本发明涉及微生物学和植物病害生防技术领域，具体地说，涉及一株环状芽胞杆菌Y3及其在防治作物土传病害中的应用。
背景技术：
随着作物产量水平的提高和设施农业发展，土传病害与连作障碍问题日趋突出，土壤病原微生物不断增加，引发作物减产甚至绝收。土传病害与连作障碍已经成为农业安全生产发展的瓶颈。作物连作3年，产量降低10％～20％,连作4～5年作物减产40～50％。设施蔬菜、马铃薯、大蒜、向日葵、油菜、棉花、大豆、水稻、小麦、甜菜土传病害时常发生，减产日益严重，影响农民增产增收。我国遭受严重土传病害、连作障碍危害的面积高达5亿亩。
由于土传病害加重，我国每年使用的农药量超过130万吨，农药使用量普遍超标，平均每亩施用931.3g，比发达国家高出一倍。全国受农药污染的农田约1600万公顷，主要农产品中的农药残留超标率高达20％。土传病害防治技术没有得到有效的解决，生物防治土传病害是替代化学农药的最佳选择。
土传病害生物防治的菌种多为木霉菌、链霉菌、寡雄腐霉菌、芽孢菌等为佳。防治土传病害的微生物菌剂产品，己商品化的产品如澳大利亚的K84，放射形龙杆菌菌株K84在1973年就被大规模生产，用来防治根癌病；1988年Gustafson公司在美国注册生产A13产品Kodiak，成为作物生防菌商业化生产的拓疆者。利用荧光假单胞菌(P.fluorescens CHA0)生产的杀真菌制剂Yield能够防治土壤真菌病害。普利茅斯沙雷氏菌(Serratia plymuthica HRO-C48)生产的产品和放线菌(Streptomyces sp.HRO-71)生产的防治草莓和土豆生物黄萎病(Verticillium dahliae)。Trichoderma reesei G1和Trichoderma viride G3防治立枯病效果显著。
美国研制的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列研制的Trichodex(哈茨木霉T39)均是用于防治真菌病害如灰霉病以及以色列Mycontrol公司开发的商品制剂Trichoderma2000主要用于防治立枯丝核菌、齐整小核菌、疫霉等；盾壳霉也是研究较多的一种生防菌，盾壳霉对核盘菌属及葱白腐小菌核菌引起的多种植物病害均有很强的抑制作用。现在国外已有商品化产品出现，如前苏联开发的商品制剂Coniothyrin可以用于防治向日葵的菌核病，德国开发的商品制剂ntansWG可用于防治莴苣的核盘菌菌核病等。此外还有针对粘帚霉(Gliocladium virens)，由美国研制成功的SoilGard，用于防治猝倒病和根腐等，意大利研制的BiofoxC专用于防治镰刀菌属病害等。我国商品化的木霉菌杀菌剂(生菌消，又名灭菌灵)，主要用于防治各种作物的霜霉病，我国开发的5406抗生菌为链霉菌属，定名为泾阳链霉菌，对黄萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多种植物病害具有抗性，并且可促进植物生长。拮抗细菌(Bacillus subtilis)大面积示范推广试验证明，拮抗菌在水稻植株上定植能力较强，繁殖较快，对纹枯病防效达75％～85％，对稻曲病防效达63.8％～85.7％。拮抗木霉菌和拮抗细菌混合发酵制成粉剂，成功地防治了保护地蔬菜和甜瓜的苗期病害。其它报道的细菌杀菌剂用来防治黄瓜及烟草炭疽病菌的地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌防治甘蔗黑腐病，放射假单孢杆菌防治小麦全蚀病等。木霉菌厚垣孢子制剂对新疆棉花黄萎病大面积试验防效达到60％，增产50％，棉绒长度增加10％，表现出了良好的应用前景。
向日葵具有耐盐碱、耐瘠薄、抗干旱适应性强等特性,籽实含油率高,油质优良,现已成为世界第4大油料作物。2002年全球向日葵种植面积为2600万hm2，葵花籽产量为2400万t。据报道，2014、2015年度全球葵花籽产量1551.9万t。2004年我国向日葵面积为113.1万hm2，总产为194.6万t，2007年我国向日葵播种面积102万hm2，总产量为192.8万t，单产1889.3kg/ha。
向日葵连作导致土壤养分特别是钾元素过度消耗，地力难以恢复。向日葵病害如菌核病、锈病、褐斑病、霜霉病、叶枯病，以及葵螟、蛴螬、小地老虎等，都会因连作而危害加剧。向日葵菌核病，又称白腐病、烂盘病，对向日葵的产量和品质影响很大。
向日葵菌核病发生很广泛，发病较重，可造成向日葵茎折、花盘及种仁腐烂，对向日葵生产造成严重威胁。常见的有根腐型、茎腐型、叶腐型、花腐型4种类型，其中根腐型、花腐型受害重。花腐型病害表现为花盘受害后，盘背面出现水浸状病斑。
目前主要是药剂防治:①用40％纹枯利800～1000倍液；②用50％托布津可湿性粉剂1000倍液；③用50％速克灵500～1000倍液。防治效果并不十分理想，防治效果仅为80％左右，因此，研发防治土传病害与连作障碍的生物肥料非常重要。
技术实现要素：
本发明的目的是针对我国向日葵连作导致菌核病和锈病频繁发生、减产严重甚至绝收的生产问题，提供一株高效防治向日葵菌核病和锈病的环状芽胞杆菌Y3及其制备的微生物菌剂。
本发明的另一目的是提供所述环状芽胞杆菌Y3在防治作物土传病害中的应用。
为了实现本发明目的，本发明从我国吉林省公主岭农田土壤中分离并纯化获得一株高效防治向日葵菌核病和锈病的环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)Y3，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC NO.13511，保藏日期2016年12月28日。
根据菌株Y3的菌学特征及16S rDNA测序结果(SEQ ID NO:1)，确定菌株Y3为环状芽胞杆菌。
本发明还提供含有所述环状芽胞杆菌Y3的微生物菌剂。
本发明所述菌剂中还含有添加剂和保护剂。
其中，所述添加剂为二氧化硅、轻质碳酸钙、高岭土、膨润土、稻壳粉、麦壳粉、秸秆粉等中的至少一种。
所述保护剂为甘油、脱脂奶、植物油、海藻酸钠、壳聚糖等中的至少一种。
本发明提供的菌剂由如下重量份的组分组成：
环状芽胞杆菌Y3发酵液 1份；
添加剂 0.5-3份；
保护剂 0.01-0.05份；
所述菌剂中环状芽胞杆菌Y3活菌数为2×108-5×109cfu/g，优选5×108cfu/g。
本发明还提供所述环状芽胞杆菌Y3或所述菌剂在防治作物土传病害(向日葵菌核菌病、向日葵锈病、大棚蔬菜连作障碍)中的应用。
所述土传病害的病原菌包括核盘菌、向日葵柄锈菌、尖镰孢菌等。
本发明还提供所述环状芽胞杆菌Y3或所述菌剂在提高作物产量中的应用。
所述作物包括大棚蔬菜。优选地，所述作物包括向日葵、大蒜、玉米、油菜、西红柿等。
本发明还提供所述环状芽胞杆菌Y3或所述菌剂在制备农用复混肥中的应用。
本发明还提供一种农用复混肥，由有效成分为环状芽胞杆菌Y3的菌剂与氮肥、磷肥、钾肥或复合肥组成。
本发明提供的有效成分为环状芽胞杆菌Y3的微生物菌剂对于田间向日葵的促生增产效果明显，且其作用效果不受田间土壤条件、化肥使用的抑制，可以在轻度盐碱农田中，与化肥一起施用。该菌剂对向日葵核盘引发的烂盘病防治效果达到95％以上，锈病防治效果达100％，向日葵增产20％-30％，向日葵增产20％-50％，盆栽试验结果表明促进作物生长，生物量提高15-70％。该微生物菌剂对我国农田土传病害和连作障碍防治，粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例9中Y3菌株平板抑制尖镰孢菌的效果；其中，A、B分别表示Y16抑制尖镰孢菌的PDYA平板的正面和反面。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1 环状芽胞杆菌Y3菌剂的制备
1.环状芽胞杆菌Y3的分离及纯化
从我国吉林省公主岭农田土壤中分离并纯化获得一株高效防治向日葵菌核病和锈病的菌株Y3。
根据菌株Y3的菌学特征及16S rDNA测序结果(SEQ ID NO:1)，确定菌株Y3为环状芽胞杆菌。
2.环状芽胞杆菌Y3的培养
(1)培养基的组成(kg/t发酵液)
可溶性淀粉10kg，黄豆饼粉10kg，玉米粉5kg，葡萄糖1kg，蔗糖10kg，酵母粉5kg，(NH4)2SO4 3kg，K2HPO4 0.2kg，NaCl 2.5kg，MgSO4·7H2O 0.1kg，CaCO3 0.5kg，FeSO40.001kg，硼酸(1％)1L，pH7.0，以水配制。
(2)发酵培养过程
将环状芽胞杆菌Y3接种于土豆蔗糖(PDA)培养基上，25～28℃培养3d。将环状芽胞杆菌Y3转接入1000mL三角瓶，26-28℃，220r/min下液体发酵培养36h。然后按1％接种量接入50L种子罐，在200r/min、pH7.0、通气量0.7vvm条件下，培养36h后，再按10v/v％接种量转入500L发酵罐，在220r/min，pH7.0，通气量0.7～1.0vvm下，培养3d。
3.环状芽胞杆菌Y3菌剂的制备
发酵后加入保护剂海藻酸钠，环状芽胞杆菌Y3以轻质碳酸钙吸附。
4.环状芽胞杆菌Y3菌剂造粒
向以上吸附、混合好的菌剂中加入适量稻壳粉、秸秆粉和膨润土粘结造粒，根据生产需要造粒形成适合向日葵的颗粒菌剂(活菌数为5×108cfu/g)，与向日葵种子播种机一起施入土壤；或者利用造粒机形成与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥粒径近似的颗粒生物肥料，其生物肥料与尿素、磷酸二铵、钾肥、复合肥一起机械施入土壤。
实施例2 环状芽胞杆菌Y3菌剂对盆栽玉米的促生效果
1.在温室条件下进行了Y3菌剂的接种试验，土壤来自于唐家岭农田土壤。盆栽条件下种植玉米，分别接种2菌株制备的生物肥料菌剂。处理分别为CK、ACCC 10094和Y3，菌株ACCC 10094为解钾细菌，作为对照菌株。结果显示，ACCC 10094和Y3菌株都具有促进作物生长的效果，都能提高玉米的生物量(表1)。菌株ACCC10094、Y3处理玉米鲜重生物量分别达到16.2g/盆和18.4g/盆，比对照分别提高28.6％和46.0％；菌株ACCC10094、Y3的干重生物量分别达到1.504g/盆和1.8626g/盆，比对照分别提高13.5％和40.6％。Y3菌株的玉米生物量最高，表明其促进玉米生长的作用效果显著。
表1 Y3菌剂对盆栽玉米生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著。
实施例3 Y3菌剂对盆栽油菜的促生效果
盆栽试验土壤来自于唐家岭农田土壤，盆栽条件下种植油菜，分别接种ACCC10094、Y3菌株制备的生物肥料菌剂。接种ACCC10094、Y3菌剂处理的油菜生物量鲜重分别达到5.475g/盆和7.66g/盆，比对照分别提高73.3％和142.4％；接种ACCC10094、Y3菌剂，油菜生物量干重分别为1.036g/盆和1.276g/盆，比对照分别提高38.9％和71.0％。Y3菌株制备的菌剂显著提高油菜的生物量。
表2 Y3菌剂对盆栽油菜生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著。
实施例4环状芽胞杆菌Y3菌剂对盆栽西红柿的促生效果
盆栽条件下种植向日葵，分别接种2种生物肥料菌剂，菌剂由Y3、ACCC 40120制备而成。试验结果显示，2种微生物菌剂都能够提高西红柿的生物量(表3)。Y3菌剂生物量最高，鲜重和干重分别达到55.40g/盆和7.69g/盆，比对照分别提高46.5％和15.5％；ACCC40120的鲜重和干重低于Y3，分别为43.89g/盆和7.54g/盆，比对照分别提高16.1％和13.3％。表明Y3菌剂具有促进向日葵生长的显著效果。
表3 Y3菌剂对盆栽西红柿生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著。
实施例5 Y3菌剂对盆栽大蒜的促生效果
盆栽条件下种植大蒜，分别接种2种生物肥料菌剂，结果显示，施加菌剂处理能够显著增加大蒜生物量，与对照(不加菌剂)相比，Y3微生物菌剂生物量达到7.09g/盆，平均增加2.18g/盆，提高44.4％；AS1.1216菌株的生物量达到6.14g/盆，生物量增加1.23g/盆，比对照提高25.1％。Y3表现出了显著的促生效果(表4)。
表4 Y3菌剂对盆栽大蒜生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著。
实施例6 Y3菌剂对盆栽向日葵的促生效果
1.Y3菌剂对盆栽非盐碱土向日葵的促生效果
在温室条件下进行了Y3菌剂的接种试验，土壤来自于内蒙乌拉特前旗农田土壤，连年种植向日葵，菌核病和锈病异常严重。盆栽条件下种植向日葵，分别接种3种生物肥料菌剂，菌剂由Y3、DSM 8785个DSM1732制备而成。试验结果显示，3种微生物菌剂都能够提高向日葵的生物量(表5)。Y3菌剂的生物量最高，生物量鲜重达到9.92g/盆，比对照提高117.54％；DSM 8785菌剂的低于Y3，鲜重达到6.47g/盆，比对照提高41.89％；DSM 1732菌剂生物量最低，比对照仅提高27.85％。表明Y3菌剂促进向日葵生长效果显著。
表5 盆栽条件下生物肥料对非盐碱土壤向日葵生物量的影响
注：a、b、c表示处理组之间差异显著，bc表示该处理组与b、c处理组间差异不显著。
2.Y3菌剂对盆栽轻度盐碱土向日葵的促生效果
在温室条件下进行了环状芽胞杆菌Y3菌剂的接种试验，试验土壤来自于内蒙乌拉特古前旗，轻度盐碱，连年种植向日葵，菌核病和锈病异常严重。盆栽条件下向日葵分别接种4种生物肥料菌剂，分别由Y3、DSM 40006、DSM 10690和AS1.1216菌株制备而成。结果显示，所有微生物菌剂都能够提高向日葵的生物量，Y3、DSM 40006、DSM 10690和AS1.1216菌剂的生物量鲜重分别为7.46g/盆、7.35g/盆、7.23g/盆和7.08g/盆，比对照的6.12g/盆分别提高21.9％、20.1％、18.14％和15.69％。Y3菌剂的向日葵生物量最高，增产效果最好，说明Y3菌剂促进向日葵生长效果显著。但是不难看出，Y3对向日葵的促生效果低于非盐碱土。(表6)
表6 盆栽条件下生物肥料对轻度盐碱土向日葵生物量的影响
注：a、b表示处理组之间差异显著。
实施例7 Y3菌剂对田间向日葵产量的影响
田间试验在内蒙古乌拉特前旗进行，作物为向日葵，品种为LDS009。微生物菌剂使用量为60kg/亩，氮磷钾复合肥(15-15-15)颗粒用量为40kg/亩。结果表明，整个生长期间向日葵没有任何病害发生，既没有菌核菌病，也没有柄锈菌病发生，而周围农田向日葵菌核菌、柄锈菌导致的病害严重。田间试验结果显示，环状芽胞杆菌Y3产量最高，亩产量259.3公斤，增产率21.7％；放线菌AS1.1216亩产247.6公斤，增产达到16.2％。ACCC 11079细菌菌剂的亩产量达到225.5公斤，增产5.9％；DSM 2573亩产220.4公斤，增产3.5％。表明Y3具有良好的增产潜力(表7)。
表7 环状芽胞杆菌Y3菌剂对向日葵产量的影响
注：a、b表示处理组之间差异显著。
实施例8 Y3菌剂不同用量对田间向日葵的增产作用
田间试验主要研究生物肥料与常用磷酸二铵的最佳配合效果，充分发挥生物肥料和化肥的最大作用。磷酸二铵设置三个水平，分别是30、40、50kg/亩；生物肥料设置4水平，分别是0、33.3、66.7、100kg/亩；所有处理重复3次。结果显示，不同化肥用量条件下，使用环状芽胞杆菌Y3菌剂的4个水平都能够提高向日葵的产量(表8)。三个化肥用量作用效果不同，以使用磷酸二铵40kg/亩条件下，生物肥料菌剂的增产效果最好，随着生物肥料用量增加而向日葵产量提高；接种Y3菌剂33.3、66.7、100kg/亩，比对照分别增产17.7％、48.3％、66.8％，显著高于使用磷酸二铵30kg/亩相应生物肥料菌剂处理的增产效果。为避免化学肥料浪费，以使用生物肥料菌剂66.7-100kg/亩、磷酸二铵40kg/亩为最佳组合。
表8 环状芽胞杆菌Y3生物肥料对田间向日葵产量的影响
注：a、b、c、d表示处理组之间差异显著。
实施例9 Y3菌株平板抑制尖镰孢菌的效果
为了验证Y3拮抗病原真菌的能力，在PDYA培养基上，将尖镰孢病原真菌(ACCC36241)接种在PDYA培养基平板中央，在病原菌周围均匀划分为4个点，分别接种1号、2号、3号、5号四个菌株，其中，1号、2号和5号为芽胞杆菌，3号的菌落为Y3。结果显示，接种Y3位点的病原菌受到抑制，证明Y3具有抑制丝状病原真菌生长的能力(图1)。
为了验证Y3拮抗病原真菌的能力，将尖镰孢病原真菌(ACCC36241)接种在PDYA培养基平板中央，在病原菌周围均匀划分为4个点，其中3个点接种Y16菌，另一点不接种Y3，作为对照。结果显示，接种Y3的3个点病原菌受到抑制，而不接种Y3的尖镰孢菌菌落生长较快。证明Y3具有抑制尖镰孢病原真菌生长的能力。(图1)
本发明对拮抗向日葵菌核病和锈病、防治大棚蔬菜连作障碍的高效拮抗菌Y3及其微生物菌剂进行了多方面研究，该菌剂能够防治向日葵菌核病和锈病、防治大棚蔬菜连作障碍，提高作物产量。开发的抗病增产的Y3微生物菌剂，展示巨大的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 环状芽胞杆菌Y3及其在防治作物土传病害中的应用
<130> KHP161119385.4Q
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 920
<212> DNA
<213> 环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)
<400> 1
gggcgttgcg gctgctaata catgcaagtc gagcggactt taaaagcttg cttttaaagt 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctgcctg taagactggg ataacttcgg 120
gaaaccggag ctaataccgg ataatccttt tcctctcatg aggaaaagct gaaagacggt 180
ttacgctgtc acttacagat gggcccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc 240
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga 360
cggagcaacg ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagggaa 420
gaacaagtac aagagtaact gcttgtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt cctttaagtc tgatgtgaaa gcccacggct caaccgtgga 600
gggtcattgg aaactggggg acttgagtgc agaagagaag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctt tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggccg caaggctgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagg 920