seqidno.33或seqidno.37之任一所示。但不限于本发明较佳案例中所列举的具体形式。
三、编码三功能分子的多核苷酸
本发明的编码所述三功能分子的多核苷酸，可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。
本发明的编码所述三功能分子的多核苷酸，可以通过本领域技术人员熟知的任何适当的技术制备。所述技术见于本领域的一般描述，如《分子克隆实验指南》(j.萨姆布鲁克等，科学出版社，1995)。包括但不限于重组dna技术、化学合成等方法；例如采用重叠延伸pcr法。
在本发明的较佳实施例中，编码所述抗cd19的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示。编码所述抗cd19的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示。编码所述抗cd19的单链抗体的核苷酸序列如seqidno.50所示。
编码所述抗cd3的单链抗体的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示。编码所述抗cd3的单链抗体的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示。编码所述抗cd3的单链抗体的核苷酸序列如seqidno.53所示。
编码所述4-1bbl胞外区结构域的核苷酸序列如seqidno.56所示。
编码所述b7rp-1胞外区结构域的核苷酸序列如seqidno.57所示。
编码所述ox40l胞外区结构域的核苷酸序列如seqidno.58所示。
编码所述gitrl胞外区结构域的核苷酸序列如seqidno.59所示。
编码所述cd70胞外区结构域的核苷酸序列如seqidno.60所示。
编码氨基酸序列如seqidno.1所示的连接片段的核苷酸序列如seqidno.2所示。
编码氨基酸序列如seqidno.3所示的连接片段的核苷酸序列如seqidno.4所示。
编码氨基酸序列如seqidno.5所示的连接片段的核苷酸序列如seqidno.6所示。
编码氨基酸序列如seqidno.7所示的连接片段的核苷酸序列如seqidno.8所示。
进一步地，编码单体形式的三功能分子的核苷酸序列如seqidno.20、seqidno.24、seqidno.28、seqidno.32或seqidno.36之任一所示。编码二聚体形式的三功能分子的核苷酸序列如seqidno.22、seqidno.26、seqidno.30、seqidno.34或seqidno.38之任一所示。
四、表达载体
本发明的所述表达载体含有编码所述三功能分子的多核苷酸。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建所述表达载体。这些方法包括重组dna技术、dna合成技术等。可将编码所述融合蛋白的dna有效连接到载体中的多克隆位点上，以指导mrna合成进而表达蛋白，或者用于同源重组。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcdna3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovaryce1l，cho)。
五、制备三功能分子的方法
本发明的制备前述三功能分子的方法，包括：构建含有三功能分子基因序列的表达载体，然后将含三功能分子基因序列的表达载体转化至宿主细胞中诱导表达，从表达产物中分离获得所述的三功能分子。本发明的较佳案例中，所述表达载体采用pcdna3.1。所述宿主细胞采用中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovaryce1l，cho)。
六、三功能分子的用途
本发明的三功能分子可用于肿瘤治疗药物。所述肿瘤为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。
本发明较佳实施例中，通过试验发现，本发明的三功能分子均具有与cd19重组抗原、cd3重组抗原和相应t细胞正共刺激分子重组蛋白的体外结合活性，可促进t细胞对cd19阳性靶细胞的靶向杀伤，并且二聚体较单体具有更好的效果。
七、肿瘤治疗药物组合物
本发明的所述肿瘤治疗药物组合物，含有前述三功能分子及至少一种药学可接受的载体或赋形剂。所述肿瘤为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。
本发明所提供的药物组合物可以多种剂型存在，如用于静脉注射等的注射剂，用于皮下注射、表皮外敷等的经皮吸收剂，用于喷鼻、喉、口腔、表皮、粘膜等的喷雾剂，用于滴鼻、眼、耳等的滴剂，用于肛肠等的栓剂、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式，及肺部给药制剂及其他非肠道给药的组合物。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。该药用组合物还可以加入香味剂、甜味剂等。
如上所述的药物制剂可对哺乳动物临床使用，包括人和动物，可以经静脉注射或者口、鼻、皮肤、肺吸入等途径给药。上述药物的优选周剂量为0.1-5mg/kg体重，优选的疗程为10至30天。一次性给药，或分次给药。无论采用何种给药方法，个体人的最佳剂量应根据具体的治疗而定。
八、体外治疗肿瘤的方法
本发明的体外治疗肿瘤的方法，包括将前述三功能分子或肿瘤治疗药物组合物施用于于肿瘤患者。所述肿瘤为细胞表面为cd19阳性的肿瘤。所述方法可以是非治疗目的的。本发明较佳实施例中，通过试验发现，本发明的三功能分子均具有与cd19重组抗原、cd3重组抗原和相应t细胞正共刺激分子重组蛋白的体外结合活性，可促进t细胞对cd19阳性靶细胞的靶向杀伤，并且二聚体较单体具有更好的效果。
本发明针对抗cd19/抗cd3bite双特异性抗体以及靶向cd19的car-t技术的不足，通过基因工程和抗体工程的方法构建了能同时识别cd19，cd3及任一t细胞正共刺激分子的三特异性分子(tri-specificmolecule,tsm)。该分子在制备工艺和实际应用方面具有明显的优势：在赋予t细胞对cd19阳性细胞靶向性的同时进一步提高了活化t细胞的功效，单独添加时所介导的t细胞对cd19阳性靶细胞的杀伤效果均优于抗cd19/抗cd3bite双特异性抗体，在使用的方便性上优于靶向cd19的car-t技术。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。
实施例1：cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d真核表达载体的构建
在本发明中，一种融合了1)抗淋巴瘤b细胞表面人类cd19蛋白scfv结构域、2)抗t细胞表面人类cd3蛋白scfv结构域和3)t细胞正共刺激分子配体4-1bbl胞外区结构域的tite三特异性分子被命名为cd19-cd3-4-1bbltsm。
一、cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d构建方案设计
单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和4-1bbl胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和4-1bbl胞外区序列之间则通过连接片段2(linker2)相连。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和4-1bbl胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和4-1bbl胞外区序列之间以igd铰链区(ala90-val170)作为连接片段2(linker2)相连。
为使三特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗cd19scfv，抗cd3scfv，4-1bbl胞外区序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗cd19scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示，具体为：
caggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc。
抗cd19scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaag。
抗cd19scfv的核苷酸序列如seqidno.50所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagc。
抗cd3scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示，具体为：
gacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagc。
抗cd3scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaag。
抗cd3scfv的核苷酸序列如seqidno.53所示，具体为：
gacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaag。
4-1bbl胞外区的核苷酸序列如seqidno.56所示，具体为：
gcctgcccctgggccgtgagcggcgcccgcgccagccccggcagcgccgccagcccccgcctgcgcgagggccccgagctgagccccgacgaccccgccggcctgctggacctgcgccagggcatgttcgcccagctggtggcccagaacgtgctgctgatcgacggccccctgagctggtacagcgaccccggcctggccggcgtgagcctgaccggcggcctgagctacaaggaggacaccaaggagctggtggtggccaaggccggcgtgtactacgtgttcttccagctggagctgcgccgcgtggtggccggcgagggcagcggcagcgtgagcctggccctgcacctgcagcccctgcgcagcgccgccggcgccgccgccctggccctgaccgtggacctgccccccgccagcagcgaggcccgcaacagcgccttcggcttccagggccgcctgctgcacctgagcgccggccagcgcctgggcgtgcacctgcacaccgaggcccgcgcccgccacgcctggcagctgacccagggcgccaccgtgctgggcctgttccgcgtgacccccgagatccccgccggcctgcccagcccccgcagcgag。
单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.2所示，具体为：
ggcggcggcggcagc。
单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.4所示，具体为：
ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.6所示，具体为：
ggcggcggcggcagc。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.8所示，具体为：
gccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtg。
为使三特异性分子在cho-s细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如seqidno.61所示，具体为：
mtrltvlallagllassra。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如seqidno.62所示，具体为：
atgacccgcctgaccgtgctggccctgctggccggcctgctggccagcagccgcgcc。
二、cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d真核表达载体构建
本发明三特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcdna3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性分子，分别设计了如表1所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对cd19-cd3-4-1bbltsm_m的克隆构建，首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-(ggggs)3-4-1bbl-f和pcdna3.1-4-1bbl-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、(ggggs)3linker2+4-1bbl胞外区的基因序列；针对cd19-cd3-4-1bbltsm_d的克隆构建，同样首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-igd-f和igd-r、igd-4-1bbl-f和pcdna3.1-4-1bbl-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、igd铰链区linker2、4-1bbl胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用
经测序获知，单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m和二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m的核苷酸序列如seqidno.20所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgcctgcccctgggccgtgagcggcgcccgcgccagccccggcagcgccgccagcccccgcctgcgcgagggccccgagctgagccccgacgaccccgccggcctgctggacctgcgccagggcatgttcgcccagctggtggcccagaacgtgctgctgatcgacggccccctgagctggtacagcgaccccggcctggccggcgtgagcctgaccggcggcctgagctacaaggaggacaccaaggagctggtggtggccaaggccggcgtgtactacgtgttcttccagctggagctgcgccgcgtggtggccggcgagggcagcggcagcgtgagcctggccctgcacctgcagcccctgcgcagcgccgccggcgccgccgccctggccctgaccgtggacctgccccccgccagcagcgaggcccgcaacagcgccttcggcttccagggccgcctgctgcacctgagcgccggccagcgcctgggcgtgcacctgcacaccgaggcccgcgcccgccacgcctggcagctgacccagggcgccaccgtgctgggcctgttccgcgtgacccccgagatccccgccggcctgcccagcccccgcagcgag。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d的核苷酸序列如seqidno.22所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaaggccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtggcctgcccctgggccgtgagcggcgcccgcgccagccccggcagcgccgccagcccccgcctgcgcgagggccccgagctgagccccgacgaccccgccggcctgctggacctgcgccagggcatgttcgcccagctggtggcccagaacgtgctgctgatcgacggccccctgagctggtacagcgaccccggcctggccggcgtgagcctgaccggcggcctgagctacaaggaggacaccaaggagctggtggtggccaaggccggcgtgtactacgtgttcttccagctggagctgcgccgcgtggtggccggcgagggcagcggcagcgtgagcctggccctgcacctgcagcccctgcgcagcgccgccggcgccgccgccctggccctgaccgtggacctgccccccgccagcagcgaggcccgcaacagcgccttcggcttccagggccgcctgctgcacctgagcgccggccagcgcctgggcgtgcacctgcacaccgaggcccgcgcccgccacgcctggcagctgacccagggcgccaccgtgctgggcctgttccgcgtgacccccgagatccccgccggcctgcccagcccccgcagcgag。
表1.cd19-cd3-4-1bbl三特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例2：cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d的表达与纯化
一、cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d的表达
1.1.cho-s细胞(购自thermofisherscientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例1中所制备重组质粒：
管①中加入600μlpbs，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μlpbs，20ulfreestyletmmaxtransfectionreagent(购自thermofisherscientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，co2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mmpb，200mmnacl调节ph至7.5；
2.2proteinl亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：proteinl亲和层析柱(购自gehealthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液a(buffera)：pbs，ph7.4
缓冲液b(bufferb)：0.1mglycine,ph3.0
缓冲液c(bufferc)：0.1mglycine,ph2.7
纯化过程：采用aktaexplorer100型蛋白纯化系统(购自gehealthcare公司)，用buffera预处理proteinl亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5mlbuffera平衡层析柱，平衡后分别用bufferb和bufferc洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1mtris,ph8.0来中和洗脱液ph值，tris终浓度约为10mm)，最后浓缩透析至缓冲液pbs中。
最终纯化的cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d重组蛋白经sds-page分析，还原和非还原条件下电泳图如图2所示。从图中可以看出，经proteinl亲和层析柱纯化后，cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d重组蛋白的纯度均>95％：其中cd19-cd3-4-1bbltsm_m重组蛋白的理论分子量为75.6kda，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，分子量与单体一致，因此该三特异性分子为单体形式(图2a)；cd19-cd3-4-1bbltsm_d重组蛋白的理论分子量为83.5kda，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与二聚体一致(图2b)，说明两个蛋白分子可通过igd铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经n/c末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认cd19-cd3-4-1bbltsm_m为单体形式，cd19-cd3-4-1bbltsm_d为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m的氨基酸序列如seqidno.19所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d的氨基酸序列如seqidno.21所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkaskskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgvacpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。
抗cd19scfv的氨基酸序列如seqidno.39所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvss。
抗cd19scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示，具体为：
qvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvss。
抗cd19scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleik。
抗cd3scfv的氨基酸序列如seqidno.42所示，具体为：
diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk。
抗cd3scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示，具体为：
diklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvss。
抗cd3scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示，具体为：
diqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelk。
4-1bbl胞外区的氨基酸序列如seqidno.45所示，具体为：
acpwavsgaraspgsaasprlregpelspddpaglldlrqgmfaqlvaqnvllidgplswysdpglagvsltgglsykedtkelvvakagvyyvffqlelrrvvagegsgsvslalhlqplrsaagaaalaltvdlppassearnsafgfqgrllhlsagqrlgvhlhteararhawqltqgatvlglfrvtpeipaglpsprse。
单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：
ggggs。
单体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_m连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体为：
ggggsggggsggggs。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.5所示，具体为：
ggggs。
二聚体形式的cd19-cd3-4-1bbltsm_d连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.7所示，具体为：
askskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgv。
实施例3：elisa检测cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d的cd19抗原、cd3抗原及正共刺激分子4-1bb结合活性
elisa操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类cd19-hfc、人类cd3-hfc与人类4-1bb-hfc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(pbs)的配方为：3.58gna2hpo4，0.24gnah2po4，0.2gkcl，8.2gnacl，950mlh2o，用1mol/lhcl或1mol/lnaoh调ph至7.4，补水至1l；
2.封闭：pbs洗板4次后，加入封闭液pbsa(pbs+2％bsa(v/w))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：pbs洗板4次后，分别加入纯化的三特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的cd19-cd3-4-1bbltsm_m或cd19-cd3-4-1bbltsm_d作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：pbst(pbs+0.05％tween-20(v/v))洗板4次后，用封闭液pbsa按1/5000稀释hrp标记的显色抗体(购自abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。pbs洗板4次后，添加显色液tmb(购自kpl公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1mhcl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(od450)。
elisa结果如图3a和图3b所示：图3a说明cd19-cd3-4-1bbltsm_m与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子4-1bb-hfc均具有体外结合活性，其中4-1bb结合活性最高，cd19结合活性次之，cd3结合活性较弱；图3b说明cd19-cd3-4-1bbltsm_d与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子4-1bb-hfc同样具有体外结合活性，其中4-1bb结合活性最高，cd19结合活性次之，cd3结合活性较弱。
实施例4：cd19-cd3-4-1bbl三特异性分子介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-4-1bbltsm_m)、二聚体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-4-1bbltsm_d)以及抗cd19/抗cd3bite双特异抗体(cd19-cd3bsab，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血pbmc制备的cik细胞(cd3+cd56+)与ccl-86raji淋巴瘤细胞(cd19+，购自atcc)，检测细胞死亡情况，比较三种蛋白介导的cik效应细胞对ccl-86raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.pbmc的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自gehealthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的pbs缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的x-vivo15无血清培养基(购自lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.cik细胞培养与扩增：将pbmc用cik基础培养基(90％x-vivo15+10％fbs)(购自gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体anti-cd3(5ug/ml)、全长抗体anti-cd28(5ug/ml)和novonectin(25ug/ml)包被的t25培养瓶中(全长抗体与novonectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子ifn-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和il-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％co2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500u/ml的il-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500u/mlil-2的cik基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.cik细胞对raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100ul，取上述培养的cik细胞1×105个，加入raji细胞1×105个(cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的cd19-cd3bsab、cd19-cd3-4-1bbltsm_m和cd19-cd3-4-1bbltsm_d蛋白样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的cck-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测od450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何蛋白的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图4所示：当cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1时，在未添加任何蛋白的条件下，cik细胞对raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度蛋白(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，cik细胞对raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中cd19-cd3-4-1bbltsm_d所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为96％、92％和87％，cd19-cd3-4-1bbltsm_m的效果次之，杀伤效率约为93％、88％和83％，cd19-cd3bsab的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度蛋白(3.125ng/ml)的条件下，cd19-cd3-4-1bbltsm_d与cd19-cd3-4-1bbltsm_m所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为82％和72％，而cd19-cd3bsab与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的cd19-cd3-4-1bbltite三特异分子所介导的t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于cd19-cd3bite双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例5：cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d真核表达载体的构建
在本发明中，一种融合了1)抗淋巴瘤b细胞表面人类cd19蛋白scfv结构域、2)抗t细胞表面人类cd3蛋白scfv结构域和3)t细胞正共刺激分子配体b7rp-1胞外区结构域的tite三特异性分子被命名为cd19-cd3-b7rp-1tsm。
一、cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d构建方案设计
单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和b7rp-1胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和b7rp-1胞外区序列之间则通过连接片段2(linker2)相连。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和b7rp-1胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和b7rp-1胞外区序列之间以igd铰链区(ala90-val170)作为连接片段2(linker2)相连。
为使三特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗cd19scfv，抗cd3scfv，b7rp-1胞外区序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗cd19scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示。
抗cd19scfv的核苷酸序列如seqidno.50所示。
抗cd3scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示。
抗cd3scfv的核苷酸序列如seqidno.53所示。
b7rp-1胞外区的核苷酸序列如seqidno.57所示，具体为：
gacacccaggagaaggaggtgcgcgccatggtgggcagcgacgtggagctgagctgcgcctgccccgagggcagccgcttcgacctgaacgacgtgtacgtgtactggcagaccagcgagagcaagaccgtggtgacctaccacatcccccagaacagcagcctggagaacgtggacagccgctaccgcaaccgcgccctgatgagccccgccggcatgctgcgcggcgacttcagcctgcgcctgttcaacgtgaccccccaggacgagcagaagttccactgcctggtgctgagccagagcctgggcttccaggaggtgctgagcgtggaggtgaccctgcacgtggccgccaacttcagcgtgcccgtggtgagcgccccccacagccccagccaggacgagctgaccttcacctgcaccagcatcaacggctacccccgccccaacgtgtactggatcaacaagaccgacaacagcctgctggaccaggccctgcagaacgacaccgtgttcctgaacatgcgcggcctgtacgacgtggtgagcgtgctgcgcatcgcccgcacccccagcgtgaacatcggctgctgcatcgagaacgtgctgctgcagcagaacctgaccgtgggcagccagaccggcaacgacatcggcgagcgcgacaagatcaccgagaaccccgtgagcaccggcgagaagaacgccgccacc。
单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.2所示。
单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.4所示。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.6所示。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.8所示。
为使三特异性分子在cho-s细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如seqidno.61所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如seqidno.62所示。
二、cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d真核表达载体构建
本发明三特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcdna3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性分子，分别设计了如表2所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对cd19-cd3-b7rp-1tsm_m的克隆构建，首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-(ggggs)3-b7rp-1-f和pcdna3.1-b7rp-1-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、(ggggs)3linker2+b7rp-1胞外区的基因序列；针对cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的克隆构建，同样首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-igd-f和igd-r、igd-b7rp-1-f和pcdna3.1-b7rp-1-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、igd铰链区linker2、b7rp-1胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用
经测序获知，单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m的核苷酸序列如seqidno.24所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcgacacccaggagaaggaggtgcgcgccatggtgggcagcgacgtggagctgagctgcgcctgccccgagggcagccgcttcgacctgaacgacgtgtacgtgtactggcagaccagcgagagcaagaccgtggtgacctaccacatcccccagaacagcagcctggagaacgtggacagccgctaccgcaaccgcgccctgatgagccccgccggcatgctgcgcggcgacttcagcctgcgcctgttcaacgtgaccccccaggacgagcagaagttccactgcctggtgctgagccagagcctgggcttccaggaggtgctgagcgtggaggtgaccctgcacgtggccgccaacttcagcgtgcccgtggtgagcgccccccacagccccagccaggacgagctgaccttcacctgcaccagcatcaacggctacccccgccccaacgtgtactggatcaacaagaccgacaacagcctgctggaccaggccctgcagaacgacaccgtgttcctgaacatgcgcggcctgtacgacgtggtgagcgtgctgcgcatcgcccgcacccccagcgtgaacatcggctgctgcatcgagaacgtgctgctgcagcagaacctgaccgtgggcagccagaccggcaacgacatcggcgagcgcgacaagatcaccgagaaccccgtgagcaccggcgagaagaacgccgccacc。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的核苷酸序列如seqidno.26所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaaggccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtggacacccaggagaaggaggtgcgcgccatggtgggcagcgacgtggagctgagctgcgcctgccccgagggcagccgcttcgacctgaacgacgtgtacgtgtactggcagaccagcgagagcaagaccgtggtgacctaccacatcccccagaacagcagcctggagaacgtggacagccgctaccgcaaccgcgccctgatgagccccgccggcatgctgcgcggcgacttcagcctgcgcctgttcaacgtgaccccccaggacgagcagaagttccactgcctggtgctgagccagagcctgggcttccaggaggtgctgagcgtggaggtgaccctgcacgtggccgccaacttcagcgtgcccgtggtgagcgccccccacagccccagccaggacgagctgaccttcacctgcaccagcatcaacggctacccccgccccaacgtgtactggatcaacaagaccgacaacagcctgctggaccaggccctgcagaacgacaccgtgttcctgaacatgcgcggcctgtacgacgtggtgagcgtgctgcgcatcgcccgcacccccagcgtgaacatcggctgctgcatcgagaacgtgctgctgcagcagaacctgaccgtgggcagccagaccggcaacgacatcggcgagcgcgacaagatcaccgagaaccccgtgagcaccggcgagaagaacgccgccacc。
表2.cd19-cd3-b7rp-1三特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例6：cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的表达与纯化
一、cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的表达
1.1.cho-s细胞(购自thermofisherscientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例5中所制备重组质粒：
管①中加入600μlpbs，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μlpbs，20ulfreestyletmmaxtransfectionreagent(购自thermofisherscientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，co2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mmpb，200mmnacl调节ph至7.5；
2.2proteinl亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：proteinl亲和层析柱(购自gehealthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液a(buffera)：pbs，ph7.4
缓冲液b(bufferb)：0.1mglycine,ph3.0
缓冲液c(bufferc)：0.1mglycine,ph2.7
纯化过程：采用aktaexplorer100型蛋白纯化系统(购自gehealthcare公司)，用buffera预处理proteinl亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5mlbuffera平衡层析柱，平衡后分别用bufferb和bufferc洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1mtris,ph8.0来中和洗脱液ph值，tris终浓度约为10mm)，最后浓缩透析至缓冲液pbs中。
最终纯化的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d重组蛋白经sds-page分析，还原和非还原条件下电泳图如图5所示。从图中可以看出，经proteinl亲和层析柱纯化后，cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d重组蛋白的纯度均>95％：其中cd19-cd3-b7rp-1tsm_m重组蛋白的理论分子量为80.6kda，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于b7rp-1胞外区结构域存在翻译后n-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该三特异性分子为糖基化的单体形式(图5a)；cd19-cd3-b7rp-1tsm_d重组蛋白的理论分子量为88.5kda，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图5b)，说明两个蛋白分子可通过igd铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经n/c末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认cd19-cd3-b7rp-1tsm_m为单体形式，cd19-cd3-b7rp-1tsm_d为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m的氨基酸序列如seqidno.23所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsdtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaat。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的氨基酸序列如seqidno.25所示，具体为：diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkaskskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgvdtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaat。
抗cd19scfv的氨基酸序列如seqidno.39所示。
抗cd19scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。
抗cd3scfv的氨基酸序列如seqidno.42所示。
抗cd3scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。
b7rp-1胞外区的氨基酸序列如seqidno.46所示，具体为：
dtqekevramvgsdvelscacpegsrfdlndvyvywqtsesktvvtyhipqnsslenvdsryrnralmspagmlrgdfslrlfnvtpqdeqkfhclvlsqslgfqevlsvevtlhvaanfsvpvvsaphspsqdeltftctsingyprpnvywinktdnslldqalqndtvflnmrglydvvsvlriartpsvnigccienvllqqnltvgsqtgndigerdkitenpvstgeknaat。
单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
单体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.3所示。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.5所示。
二聚体形式的cd19-cd3-b7rp-1tsm_d连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.7所示。
实施例7：elisa检测cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d的cd19抗原、cd3抗原及正共刺激分子icos结合活性
elisa操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类cd19-hfc、人类cd3-hfc与人类icos-hfc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(pbs)的配方为：3.58gna2hpo4，0.24gnah2po4，0.2gkcl，8.2gnacl，950mlh2o，用1mol/lhcl或1mol/lnaoh调ph至7.4，补水至1l；
2.封闭：pbs洗板4次后，加入封闭液pbsa(pbs+2％bsa(v/w))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：pbs洗板4次后，分别加入纯化的三特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的cd19-cd3-b7rp-1tsm_m或cd19-cd3-b7rp-1tsm_d作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：pbst(pbs+0.05％tween-20(v/v))洗板4次后，用封闭液pbsa按1/5000稀释hrp标记的显色抗体(购自abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。pbs洗板4次后，添加显色液tmb(购自kpl公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1mhcl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(od450)。
elisa结果如图6a和图6b所示：图6a说明cd19-cd3-b7rp-1tsm_m与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子icos-hfc均具有体外结合活性，其中icos和cd19结合活性均较高，cd3结合活性较弱；图6b说明cd19-cd3-b7rp-1tsm_d与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子icos-hfc同样具有体外结合活性，其中icos和cd19结合活性均较高，cd3结合活性较弱。
实施例8：cd19-cd3-b7rp-1三特异性分子介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-b7rp-1tsm_m)、二聚体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-b7rp-1tsm_d)以及抗cd19/抗cd3bite双特异抗体(cd19-cd3bsab，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血pbmc制备的cik细胞(cd3+cd56+)与ccl-86raji淋巴瘤细胞(cd19+，购自atcc)，检测细胞死亡情况，比较三种蛋白介导的cik效应细胞对ccl-86raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.pbmc的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自gehealthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的pbs缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的x-vivo15无血清培养基(购自lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.cik细胞培养与扩增：将pbmc用cik基础培养基(90％x-vivo15+10％fbs)(购自gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体anti-cd3(5ug/ml)、全长抗体anti-cd28(5ug/ml)和novonectin(25ug/ml)包被的t25培养瓶中(全长抗体与novonectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子ifn-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和il-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％co2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500u/ml的il-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500u/mlil-2的cik基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.cik细胞对raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100ul，取上述培养的cik细胞1×105个，加入raji细胞1×105个(cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的cd19-cd3bsab、cd19-cd3-b7rp-1tsm_m和cd19-cd3-b7rp-1tsm_d蛋白样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的cck-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测od450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何蛋白的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图7所示：当cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1时，在未添加任何蛋白的条件下，cik细胞对raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度蛋白(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，cik细胞对raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中cd19-cd3-b7rp-1tsm_d所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为92％、88％和84％，cd19-cd3-b7rp-1tsm_m的效果次之，杀伤效率约为89％、85％和78％，cd19-cd3bsab的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度蛋白(3.125ng/ml)的条件下，cd19-cd3-b7rp-1tsm_d与cd19-cd3-b7rp-1tsm_m所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为79％和68％，而cd19-cd3bsab与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的cd19-cd3-b7rp-1tite三特异分子所介导的t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于cd19-cd3bite双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例9：cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d真核表达载体的构建
在本发明中，一种融合了1)抗淋巴瘤b细胞表面人类cd19蛋白scfv结构域、2)抗t细胞表面人类cd3蛋白scfv结构域和3)t细胞正共刺激分子配体ox40l胞外区结构域的tite三特异性分子被命名为cd19-cd3-ox40ltsm。
一、cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d构建方案设计
单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和ox40l胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和ox40l胞外区序列之间则通过连接片段2(linker2)相连。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和ox40l胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和ox40l胞外区序列之间以igd铰链区(ala90-val170)作为连接片段2(linker2)相连。
为使三特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗cd19scfv，抗cd3scfv，ox40l胞外区序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗cd19scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示。
抗cd19scfv的核苷酸序列如seqidno.50所示。
抗cd3scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示。
抗cd3scfv的核苷酸序列如seqidno.53所示。
ox40l胞外区的核苷酸序列如seqidno.58所示，具体为：
caggtgagccaccgctacccccgcatccagagcatcaaggtgcagttcaccgagtacaagaaggagaagggcttcatcctgaccagccagaaggaggacgagatcatgaaggtgcagaacaacagcgtgatcatcaactgcgacggcttctacctgatcagcctgaagggctacttcagccaggaggtgaacatcagcctgcactaccagaaggacgaggagcccctgttccagctgaagaaggtgcgcagcgtgaacagcctgatggtggccagcctgacctacaaggacaaggtgtacctgaacgtgaccaccgacaacaccagcctggacgacttccacgtgaacggcggcgagctgatcctgatccaccagaaccccggcgagttctgcgtgctg。
单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.2所示。
单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.4所示。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.6所示。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.8所示。
为使三特异性分子在cho-s细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如seqidno.61所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如seqidno.62所示。
二、cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d真核表达载体构建
本发明三特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcdna3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性分子，分别设计了如表3所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对cd19-cd3-ox40ltsm_m的克隆构建，首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-(ggggs)3-ox40l-f和pcdna3.1-ox40l-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、(ggggs)3linker2+ox40l胞外区的基因序列；针对cd19-cd3-ox40ltsm_d的克隆构建，同样首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-igd-f和igd-r、igd-ox40l-f和pcdna3.1-ox40l-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、igd铰链区linker2、ox40l胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用
经测序获知，单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m和二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m的核苷酸序列如seqidno.28所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgagccaccgctacccccgcatccagagcatcaaggtgcagttcaccgagtacaagaaggagaagggcttcatcctgaccagccagaaggaggacgagatcatgaaggtgcagaacaacagcgtgatcatcaactgcgacggcttctacctgatcagcctgaagggctacttcagccaggaggtgaacatcagcctgcactaccagaaggacgaggagcccctgttccagctgaagaaggtgcgcagcgtgaacagcctgatggtggccagcctgacctacaaggacaaggtgtacctgaacgtgaccaccgacaacaccagcctggacgacttccacgtgaacggcggcgagctgatcctgatccaccagaaccccggcgagttctgcgtgctg。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d的核苷酸序列如seqidno.30所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaaggccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtgcaggtgagccaccgctacccccgcatccagagcatcaaggtgcagttcaccgagtacaagaaggagaagggcttcatcctgaccagccagaaggaggacgagatcatgaaggtgcagaacaacagcgtgatcatcaactgcgacggcttctacctgatcagcctgaagggctacttcagccaggaggtgaacatcagcctgcactaccagaaggacgaggagcccctgttccagctgaagaaggtgcgcagcgtgaacagcctgatggtggccagcctgacctacaaggacaaggtgtacctgaacgtgaccaccgacaacaccagcctggacgacttccacgtgaacggcggcgagctgatcctgatccaccagaaccccggcgagttctgcgtgctg。
表3.cd19-cd3-ox40l三特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例10：cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d的表达与纯化
一、cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d的表达
1.1.cho-s细胞(购自thermofisherscientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例9中所制备重组质粒：
管①中加入600μlpbs，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μlpbs，20ulfreestyletmmaxtransfectionreagent(购自thermofisherscientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，co2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mmpb，200mmnacl调节ph至7.5；
2.2proteinl亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：proteinl亲和层析柱(购自gehealthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液a(buffera)：pbs，ph7.4
缓冲液b(bufferb)：0.1mglycine,ph3.0
缓冲液c(bufferc)：0.1mglycine,ph2.7
纯化过程：采用aktaexplorer100型蛋白纯化系统(购自gehealthcare公司)，用buffera预处理proteinl亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5mlbuffera平衡层析柱，平衡后分别用bufferb和bufferc洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1mtris,ph8.0来中和洗脱液ph值，tris终浓度约为10mm)，最后浓缩透析至缓冲液pbs中。
最终纯化的cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d重组蛋白经sds-page分析，还原和非还原条件下电泳图如图8所示。从图中可以看出，经proteinl亲和层析柱纯化后，cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d重组蛋白的纯度均>95％：其中cd19-cd3-ox40ltsm_m重组蛋白的理论分子量为69.6kda，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于ox40l胞外区结构域存在翻译后n-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该三特异性分子为糖基化的单体形式(图8a)；cd19-cd3-ox40ltsm_d重组蛋白的理论分子量为77.5kda，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图8b)，说明两个蛋白分子可通过igd铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经n/c末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认cd19-cd3-ox40ltsm_m为单体形式，cd19-cd3-ox40ltsm_d为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m的氨基酸序列如seqidno.27所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d的氨基酸序列如seqidno.29所示，具体为：diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkaskskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgvqvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl。
抗cd19scfv的氨基酸序列如seqidno.39所示。
抗cd19scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。
抗cd3scfv的氨基酸序列如seqidno.42所示。
抗cd3scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。
ox40l胞外区的氨基酸序列如seqidno.47所示，具体为：
qvshrypriqsikvqfteykkekgfiltsqkedeimkvqnnsviincdgfylislkgyfsqevnislhyqkdeeplfqlkkvrsvnslmvasltykdkvylnvttdntslddfhvnggelilihqnpgefcvl。
单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
单体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_m连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.3所示。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.5所示。
二聚体形式的cd19-cd3-ox40ltsm_d连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.7所示。
实施例11：elisa检测cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d的cd19抗原、cd3抗原及正共刺激分子ox40结合活性
elisa操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类cd19-hfc、人类cd3-hfc与人类ox40-hfc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(pbs)的配方为：3.58gna2hpo4，0.24gnah2po4，0.2gkcl，8.2gnacl，950mlh2o，用1mol/lhcl或1mol/lnaoh调ph至7.4，补水至1l；
2.封闭：pbs洗板4次后，加入封闭液pbsa(pbs+2％bsa(v/w))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：pbs洗板4次后，分别加入纯化的三特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的cd19-cd3-ox40ltsm_m或cd19-cd3-ox40ltsm_d作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：pbst(pbs+0.05％tween-20(v/v))洗板4次后，用封闭液pbsa按1/5000稀释hrp标记的显色抗体(购自abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。pbs洗板4次后，添加显色液tmb(购自kpl公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1mhcl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(od450)。
elisa结果如图9a和图9b所示：图9a说明cd19-cd3-ox40ltsm_m与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子ox40-hfc均具有体外结合活性，其中cd19结合活性最高，cd3结合活性次之，ox40结合活性较弱；图9b说明cd19-cd3-ox40ltsm_d与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子ox40-hfc同样具有体外结合活性，其中cd19结合活性最高，cd3结合活性次之，ox40结合活性较弱。
实施例12：cd19-cd3-ox40l三特异性分子介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-ox40ltsm_m)、二聚体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-ox40ltsm_d)以及抗cd19/抗cd3bite双特异抗体(cd19-cd3bsab，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血pbmc制备的cik细胞(cd3+cd56+)与ccl-86raji淋巴瘤细胞(cd19+，购自atcc)，检测细胞死亡情况，比较三种蛋白介导的cik效应细胞对ccl-86raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.pbmc的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自gehealthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的pbs缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的x-vivo15无血清培养基(购自lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.cik细胞培养与扩增：将pbmc用cik基础培养基(90％x-vivo15+10％fbs)(购自gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体anti-cd3(5ug/ml)、全长抗体anti-cd28(5ug/ml)和novonectin(25ug/ml)包被的t25培养瓶中(全长抗体与novonectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子ifn-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和il-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％co2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500u/ml的il-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500u/mlil-2的cik基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.cik细胞对raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100ul，取上述培养的cik细胞1×105个，加入raji细胞1×105个(cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的cd19-cd3bsab、cd19-cd3-ox40ltsm_m和cd19-cd3-ox40ltsm_d蛋白样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的cck-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测od450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何蛋白的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图10所示：当cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1时，在未添加任何蛋白的条件下，cik细胞对raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度蛋白(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，cik细胞对raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中cd19-cd3-ox40ltsm_d所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为96％、92％和87％，cd19-cd3-ox40ltsm_m的效果次之，杀伤效率约为93％、88％和82％，cd19-cd3bsab的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度蛋白(3.125ng/ml)的条件下，cd19-cd3-ox40ltsm_d与cd19-cd3-ox40ltsm_m所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为82％和72％，而cd19-cd3bsab与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的cd19-cd3-ox40ltite三特异分子所介导的t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于cd19-cd3bite双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例13：cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d真核表达载体的构建
在本发明中，一种融合了1)抗淋巴瘤b细胞表面人类cd19蛋白scfv结构域、2)抗t细胞表面人类cd3蛋白scfv结构域和3)t细胞正共刺激分子配体gitrl胞外区结构域的tite三特异性分子被命名为cd19-cd3-gitrltsm。
一、cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d构建方案设计
单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和gitrl胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和gitrl胞外区序列之间则通过连接片段2(linker2)相连。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和gitrl胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和gitrl胞外区序列之间以igd铰链区(ala90-val170)作为连接片段2(linker2)相连。
为使三特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗cd19scfv，抗cd3scfv，gitrl胞外区序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗cd19scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示。
抗cd19scfv的核苷酸序列如seqidno.50所示。
抗cd3scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示。
抗cd3scfv的核苷酸序列如seqidno.53所示。
gitrl胞外区的核苷酸序列如seqidno.59所示，具体为：
cagctggagaccgccaaggagccctgcatggccaagttcggccccctgcccagcaagtggcagatggccagcagcgagcccccctgcgtgaacaaggtgagcgactggaagctggagatcctgcagaacggcctgtacctgatctacggccaggtggcccccaacgccaactacaacgacgtggcccccttcgaggtgcgcctgtacaagaacaaggacatgatccagaccctgaccaacaagagcaagatccagaacgtgggcggcacctacgagctgcacgtgggcgacaccatcgacctgatcttcaacagcgagcaccaggtgctgaagaacaacacctactggggcatcatcctgctggccaacccccagttcatcagc。
单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.2所示。
单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.4所示。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.6所示。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.8所示。
为使三特异性分子在cho-s细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如seqidno.61所示。
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如seqidno.62所示。
二、cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d真核表达载体构建
本发明三特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcdna3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性分子，分别设计了如表4所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对cd19-cd3-gitrltsm_m的克隆构建，首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-(ggggs)3-gitrl-f和pcdna3.1-gitrl-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、(ggggs)3linker2+gitrl胞外区的基因序列；针对cd19-cd3-gitrltsm_d的克隆构建，同样首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-igd-f和igd-r、igd-gitrl-f和pcdna3.1-gitrl-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、igd铰链区linker2、gitrl胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用
经测序获知，单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m和二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m的核苷酸序列如seqidno.32所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccagctggagaccgccaaggagccctgcatggccaagttcggccccctgcccagcaagtggcagatggccagcagcgagcccccctgcgtgaacaaggtgagcgactggaagctggagatcctgcagaacggcctgtacctgatctacggccaggtggcccccaacgccaactacaacgacgtggcccccttcgaggtgcgcctgtacaagaacaaggacatgatccagaccctgaccaacaagagcaagatccagaacgtgggcggcacctacgagctgcacgtgggcgacaccatcgacctgatcttcaacagcgagcaccaggtgctgaagaacaacacctactggggcatcatcctgctggccaacccccagttcatcagc。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d的核苷酸序列如seqidno.34所示，具体为：gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaaggccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtgcagctggagaccgccaaggagccctgcatggccaagttcggccccctgcccagcaagtggcagatggccagcagcgagcccccctgcgtgaacaaggtgagcgactggaagctggagatcctgcagaacggcctgtacctgatctacggccaggtggcccccaacgccaactacaacgacgtggcccccttcgaggtgcgcctgtacaagaacaaggacatgatccagaccctgaccaacaagagcaagatccagaacgtgggcggcacctacgagctgcacgtgggcgacaccatcgacctgatcttcaacagcgagcaccaggtgctgaagaacaacacctactggggcatcatcctgctggccaacccccagttcatcagc。
表4.cd19-cd3-gitrl三特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例14：cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d的表达与纯化
一、cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d的表达
1.1.cho-s细胞(购自thermofisherscientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例13中所制备重组质粒：
管①中加入600μlpbs，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μlpbs，20ulfreestyletmmaxtransfectionreagent(购自thermofisherscientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，co2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mmpb，200mmnacl调节ph至7.5；
2.2proteinl亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：proteinl亲和层析柱(购自gehealthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液a(buffera)：pbs，ph7.4
缓冲液b(bufferb)：0.1mglycine,ph3.0
缓冲液c(bufferc)：0.1mglycine,ph2.7
纯化过程：采用aktaexplorer100型蛋白纯化系统(购自gehealthcare公司)，用buffera预处理proteinl亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5mlbuffera平衡层析柱，平衡后分别用bufferb和bufferc洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1mtris,ph8.0来中和洗脱液ph值，tris终浓度约为10mm)，最后浓缩透析至缓冲液pbs中。
最终纯化的cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d重组蛋白经sds-page分析，还原和非还原条件下电泳图如图11所示。从图中可以看出，经proteinl亲和层析柱纯化后，cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d重组蛋白的纯度均>95％：其中cd19-cd3-gitrltsm_m重组蛋白的理论分子量为68.7kda，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于gitrl胞外区结构域存在翻译后n-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该三特异性分子为糖基化的单体形式(图11a)；cd19-cd3-gitrltsm_d重组蛋白的理论分子量为76.6kda，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图11b)，说明两个蛋白分子可通过igd铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经n/c末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认cd19-cd3-gitrltsm_m为单体形式，cd19-cd3-gitrltsm_d为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m的氨基酸序列如seqidno.31所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsqletakepcmakfgplpskwqmasseppcvnkvsdwkleilqnglyliygqvapnanyndvapfevrlyknkdmiqtltnkskiqnvggtyelhvgdtidlifnsehqvlknntywgiillanpqfis。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d的氨基酸序列如seqidno.33所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkaskskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgvqletakepcmakfgplpskwqmasseppcvnkvsdwkleilqnglyliygqvapnanyndvapfevrlyknkdmiqtltnkskiqnvggtyelhvgdtidlifnsehqvlknntywgiillanpqfis。
抗cd19scfv的氨基酸序列如seqidno.39所示。
抗cd19scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。
抗cd3scfv的氨基酸序列如seqidno.42所示。
抗cd3scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。
gitrl胞外区的氨基酸序列如seqidno.48所示，具体为：
qletakepcmakfgplpskwqmasseppcvnkvsdwkleilqnglyliygqvapnanyndvapfevrlyknkdmiqtltnkskiqnvggtyelhvgdtidlifnsehqvlknntywgiillanpqfis。
单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
单体形式的cd19-cd3-gitrltsm_m连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.3所示。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.5所示。
二聚体形式的cd19-cd3-gitrltsm_d连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.7所示。
实施例15：elisa检测cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d的cd19抗原、cd3抗原及正共刺激分子gitr结合活性
elisa操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类cd19-hfc、人类cd3-hfc与人类gitr-hfc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(pbs)的配方为：3.58gna2hpo4，0.24gnah2po4，0.2gkcl，8.2gnacl，950mlh2o，用1mol/lhcl或1mol/lnaoh调ph至7.4，补水至1l；
2.封闭：pbs洗板4次后，加入封闭液pbsa(pbs+2％bsa(v/w))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：pbs洗板4次后，分别加入纯化的三特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的cd19-cd3-gitrltsm_m或cd19-cd3-gitrltsm_d作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：pbst(pbs+0.05％tween-20(v/v))洗板4次后，用封闭液pbsa按1/5000稀释hrp标记的显色抗体(购自abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。pbs洗板4次后，添加显色液tmb(购自kpl公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1mhcl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(od450)。
elisa结果如图12a和图12b所示：图12a说明cd19-cd3-gitrltsm_m与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子gitr-hfc均具有体外结合活性，其中gitr结合活性最高，cd19结合活性次之，cd3结合活性较弱；图12b说明cd19-cd3-gitrltsm_d与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子gitr-hfc同样具有体外结合活性，其中gitr结合活性最高，cd19结合活性次之，cd3结合活性较弱。
实施例16：cd19-cd3-gitrl三特异性分子介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-gitrltsm_m)、二聚体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-gitrltsm_d)以及抗cd19/抗cd3bite双特异抗体(cd19-cd3bsab，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血pbmc制备的cik细胞(cd3+cd56+)与ccl-86raji淋巴瘤细胞(cd19+，购自atcc)，检测细胞死亡情况，比较三种蛋白介导的cik效应细胞对ccl-86raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.pbmc的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自gehealthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的pbs缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的x-vivo15无血清培养基(购自lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.cik细胞培养与扩增：将pbmc用cik基础培养基(90％x-vivo15+10％fbs)(购自gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体anti-cd3(5ug/ml)、全长抗体anti-cd28(5ug/ml)和novonectin(25ug/ml)包被的t25培养瓶中(全长抗体与novonectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子ifn-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和il-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％co2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500u/ml的il-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500u/mlil-2的cik基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.cik细胞对raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100ul，取上述培养的cik细胞1×105个，加入raji细胞1×105个(cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的cd19-cd3bsab、cd19-cd3-gitrltsm_m和cd19-cd3-gitrltsm_d蛋白样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的cck-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测od450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何蛋白的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图13所示：当cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1时，在未添加任何蛋白的条件下，cik细胞对raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度蛋白(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，cik细胞对raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中cd19-cd3-gitrltsm_d所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为92％、88％和84％，cd19-cd3-gitrltsm_m的效果次之，杀伤效率约为89％、85％和78％，cd19-cd3bsab的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度蛋白(3.125ng/ml)的条件下，cd19-cd3-gitrltsm_d与cd19-cd3-gitrltsm_m所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率仍有一定程度地提高，杀伤效率分别约为78％和68％，而cd19-cd3bsab与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的cd19-cd3-gitrltite三特异分子所介导的t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于cd19-cd3bite双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
实施例17：cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d真核表达载体的构建
在本发明中，一种融合了1)抗淋巴瘤b细胞表面人类cd19蛋白scfv结构域、2)抗t细胞表面人类cd3蛋白scfv结构域和3)t细胞正共刺激分子配体cd70胞外区结构域的tite三特异性分子被命名为cd19-cd3-cd70tsm。
一、cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d构建方案设计
单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和cd70胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和cd70胞外区序列之间则通过连接片段2(linker2)相连。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d具体构建方案为：抗cd19scfv，抗cd3scfv和cd70胞外区的序列通过连接片段(linker)相连，具体地，抗cd19scfv和抗cd3scfv之间通过连接片段1(linker1)相连，抗cd3scfv和cd70胞外区序列之间以igd铰链区(ala90-val170)作为连接片段2(linker2)相连。
为使三特异性分子在哺乳细胞中进行表达，针对抗cd19scfv，抗cd3scfv，cd70胞外区序列均进行了哺乳系统表达的密码子优化。
具体地，抗cd19scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.51所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.52所示。
抗cd19scfv的核苷酸序列如seqidno.50所示。
抗cd3scfv的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.54所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.55所示。
抗cd3scfv的核苷酸序列如seqidno.53所示。
cd70胞外区的核苷酸序列如seqidno.60所示，具体为：
cagcgcttcgcccaggcccagcagcagctgcccctggagagcctgggctgggacgtggccgagctgcagctgaaccacaccggcccccagcaggacccccgcctgtactggcagggcggccccgccctgggccgcagcttcctgcacggccccgagctggacaagggccagctgcgcatccaccgcgacggcatctacatggtgcacatccaggtgaccctggccatctgcagcagcaccaccgccagccgccaccaccccaccaccctggccgtgggcatctgcagccccgccagccgcagcatcagcctgctgcgcctgagcttccaccagggctgcaccatcgccagccagcgcctgacccccctggcccgcggcgacaccctgtgcaccaacctgaccggcaccctgctgcccagccgcaacaccgacgagaccttcttcggcgtgcagtgggtgcgcccc。
单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.2所示。
单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.4所示。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d连接片段1(linker1)的核苷酸序列如seqidno.6所示。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d连接片段2(linker2)的核苷酸序列如seqidno.8所示。
为使三特异性分子在cho-s细胞中表达并成功分泌到培养基中，选择了分泌型表达的信号肽用于此实施例。
该分泌表达信号肽的氨基酸序列如seqidno.61所示
该分泌表达信号肽的核苷酸序列如seqidno.62所示
二、cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d真核表达载体构建
本发明三特异性分子的构建与表达，选用哺乳细胞蛋白瞬时表达载体pcdna3.1(购自上海英骏生物科技有限公司)。为构建单体和二聚体形式的三特异性分子，分别设计了如表5所示引物，所有引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，扩增所需基因模板由苏州鸿讯科技有限公司合成。
针对cd19-cd3-cd70tsm_m的克隆构建，首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-(ggggs)3-cd70-f和pcdna3.1-cd70-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、(ggggs)3linker2+cd70胞外区的基因序列；针对cd19-cd3-cd70tsm_d的克隆构建，同样首先使用引物pcdna3.1-sig-f和sig-r扩增出信号肽片段，然后分别利用引物sig-cd19-f和cd19-r、cd19-g4s-cd3-f和cd3-r、cd3-igd-f和igd-r、igd-cd70-f和pcdna3.1-cd70-r扩增出抗cd19scfv、ggggslinker1+抗cd3scfv、igd铰链区linker2、cd70胞外区的基因序列。扩增完毕后，利用
经测序获知，单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m和二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d的全长基因序列正确，均与预期相符。
具体地，单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m的核苷酸序列如seqidno.36所示，具体为：
gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccagcgcttcgcccaggcccagcagcagctgcccctggagagcctgggctgggacgtggccgagctgcagctgaaccacaccggcccccagcaggacccccgcctgtactggcagggcggccccgccctgggccgcagcttcctgcacggccccgagctggacaagggccagctgcgcatccaccgcgacggcatctacatggtgcacatccaggtgaccctggccatctgcagcagcaccaccgccagccgccaccaccccaccaccctggccgtgggcatctgcagccccgccagccgcagcatcagcctgctgcgcctgagcttccaccagggctgcaccatcgccagccagcgcctgacccccctggcccgcggcgacaccctgtgcaccaacctgaccggcaccctgctgcccagccgcaacaccgacgagaccttcttcggcgtgcagtgggtgcgcccc。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d的核苷酸序列如seqidno.38所示，具体为：gacatccagctgacccagagccccgccagcctggccgtgagcctgggccagcgcgccaccatcagctgcaaggccagccagagcgtggactacgacggcgacagctacctgaactggtaccagcagatccccggccagccccccaagctgctgatctacgacgccagcaacctggtgagcggcatccccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaacatccaccccgtggagaaggtggacgccgccacctaccactgccagcagagcaccgaggacccctggaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagccaggtgcagctgcagcagagcggcgccgagctggtgcgccccggcagcagcgtgaagatcagctgcaaggccagcggctacgccttcagcagctactggatgaactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggccagatctggcccggcgacggcgacaccaactacaacggcaagttcaagggcaaggccaccctgaccgccgacgagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctggccagcgaggacagcgccgtgtacttctgcgcccgccgcgagaccaccaccgtgggccgctactactacgccatggactactggggccagggcaccaccgtgaccgtgagcagcggcggcggcggcagcgacatcaagctgcagcagagcggcgccgagctggcccgccccggcgccagcgtgaagatgagctgcaagaccagcggctacaccttcacccgctacaccatgcactgggtgaagcagcgccccggccagggcctggagtggatcggctacatcaaccccagccgcggctacaccaactacaaccagaagttcaaggacaaggccaccctgaccaccgacaagagcagcagcaccgcctacatgcagctgagcagcctgaccagcgaggacagcgccgtgtactactgcgcccgctactacgacgaccactactgcctggactactggggccagggcaccaccctgaccgtgagcagcgtggagggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcagcggcggcgtggacgacatccagctgacccagagccccgccatcatgagcgccagccccggcgagaaggtgaccatgacctgccgcgccagcagcagcgtgagctacatgaactggtaccagcagaagagcggcaccagccccaagcgctggatctacgacaccagcaaggtggccagcggcgtgccctaccgcttcagcggcagcggcagcggcaccagctacagcctgaccatcagcagcatggaggccgaggacgccgccacctactactgccagcagtggagcagcaaccccctgaccttcggcgccggcaccaagctggagctgaaggccagcaagagcaagaaggagatcttccgctggcccgagagccccaaggcccaggccagcagcgtgcccaccgcccagccccaggccgagggcagcctggccaaggccaccaccgcccccgccaccacccgcaacaccggccgcggcggcgaggagaagaagaaggagaaggagaaggaggagcaggaggagcgcgagaccaagacccccgagtgccccagccacacccagcccctgggcgtgcagcgcttcgcccaggcccagcagcagctgcccctggagagcctgggctgggacgtggccgagctgcagctgaaccacaccggcccccagcaggacccccgcctgtactggcagggcggccccgccctgggccgcagcttcctgcacggccccgagctggacaagggccagctgcgcatccaccgcgacggcatctacatggtgcacatccaggtgaccctggccatctgcagcagcaccaccgccagccgccaccaccccaccaccctggccgtgggcatctgcagccccgccagccgcagcatcagcctgctgcgcctgagcttccaccagggctgcaccatcgccagccagcgcctgacccccctggcccgcggcgacaccctgtgcaccaacctgaccggcaccctgctgcccagccgcaacaccgacgagaccttcttcggcgtgcagtgggtgcgcccc。
表5.cd19-cd3-cd70三特异性分子基因克隆中使用的引物
实施例18：cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d的表达与纯化
一、cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d的表达
1.1.cho-s细胞(购自thermofisherscientific公司)转染前1天传代密度为0.5～0.6×106/ml；
1.2.转染当天进行细胞密度统计，当密度为1～1.4×106/ml、活力>90％时，可用于质粒转染；
1.3.转染复合物配制：每个项目(cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d)需准备两个离心管/培养瓶，以20ml为例，分别放置，取实施例17中所制备重组质粒：
管①中加入600μlpbs，20μg重组质粒，混匀；
管②中加入600μlpbs，20ulfreestyletmmaxtransfectionreagent(购自thermofisherscientific公司)，混匀；
1.4.将稀释后的转染试剂，加入至稀释后的重组质粒中，混合均匀，配制成转染复合物；
1.5.转染复合物静置15～20min后，单滴匀速加入细胞培养物中；
1.6.于37℃，co2浓度8％，摇床转速130rpm条件下进行转染后细胞培养，5天后收集培养上清进行目的蛋白表达检测。
二、cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d的纯化
2.1样品预处理
取上述转染后细胞培养上清20ml，加入缓冲液20mmpb，200mmnacl调节ph至7.5；
2.2proteinl亲和层析柱纯化
蛋白纯化层析柱：proteinl亲和层析柱(购自gehealthcare公司，柱体积1.0ml)
缓冲液a(buffera)：pbs，ph7.4
缓冲液b(bufferb)：0.1mglycine,ph3.0
缓冲液c(bufferc)：0.1mglycine,ph2.7
纯化过程：采用aktaexplorer100型蛋白纯化系统(购自gehealthcare公司)，用buffera预处理proteinl亲和层析柱，取培养上清上样，收集流出液。上样完毕后，用至少1.5mlbuffera平衡层析柱，平衡后分别用bufferb和bufferc洗脱，收集目的蛋白洗脱液(洗脱液的收集管需要预先加入1％的1mtris,ph8.0来中和洗脱液ph值，tris终浓度约为10mm)，最后浓缩透析至缓冲液pbs中。
最终纯化的cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d重组蛋白经sds-page分析，还原和非还原条件下电泳图如图14所示。从图中可以看出，经proteinl亲和层析柱纯化后，cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d重组蛋白的纯度均>95％：其中cd19-cd3-cd70tsm_m重组蛋白的理论分子量为71.3kda，还原和非还原条件下该蛋白均呈现单一电泳条带，由于cd70胞外区结构域存在翻译后n-糖基化修饰，因此实际分子量与理论值相比偏大，该三特异性分子为糖基化的单体形式(图14a)；cd19-cd3-cd70tsm_d重组蛋白的理论分子量为79.2kda，还原条件下该蛋白电泳条带所呈现分子量与糖基化的单体一致，非还原条件下电泳条带所呈现分子量与糖基化的二聚体一致(图14b)，说明两个蛋白分子可通过igd铰链区形成二硫键相互连接，因此该三特异性分子为二聚体形式。
此外，纯化的重组蛋白样品经n/c末端序列分析，结果表明所表达的重组蛋白样品均读框无误，与理论n/c末端氨基酸序列一致，质谱分析进一步确认cd19-cd3-cd70tsm_m为单体形式，cd19-cd3-cd70tsm_d为二聚体形式。
因此，可得知，单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m的氨基酸序列如seqidno.35所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkggggsggggsggggsqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d的氨基酸序列如seqidno.37所示，具体为：
diqltqspaslavslgqratisckasqsvdydgdsylnwyqqipgqppklliydasnlvsgipprfsgsgsgtdftlnihpvekvdaatyhcqqstedpwtfgggtkleikggggsggggsggggsqvqlqqsgaelvrpgssvkisckasgyafssywmnwvkqrpgqglewigqiwpgdgdtnyngkfkgkatltadessstaymqlsslasedsavyfcarretttvgryyyamdywgqgttvtvssggggsdiklqqsgaelarpgasvkmscktsgytftrytmhwvkqrpgqglewigyinpsrgytnynqkfkdkatlttdkssstaymqlssltsedsavyycaryyddhycldywgqgttltvssveggsggsggsggsggvddiqltqspaimsaspgekvtmtcrasssvsymnwyqqksgtspkrwiydtskvasgvpyrfsgsgsgtsysltissmeaedaatyycqqwssnpltfgagtklelkaskskkeifrwpespkaqassvptaqpqaegslakattapattrntgrggeekkkekekeeqeeretktpecpshtqplgvqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp。
抗cd19scfv的氨基酸序列如seqidno.39所示。
抗cd19scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.40所示。
抗cd19scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.41所示。
抗cd3scfv的氨基酸序列如seqidno.42所示。
抗cd3scfv的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.43所示。
抗cd3scfv的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.44所示。
cd70胞外区的氨基酸序列如seqidno.49所示，具体为：
qrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp。
单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.1所示。
单体形式的cd19-cd3-cd70tsm_m连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.3所示。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d连接片段1(linker1)的氨基酸序列如seqidno.5所示。
二聚体形式的cd19-cd3-cd70tsm_d连接片段2(linker2)的氨基酸序列如seqidno.7所示。
实施例19：elisa检测cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d的cd19抗原、cd3抗原及正共刺激分子cd27结合活性
elisa操作步骤：
1.重组蛋白包被：人类cd19-hfc、人类cd3-hfc与人类cd27-hfc融合蛋白(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别包被96孔板，蛋白浓度为1μg/ml，包被体积为100μl/孔，包被条件为37℃1小时或4℃过夜，包被缓冲液(pbs)的配方为：3.58gna2hpo4，0.24gnah2po4，0.2gkcl，8.2gnacl，950mlh2o，用1mol/lhcl或1mol/lnaoh调ph至7.4，补水至1l；
2.封闭：pbs洗板4次后，加入封闭液pbsa(pbs+2％bsa(v/w))，200μl/孔。37℃封闭1小时；
3.加样：pbs洗板4次后，分别加入纯化的三特异性分子样品，100μl/孔，37℃孵育1小时，样品梯度配制方法：以10μg/ml纯化的cd19-cd3-cd70tsm_m或cd19-cd3-cd70tsm_d作为起始浓度，进行倍比稀释6个梯度，每个梯度设置2个复孔；
4.显色：pbst(pbs+0.05％tween-20(v/v))洗板4次后，用封闭液pbsa按1/5000稀释hrp标记的显色抗体(购自abcam公司)，按100μl/孔加入，37℃孵育1小时。pbs洗板4次后，添加显色液tmb(购自kpl公司)，100μl/孔，室温避光显色5～10分钟；
5.终止反应与结果测定：添加终止液(1mhcl)，100μl/孔，在酶标仪上450nm波长下读取吸光值(od450)。
elisa结果如图15a和图15b所示：图15a说明cd19-cd3-cd70tsm_m与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子cd27-hfc均具有体外结合活性，其中cd27和cd19结合活性均较高，cd3结合活性较弱；图15b说明cd19-cd3-cd70tsm_d与抗原cd19-hfc、抗原cd3-hfc和t细胞正共刺激分子cd27-hfc同样具有体外结合活性，其中cd27和cd19结合活性均较高，cd3结合活性较弱。
实施例20：cd19-cd3-cd70三特异性分子介导的细胞杀伤实验
以人外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)为实验材料，用本发明所制备的上述单体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-cd70tsm_m)、二聚体形式的tite三特异分子(cd19-cd3-cd70tsm_d)以及抗cd19/抗cd3bite双特异抗体(cd19-cd3bsab，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)分别作用于同一供体来源的人血pbmc制备的cik细胞(cd3+cd56+)与ccl-86raji淋巴瘤细胞(cd19+，购自atcc)，检测细胞死亡情况，比较三种蛋白介导的cik效应细胞对ccl-86raji靶细胞的杀伤效率差异。
细胞杀伤实验步骤：
1.pbmc的分离：使用新抽取的志愿者抗凝血液，加入等体积的医用生理盐水，沿离心管壁缓慢加入与血液等体积的淋巴细胞分离液(购自gehealthcare公司)，保持液面分层明显，2000rpm离心20min，吸取中间白雾状的细胞层于新的离心管中，加入2倍以上体积的pbs缓冲液洗涤，1100rpm离心10min，重复洗涤一次，用少量预冷的x-vivo15无血清培养基(购自lonza公司)重悬，细胞计数待用；
2.cik细胞培养与扩增：将pbmc用cik基础培养基(90％x-vivo15+10％fbs)(购自gbico公司)重悬，调整细胞密度为1×106/ml，添加到全长抗体anti-cd3(5ug/ml)、全长抗体anti-cd28(5ug/ml)和novonectin(25ug/ml)包被的t25培养瓶中(全长抗体与novonectin均购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，同时添加细胞因子ifn-γ(200ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)和il-1β(2ng/ml，购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)，置于培养箱，在饱和湿度、37℃、5.0％co2的条件下进行培养。培养过夜后，添加500u/ml的il-2(购自吴江近岸蛋白质科技有限公司)继续培养，每2～3天计数并用添加500u/mlil-2的cik基础培养基按1×106/ml的密度进行细胞传代；
3.cik细胞对raji细胞的杀伤效率：在96孔板中进行细胞杀伤实验，反应体积为100ul，取上述培养的cik细胞1×105个，加入raji细胞1×105个(cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1)，分别添加不同终浓度(25、12.5、6.25、3.125ng/ml)的cd19-cd3bsab、cd19-cd3-cd70tsm_m和cd19-cd3-cd70tsm_d蛋白样品，室温混匀3～5min，37℃共培养3h后，每孔添加10μl的cck-8,37℃继续反应2～3h，随后用酶标仪测od450值，按照以下公式计算细胞杀伤效率，每组实验重复检测3次；同时以未添加任何蛋白的细胞杀伤效率作为空白对照。
结果如图16所示：当cik效应细胞：raji靶细胞(e：t比)为1：1时，在未添加任何蛋白的条件下，cik细胞对raji细胞3h的杀伤效率约为23％；在添加较高浓度蛋白(25、12.5、6.25ng/ml)的条件下，cik细胞对raji细胞的杀伤效率均有显著地提高，其中cd19-cd3-cd70tsm_d所介导的细胞杀伤效果最好，杀伤效率分别约为96％、92％和87％，cd19-cd3-cd70tsm_m的效果次之，杀伤效率约为93％、88％和83％，cd19-cd3bsab的效果最弱，杀伤效率分别约为80％、54％和54％；在添加较低浓度蛋白(3.125ng/ml)的条件下，cd19-cd3-cd70tsm_d与cd19-cd3-cd70tsm_m所介导的cik细胞对raji细胞的杀伤效率仍有明显地提高，杀伤效率分别约为82％和72％，而cd19-cd3bsab与空白对照相比基本没有效果。上述结果说明两种形式的cd19-cd3-cd70tite三特异分子所介导的t细胞对cd19阳性肿瘤细胞的靶向杀伤活性均优于cd19-cd3bite双特异性抗体，其中二聚体形式较单体形式具有更好的效果。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
sequencelisting
<110>上海近岸生物科技有限公司
<120>一种融合抗cd19、抗cd3抗体结构域和t细胞正共刺激分子配体的三特异性分
子及其应用
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