采样测序的制作方法
背景技术：
存在多种短期采样测序结果将具有巨大效用的不同应用。这些应用可包括例如快速的、接近护理点或实验室的对赋予抗生素抗性的突变的鉴定、病毒基因测序、出于法医学目的组织鉴定、针对器官移植的组织分型和与药物代谢速率相关的等位基因的鉴定。
举例来说，对于败血症中牵涉的细菌性病原体，了解细菌是否携带使其具超广谱头孢菌素抗性的超广谱β-内酰胺酶(esbl)是有用的。这些esbl由tem-1、tem-2、shv和其它β内酰胺酶基因中的突变产生。存在许多可赋予抗生素抗性表型的其它基因，其表达或活性受这些基因的编码或调控区中的点突变调节。虽然单个已知点突变容易使用标准pcr技术分析，但是具有多个等位基因的基因中的突变可能更加难以鉴定。
同样，存在许多以下情形，其中病毒基因序列可指示人类样品中存在该病毒和该病毒是否对抗病毒化合物具有抗性，并且因此指示应开始、继续或停止何种治疗。这对丙型肝炎、乙型肝炎和hiv情况即如此。虽然得出结果的时间对于这些慢性病毒感染来说不那么迫切，但是时间对于其它病毒感染(如流感)极其重要。对于流感和其它急性病毒感染，充分表征的赋予对fda批准的神经氨酸酶抑制剂的抗性的点突变的数目不断增加。理想地，用神经氨酸酶抑制剂治疗应在检测到病毒后尽快开始，但重要的是使用正确的抑制剂。
除了病原体检测和鉴定之外，还存在一些情形，其中快速测定一个或者多个人类基因的序列是重要的。这些情形包括出于法医学目的人类组织的鉴定，例如通过定位短串联重复序列(str)的长度。这一鉴定目前通过测定pcr扩增子的尺寸来进行，但是它也可以通过测序来进行。快速采样测序方法将有助于许多这类情况。
另一个实例是对用于移植的器官进行hla分型。有待捐献的器官可来自最近死亡的个体。重要的是将器官快速递送给与供体的mhc匹配最佳的移植受体。这样做的最准确的方式是对决定移植排斥的mhc基因进行测序并且接着将这些序列与受体mhc类型的国家登记库进行匹配。快速采样测序方法将有助于许多器官捐献情况。
又一个实例是鉴定决定药物代谢速率的细胞色素p450等位基因。众所周知，肝脏中的细胞色素p450酶代谢外来化合物进行排泄。这个家族中的多种蛋白质是已知的，每种蛋白质的不同等位基因存在于不同的群体和个体中。举例来说，有些人携带极快地代谢华法林(warfarin)的酶的等位基因，而有些人代谢华法林缓慢得多。了解患者的基因型容许医生决定给予多少华法林或其它此类药物以便在血流中达到某一药物水平。
其中测序可能有用的其它非限制性实例包括癌症基因，以及其它传染性病原体，如肺结核。许多其它实例是可能的，正如在临床诊断和其它领域都有使用的实例。
聚合酶链式反应(pcr)是一种广泛用于分子生物学的技术。它的名字来源于它的一个关键组分，即用于通过体外酶促复制扩增一段dna的dna聚合酶。随着pcr的进行，产生的dna(扩增子)本身被用作复制的模板。这引发了链式反应，其中dna模板呈指数扩增。通过pcr，有可能扩增一段dna的单个或几个拷贝跨越数个数量级，产生数百万或更多个拷贝的dna片段。pcr采用热稳定聚合酶，dntp(三磷酸脱氧核苷酸)和一对引物(寡核苷酸)。现有的pcr技术和其它扩增方法可以与下一代测序(ngs)组合以提供快速的采样测序结果。
传统的核酸测序技术采用特定碱基处的化学裂解(maxim-gilbert方法)或使用双脱氧核苷酸的链终止(sanger测序)。下一代测序涉及高通量测序技术，其中一些将测序过程并行化，同时生成数千至数百万个序列，通常在每一个核苷酸添加到每一个单独的链中时检测。目前可使用多种下一代系统。
技术实现要素：
在本公开的一个方面，对样品中的核酸进行扩增和测序的方法。说明性方法可包含以下步骤：将样品置于扩增腔室中，其中扩增腔室被构造用于扩增样品中可能存在的多个个体核酸，使扩增腔室经受扩增条件，将样品移至第二阶段扩增孔的阵列中，每一个第二阶段扩增孔被构造用于进一步扩增样品中可能存在的一个个体核酸，使得一部分核酸移至额外第二阶段扩增孔中的每一个中，在额外第二阶段扩增孔中进行第二阶段扩增，以在所述样品中存在该个体核酸时在每一个第二阶段扩增孔中产生扩增子，并且使至少多个孔经受测序条件。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括对样品中的核酸进行扩增和测序的方法，其中所述方法包括以下步骤：将样品置于第一阶段扩增腔室中，在此第一阶段扩增腔室被构造用于扩增样品中可能存在的多个个体核酸，使第一阶段扩增腔室经受扩增条件，将样品移至第二阶段扩增孔的阵列中，其中每一个第二阶段扩增孔被构造用于进一步扩增样品中可能存在的一个个体核酸，使得一部分样品移至每一个第二阶段扩增孔，在第二阶段扩增孔中进行第二阶段扩增，以在所述样品中存在个体核酸时在每一个第二阶段扩增孔中产生扩增子，并且使至少一个第二阶段扩增孔中的内含物经受测序条件。在一些情况下，额外的第二阶段扩增孔中的每一个具有栓系于其中的引物，并且可在第二阶段扩增孔中进行测序。在其它情况下，所有步骤都是在单个容器中进行，而最后两个步骤在孔中进行。在其它情况下，所述容器配备有一个或多个可密封端口，其中可密封端口提供从容器外部至第一阶段扩增腔室和第二阶段扩增孔阵列的唯一入口，使得当所述一个或多个可密封端口被密封时，容器是完全封闭的。在一些情况下，测序可在单独的样品容器中进行。在其它情况下，所有步骤都在约5小时或更短的时间内进行。在其它情况下，使所有第二阶段扩增孔经受测序条件。在其它情况下，所述方法可另外包含检测每一个第二阶段扩增孔中是否已产生所述扩增子以对在其中已经产生所述扩增子的每一个第二阶段扩增孔生成阳性认定的步骤。在一些情况下，仅对那些存在阳性认定的第二阶段扩增孔进行测序。在其它情形中，第一阶段扩增腔室包含多个第一阶段引物对，所述第一阶段引物对中的每一个被构造用于扩增样品中可能存在的多个个体核酸中的一个，并且其中所述第二阶段扩增孔中的每一个包含一个第二阶段引物对，所述一个第二阶段引物对被构造用于扩增样品中可能存在的多个个体核酸中的一个。在其它情形中，所述第二阶段引物对中的每一个的至少一个嵌套在其对应的第一阶段引物内。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括对样品中的核酸进行扩增和测序的方法，包含以下步骤：将所述样品置于扩增腔室中，其中所述扩增腔室被构造用于扩增所述样品中可能存在的多个个体核酸，使扩增腔室经受扩增条件，将样品移至点阵列，每一个点包含一组栓系于其中的第二阶段扩增引物，每一组第二阶段扩增引物被构造用于进一步扩增个体核酸中的一个，对阵列进行第二阶段扩增，以在所述样品中存在该个体核酸时在所述点中的每一个处产生扩增子，以及使至少一个点经受测序条件。在一些情况下，所有步骤都在单个容器中进行。在其它情形中，所述容器配置有一个或多个可密封端口，所述可密封端口提供从容器外部到所述扩增腔室和所述第二阶段扩增孔阵列的唯一入口，使得当所述一个或多个可密封端口被密封时，所述容器是完全封闭的。在其它情形中，所述阵列具有入口通道和出口通道，并且打开和关闭所述入口通道和出口通道控制流体在阵列中的流动。在一些情况下，在流体进入所述入口通道时关闭所述出口通道得到在所述阵列上的流体气泡，并且搅动气泡使所述流体均匀化。在其它情况下，所述方法另外包含检测是否已在每一个点产生所述扩增子以使在其中已经产生所述扩增子的每一个孔生成阳性认定的步骤。在其它情况下，点的数目总计不超过512个点。在一些情况下，点的数目总计不超过256个点。在其它情形中，所述组包含第二阶段引物对中的两个。在其它情形中，在具有3’至5’核酸外切酶活性的聚合酶存在下进行第二阶段扩增。在一些情况下，所述组包含第二阶段引物对中的一个。在其它情况下，在包含所述第二阶段引物对中的每一个中的另一个的溶液存在下进行第二阶段扩增。在其它情况下，在对扩增腔室进行扩增之后，用具有3’至5’核酸外切酶活性的聚合酶处理所述样品。在一些情况下，所有的第二阶段引物对中的另一个具有与通用引物对应的5’序列。在其它情形中，所述溶液还包含通用引物。在其它情形中，所有的所述第二阶段引物对中的另一个都是以不超过通用引物浓度的约1/10的浓度提供。在一些情况下，在使扩增腔室经受扩增条件与进行第二阶段扩增的步骤之间不稀释样品。在其它情况下，所述第二阶段引物对中的至少一个具有与通用引物对应的附加序列，并且通过使用通用引物合成进行测序。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括用于样品中可能存在的核酸的扩增和测序的方法，包括以下步骤：在多个外部引物对存在下和在每一个核酸的至少一个内部引物存在下扩增，每一个外部引物对被构造用于扩增所述核酸中的一个，以产生所述样品中存在的每一个核酸的扩增子，并且使扩增子经受测序条件。在其它实施方案中，所述多个外部引物对位于一个反应腔室中并且所述内部引物位于另外的反应腔室中。在其它实施方案中，所述多个外部引物对和所述内部引物位于单个反应腔室中。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括用于扩增样品中的核酸的方法，包括以下步骤：将所述样品置于第一阶段扩增腔室中，其中所述扩增腔室包含被构造用于扩增所述样品中可能存在的核酸的第一引物对，使所述扩增腔室经受扩增条件以产生扩增子，将所述样品的第一部分移至包含第一个多组第二阶段扩增引物的第一个第二阶段扩增区，每一组第二阶段扩增引物被构造成扩增扩增子的不同的非重叠区，将所述样品的第二部分移至包含第二个多组第二阶段扩增引物的第二个第二阶段扩增区，每一组第二阶段扩增引物被构造成扩增所述扩增子的不同的非重叠区，并且进行第二阶段扩增，在第一个第二阶段扩增区上以产生第一种第二阶段扩增子，并在第二个第二阶段扩增区上以产生第二种第二阶段扩增子，其中所述第一种第二阶段扩增子中的至少一些与所述第二种第二阶段扩增子中的至少一些重叠。在其它实施方案中，所述方法还包括使至少一个扩增子经受测序条件。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括对样品中的核酸进行扩增和测序的方法，包括以下步骤：将所述样品置于扩增腔室中，其中所述扩增腔室包含第一正向引物、嵌套在所述第一正向引物内的第二正向引物、和反向引物，其中所述第二正向引物被栓系于结构，并且使扩增腔室经受扩增条件。在其它实施方案中，所述方法还包括使所述扩增腔室经受测序条件。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括用于多个核酸的扩增和测序的容器，包含第一阶段扩增腔室，所述第一阶段扩增腔室包含多个第一阶段引物对，每一个第一阶段引物对被构造用于扩增多个核酸中的一个以产生第一阶段扩增子；和第二阶段扩增腔室，第二阶段扩增腔室包含多个第二阶段引物对，每一个第二阶段引物对被构造用于扩增一个第一阶段扩增子的至少一部分序列以产生第二阶段扩增子，其中所述第二阶段扩增腔室还被构造用于对所述第二阶段扩增子进行测序。在一些情况下，每一个第二阶段引物对的至少一个成员被嵌套在对应的第一阶段引物内。在其它情况下，每一个所述第二阶段引物对的至少一个成员被栓系于支撑物。在其它情况下，每一个所述第二阶段引物对的至少一个成员通过5’端栓系于所述支撑物。在一些情形中，所述第二阶段扩增子包含单分子种。在其它情形中，容器还包含一个或多个可密封端口，所述一个或多个可密封端口提供从所述容器外部至所述第一扩增腔室和所述第二阶段扩增腔室的唯一入口，使得当所述一个或多个可密封端口被密封时，所述容器是完全封闭的。在其它情形中，第二阶段扩增腔室包含入口通道和出口通道，并且打开和关闭所述入口通道和所述出口通道控制流体在第二阶段扩增腔室中的流动。在一些情况下，容器还包含溶解腔室，其被构造成接收样品并制备溶解样品。在其它情况下，容器还包含核酸提取腔室，其被构造成接收溶解样品并从溶解样品提取核酸。在一些情况下，第二阶段扩增腔室包含孔阵列，每一个孔被构造成进行第二阶段扩增反应。在其它情形中，所述第二阶段扩增腔室包含点阵列，每一个点包含第二阶段引物对，并且每一个点被构造成进行第二阶段扩增反应。在其它情形中，所述第二阶段引物中的至少一个被栓系于所述点。在一些情况下，点的数目总计不超过512个点。在其它情况下，点的数目总计不超过256个点。
在一些实施方案中，本文所述的系统和方法包括用于样品中可能存在的多个核酸的两步扩增和测序的方法，包括：扩增第一混合物中的所述核酸，所述第一混合物包含多个第一阶段引物对，每一个第一阶段引物对被构造用于扩增多个核酸中的一个以产生所述样品中存在的核酸中的每一个的第一阶段扩增子，使用多个第二阶段引物对扩增所述第一阶段扩增子，每一个第二阶段引物对被构造用于扩增第一阶段扩增子中的一个，其中每一个第二阶段引物对中的至少一个嵌套在其对应第一阶段引物对内，以产生所述样品中存在的核酸中的每一个的单分子种，并且对所产生的单分子种进行测序。在其它实施方案中，扩增和测序步骤是在单个反应腔室中进行。在其它实施方案中，每一第二阶段引物对中的至少一个被栓系于固体支撑物。在一些实施方案中，扩增和测序步骤是在不同反应容器中进行。在其它实施方案中，在扩增和测序步骤之间不使用过滤器鉴别正确的扩增子。
本发明实施方案的其它特征和优势将陈述在随后的描述中或可通过这类实施方案的实践而获知。这类实施方案的特征和优势可借助于随附权利要求书中特别指出的仪器和组合来实现并获得。这些特征和其它特征将从以下描述和随附权利要求书而变得更加清楚，或可通过如下文所陈述的这类实施方案的实践而获知。
附图说明
为了描述可获得本发明的上述优势和特征以及其它优势和特征的方式，将通过参考其在附图中说明的特定实施方案描绘上文简单描述的本发明的更具体描述。应了解这些图式仅描绘本发明的典型实施方案并且因此不应视为限制其范畴，本发明将经由使用附图描述和阐明附加特异性和详情，其中：
图1示出了用于本公开的一个实施方案的说明性小袋。
图2a-b说明用于在单个样品孔中扩增和测序的步骤。
图3是图1小袋的说明性第二阶段的部分分解图，所述阶段被构造用于在扩增之后进行测序。
图4与图1类似，但示出第二阶段阵列的一个不同实施方案。
图5a-5c与图2a-2b相似，所不同的是示出桥式扩增。
图6a-6e与图5a-5c类似，所不同的是示出与本文所述的装置一起使用的一个不同实施方案。
图7a-c示出了一个用于对由单个第一阶段扩增子产生的多个扩增产物进行测序的实施方案。图7a示出了重叠的第二阶段扩增子，而图7a-7b示出了一种将第二阶段扩增划分成第二阶段扩增反应的方式。
图8a-8c与图5a-5c类似，所不同的是示出一个替代性引物实施方案之外。
具体实施方式
在详细描述实例实施方式之前，应理解本公开不限于特别示例的系统、方法、设备、产品、过程、组合物和/或试剂盒的参数，这些参数当然可能会有所不同。还应理解的是，本文所用的术语仅用于描述本公开的具体实施方式的目的，并且不必意图以任何方式限制本公开和/或发明的范围。因此，尽管将参照具体构造详细描述本公开，但是所述描述仅是说明性的，且不应被视为对要求保护的本发明的范围的限制。例如，某些实施方式中可以包括比在附图中示出的和/或在书面说明中说明的那些组件更少或额外的组件。此外，在不脱离由权利要求书限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对所示出的构造进行各种修改。因此，尽管本文中描述和/或公开了本发明的各个方面、实施方案和/或实施方式，但也涵盖其它方面、实施方式和实施方案。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本公开的实践中可以使用与本文所述的那些类似或等效的许多方法和材料，但是本文仅描述了某些示例性材料和方法。
本公开的各个方面，包括设备、系统、方法等可以参考一个或多个示例性实施方式来说明。如本文所用，术语“示例性”和“说明性”意思是“用作实例、示例或说明”，并且不应必须被解释为比本文公开的其它实施方式优选或有利。此外，对本公开或发明的“实施方式”或“实施方案”的引用包括对其一个或多个实施方案的具体引用，反之亦然，并且旨在提供说明性实例而不限制本发明的范围，其受所附权利要求书所限而不受以下描述所限。
应注意的是，如在本说明书和所附权利要求书中所用，除非内容清楚地另有指明，否则单数形式“a”、“an”和“所述”包括复数个指代物。因此，例如，对“atile”的引用包括一个、两个或更多个微块。类似地，除非内容和/或上下文清楚地另有指明，否则对多个指示物的提及应被解释为包含单个指示物和/或多个指示物。因此，对“tiles”的引用不一定需要多个这样的微块。实际上，应理解与结合无关；本文中涵盖一个或多个微块。
如本申请通篇所用，词语“可以”和“可”以容许性意义(即，意味着有可能)而不是强制性意义(即，意味着必须)使用。另外，如本文(包括权利要求书)所用，术语“包括(including)”、“具有(having)”、“涉及(involving)”、“含有(containing)”、“由...表征(characterizedby)”、其变体(例如"包括(includes)"、"具有(has)"和"涉及(involves)"、"含有(contains)"等)以及类似术语应当是包括性的和/或开放式的，应当具有与词语“包含(comprising)”及其变体(例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)相同的含义，不排除另外的未说明性列举的元件或方法步骤。
如本文所用，如“顶部”、“底部”、“左”、“右”、“上”、“下”、“上部”、“下部”、“内部”、“外部”、“里面的”、“外面的”、“内部的”、“外部的”、“近侧的”、“远侧的”、“正向”、“反向”等的方向性和/或任意术语可以仅用于指示相对方向和/或取向，并且不允许旨在以其他方式限制本公开(包括说明书、发明和/或权利要求书)的范围。
还应理解的是，在不脱离本公开的范围的情况下可以将本文描述的各种实施方式与所描述或公开的任何其它实施方式组合使用。因此，在不脱离本公开的范围的情况下，根据本公开的某些实施方式的产品、部件、元件、装置、设备、系统、方法、过程、组合物和/或试剂盒可包括、并入或以其它方式包含在其它实施方式(包括系统、方法、装置和/或类似物)中描述的特性、特征、组件、部件、元件、步骤和/或类似物。因此，与一个实施方式相关的特定特征的引用不应被解释为限于仅在所述实施方式内的应用。
本文使用的标题仅用于组织目的，并不意味着用于限制说明书或权利要求书的范围。为了便于理解，在可能的情况下，相同的附图标记已用于指示图中相同的元件。另外，在可能的情况下，元件的相同标记已用于多个图中。此外，特定元件的替代构造可以各自包括附加到元件标记的不同字母。
术语“约”在本文中用于意指近似、接近、大致或大约。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过将边界扩展到所述数值以上和以下来修饰所述范围。一般，术语“约”在本文中用于以5％的差异将数值限定在所述值以上和以下。当表述这样的范围时，另一个实施方案包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当数值通过使用先行词“约”表示为近似值时，应理解所述特定值形成另一个实施方案。应进一步理解，每个范围的端点在与另一个端点相关和独立于另一个端点时均是有意义的。
如本文所用，词语“或”意指特定清单中的任何一个成员并且也包括所述清单的成员的任何组合。
“样品”意指动物；来自动物的组织或器官；细胞(在受试者内、直接从受试者取得、或在培养物中维持或来自培养的细胞系的细胞)；细胞溶解物(或溶解物级分)或细胞提取物；含有来源于细胞、细胞物质或病毒物质的一种或者多种分子(例如多肽或核酸)的溶液；病毒；含有来源于病毒的一种或多种分子的溶液；寄生虫；含有来源于寄生虫的一种或多种分子的溶液；细菌、含有来源于细菌的一种或多种分子的溶液；真菌；含有来源于真菌的一种或多种分子的溶液；植物；含有来源于植物的一种或多种分子的溶液；或含有核酸的溶液，其如本文所述进行分析。样品还可以是含有细胞、细胞成分或核酸的任何体液或分泌物(例如但不限于血液、尿液、粪便、唾液、眼泪、胆汁、脑脊髓液、粘液、脓液、汗液)。
如本文所用，短语“核酸”是指天然存在的或合成的寡核苷酸或多核苷酸，无论是dna或rna还是dna-rna杂交体、单链的还是双链的、有义的还是反义的，其能够通过沃森－克里克碱基配对(watson-crickbase-pairing)与互补的核酸杂交。本发明的核酸还可以包括核苷酸类似物(例如brdu)和非磷酸二酯核苷键(例如肽核酸(pna)或硫二酯键)或通过例如bennerup专利8,354,225,“含有非标准核酸碱基的寡核苷酸的扩增(amplificationofoligonucleotidescontainingnon-standardnucleobases)”和美国专利8,871,469“dna引发中自避免分子识别系统(self-avoidingmolecularrecognitionsystemsindnapriming)”所述的扩张的遗传密码表。具体来说，核酸可以包括(但不限于)dna、rna、cdna、gdna、ssdna、dsdna或其任何组合。
“探针”、“引物”或“寡核苷酸”意指可以与含有互补序列(“靶”)的第二核酸分子碱基配对的确定序列的单链核酸分子。所得杂交体的稳定性取决于长度、gc含量和发生碱基配对的程度。碱基配对的程度受如探针和靶分子之间的互补程度以及杂交条件的严格程度等参数影响。杂交的严格程度受如温度、盐浓度和有机分子(如甲酰胺)浓度等参数影响，并且通过本领域的技术人员已知的方法确定。探针、引物和寡核苷酸可以通过本领域的技术人员熟知的方法以放射性、荧光或非放射性方式被可检测地标记。可以使用dsdna结合染料来检测dsdna。应理解，“引物”被专门地构造成通过聚合酶延伸，而“探针”或“寡核苷酸”可以如此构造，也可以不如此构造。
“dsdna结合染料”意指与结合于单链dna或在溶液中游离时相比，当结合于双链dna时通常通过更强烈地发出荧光而有差别地发出荧光的染料。尽管提到了dsdna结合染料，但应理解，任何合适的染料都可以在本文中使用，其中一些非限制性说明染料描述于美国专利第7,387,887号中，其以引用的方式并入本文中。其它信号产生物质也可以用于检测核酸扩增和解链，例如本领域中已知的酶、抗体等。
“特异性杂交”是指探针、引物或寡核苷酸在高度严格条件下识别并与基本上互补的核酸(例如，样品核酸)以物理方式相互作用(即碱基配对)并且与其它核酸基本上不碱基配对。
“高度严格条件”是指被配置成允许鉴定靶核酸序列的条件。这类条件通常发生在约tm减5℃(比探针的tm低5°)。功能上，使用高度严格条件来鉴定具有至少80％序列同一性的核酸序列。
尽管pcr是本文实例中使用的扩增方法，但是应理解使用引物的任何扩增方法都可能是合适的。这类合适的程序包括聚合酶链式反应(pcr)；链置换扩增(sda)；基于核酸序列的扩增(nasba)；级联滚环扩增(crca)；环介导的dna恒温扩增(lamp)；等温和嵌合引物起始的核酸扩增(ican)；基于靶的解旋酶依赖性扩增(hda)；转录介导的扩增(tma)等。因此，当使用术语pcr时，应理解为包括其它替代性扩增方法。对于没有离散循环的扩增方法，可以使用以循环数或cp计的反应时间，在其间进行测量，并且在本文所述的实施方案中可以增加另外的反应时间，其中添加另外的pcr循环。应理解，方案可能需要相应地进行调整。
在一些实施方案中，pcr包括任何合适的pcr方法。例如，pcr可以包括多重pcr，其中使用聚合酶链式反应来同时扩增几种不同的核酸序列。多重pcr可以使用多个引物组，并可以同时扩增数个不同的核酸序列。在一些情况下，多重pcr可以在单个pcr反应中使用多个引物组以产生特异性针对不同核酸靶序列的具有不同核酸序列的扩增子。多重pcr可以具有用单个pcr反应而不是多个单独的pcr反应产生具有不同核酸靶序列的扩增子的有益的特征。
如本文所用，“测序”是指鉴定核酸的序列，包括鉴定核酸的一条或两条链的序列，以确定各个碱基的连续顺序。“下一代测序”是在多个同时并行的反应上进行的测序。
本文使用以下寡核苷酸的命名法：
u＝通用引物-在特定反应中由所有引物共有的共同序列
s＝特异性引物-给定的目标分析所独有的
下标：
o＝外部-在第一阶段扩增中用以产生外部扩增子的引物
i＝内部-在第二阶段扩增反应中使用的嵌套引物。这一引物可以与用于产生外部扩增子的外部引物部分重叠，但部分或完全位于外部扩增子内部
ii＝内部-内部-嵌套在嵌套内部引物内部的引物。这一引物可以部分重叠此内部引物或完全位于该内部引物内部
f＝正向和r＝反向-是定义pcr扩增子的两个引物。应了解，方向是任意的
x＝某一特异性寡核苷酸的多重指数(1≤x≤n)。
例如：ursir4是第4号扩增子的特异性内部反向引物上的5'端的通用反向引物。
尽管本文的各种实例参考人类靶标和人类病原体，但这些实例仅是说明性的。本文所述的方法、试剂盒和装置可用于对来自多种样品的多种核酸序列进行检测和测序，所述样品包括(但不限于)人类样品、动物样品、兽医学样品、植物样品、藻类样品、食物样品、工业样品、病毒样品、真菌样品、细菌样品、寄生虫样品和环境样品。本文所述的方法、试剂盒和装置可用于对来自多种应用的多种核酸序列进行检测和测序，所述应用包括(但不限于)检测抗生素抗性、检测病毒基因、法医学、组织分型、器官移植、药物代谢、生物恐怖主义、食品安全、环境安全、农业和生态。
本文所公开的各种实施方案说明性地在单个封闭系统中使用自含式核酸分析小袋而对样品中各种生物物质(示例性地抗原和核酸序列)的存在和/或鉴定进行)测试。这类系统，包括小袋和与小袋一起使用的仪器，更详细地公开在美国专利第8,394,608号和第8,895,295号、和美国专利申请第2014-0283945号中，它们以引用的方式并入本文中。然而，应理解，这类小袋仅仅是示例性的，并且本文讨论的pcr反应可以使用如本领域中已知的各种扩增系统在本领域中已知的多种开放或封闭系统样品容器的任一种中进行，所述开放或封闭系统样品容器包括96孔板、具有其它构造的板、阵列、传送带等。尽管在本文中使用术语“样品孔”、“扩增孔”、“扩增容器”等，但是这些术语意在涵盖如这些扩增系统中所用的孔、管、dna芯片和各种其它反应容器。在一个实施方案中，所述小袋用于分析多个靶核酸。所述小袋可以包括一个或多个例如在封闭系统中用作样品孔的泡状结构(blister)。例如，可以在任选一次性的小袋中进行各种步骤，包括核酸制备、初级大容量多重pcr、初级扩增产物的稀释和二级pcr，以任选的实时检测或扩增后分析(如解链曲线分析和核酸测序)而告终。此外，应理解，尽管可以在本发明的小袋中执行各种步骤，但是对于某些用途来说，可以省略一个或多个步骤，并且可以相应地改变小袋构造。
图1示出了可以在各种实施方案中使用或可以重新构造用于各种实施方案的说明性小袋510。小袋510与美国专利第8,895,295号的图15类似，其中相同的项标号相同。配件590具有入口通道515a至515l，其也充当试剂储器或废物储器。例如，试剂可以在配件590中冷冻干燥，并在使用前水合。具有相应通道538、543、552、553、562和565的泡状结构522、544、546、548、564和566类似于美国专利第8,895,295号的图15的具有相同数目附图标记的泡状结构。图1的第二阶段反应区580与美国专利申请第8,895,295号的类似，但是高密度阵列581的第二阶段孔582排列成稍微不同的图案。图1的高密度阵列581的更圆的图案消除了边角处的孔并且可能导致更均匀地填充第二阶段孔582。如所示，高密度阵列581具有102个第二阶段孔582。小袋510适于在filmarray仪器(biofirediagnostics，盐湖城，犹他州)中使用。然而，应理解，小袋实施方案仅仅是说明性的。
小袋510可以与美国专利第8,895,295号中所述类似的方式使用。在一个说明性实施方案中，将包含待测试样品(100μl)和溶解缓冲液(200μl)的300μl混合物注入到配件590中入口通道515a附近的配件590的注射口(未示出)中，并将样品混合物吸入入口通道515a中。水也被注入到配件590与入口通道5151相邻的第二注射口(未示出)中，并且经由配件590中提供的通道(未示出)分配，由此水合多达11种不同的试剂，每种试剂在入口通道515b至515l处以干燥形式预先提供。这些试剂例如可以包括冷冻干燥的pcr试剂、dna提取试剂、洗涤溶液、免疫分析试剂或其它化学实体。举例来说，所述试剂用于核酸提取、第一阶段多重pcr、多重反应系的稀释和第二阶段pcr试剂的制备以及对照反应。在图1所示的实施方案中，所有需要注射的是在一个注射口中的样品溶液和在另一个注射口中的水。注射后，可以密封两个注射口。关于小袋510和配件590的各种构造的更多信息，参见已经以引用的方式并入本文中的美国专利第8,895,295号。
在注射后，样品从注射通道515a经由通道514移动到溶解状结构522。溶解泡状结构522装备有陶瓷珠粒534，并且被构造为使用filmarray仪器内提供的旋转叶片或桨叶通过冲击产生涡旋。一旦细胞已被充分溶解，样品通过通道538、泡状结构544和通道543移动到泡状结构546，在此样品与核酸结合磁珠例如二氧化硅包被的磁珠533混合。使混合物培育适当长的时间，例如约10秒至10分钟。位于filmarray仪器内邻近泡状结构546的可伸缩磁体从溶液捕获磁珠，形成抵靠在泡状结构546的内表面上的丸粒。然后液体从泡状结构546中移出并通过泡状结构544返回到现在用作废物贮器的泡状结构522中。来自一个或多个注射通道515c至515e的一种或多种洗涤缓冲液通过泡状结构544和通道543提供至泡状结构546。任选地，磁体被缩回，并且通过经由通道543在泡状结构544和546来回移动珠粒来洗涤磁珠。一旦磁珠被洗涤，磁珠通过磁体的激活被重新捕获在泡状结构546中，并且接着将洗涤溶液移动到泡状结构522。根据需要可以重复这一过程以便从核酸结合磁珠洗去溶解缓冲液和样品碎屑。
洗涤后，将储存在注射通道515f处的洗脱缓冲液移至泡状结构548，并且缩回磁体。溶液经由通道552在泡状结构546和548之间循环，使泡状结构546中的磁珠丸粒分散开，并使捕获的核酸从珠粒解离并释放到溶液中。再次激活磁体，捕获泡状结构546中的磁珠，并将洗脱的核酸溶液移入泡状结构548中。
使来自注射通道515g的第一阶段pcr主混合物与泡状结构548中的核酸样品混合。任选地，通过迫使混合物经由通道553在548和564之间来混合混合物。混合数个循环后，溶液被包含在泡状结构564中，在此提供有多组第一阶段pcr引物的丸粒，至少一组针对每一靶核酸序列的引物，并进行第一阶段多重pcr。如果存在rna靶标，那么可以在第一阶段多重pcr之前或与之同时进行rt(逆转录)步骤。在filmarray仪器中的第一阶段多重pcr温度循环例如进行了15-30个循环，但是根据特定应用的要求，其它水平的扩增也是合乎需要的。第一阶段pcr主混合物可以是本领域中已知的各种主混合物中的任何一种。在一个说明性实例中，第一阶段pcr主混合物可以是已经以引用的方式并入本文中的us14/403,369和wo2013/177429中公开的化学物质中的任一种，用于每个循环花20秒或更少的pcr方案。
在第一阶段pcr已经进行了期望数目的循环之后，可以例如通过迫使大部分样品回到泡状结构548中，仅在泡状结构564中保留少量，并且添加来自注射通道515i的第二阶段pcr主混合物来稀释样品。或者，可以将来自515i的稀释缓冲液移动到泡状结构566，然后通过使流体在泡状结构564和566之间来回移动而与泡状结构564中的扩增样品混合。如果需要，可以使用来自注射通道515j和515k的稀释缓冲液重复稀释数次，或者注射通道515k可被保留用于测序，如下所述，然后将第二阶段pcr主混合物从注射通道515h添加到一些或全部稀释的扩增样品中。应理解，可以在与稀释缓冲液或包含用于扩增的组分(例如聚合酶、dntp和合适的缓冲液，但是其它组分也可能是合适的，特别是对于非pcr扩增方法)的第二阶段pcr主混合物混合之前，通过改变稀释步骤的次数或通过改变弃去的样品的百分比来调节稀释水平。如果需要，样品和第二阶段pcr主混合物的这一混合物可以在移动到用于第二阶段扩增的第二阶段孔582之前在泡状结构564中预热。这样的预热可以避免第二阶段pcr混合物中对热启动组分(抗体、化学物质或其它)的需要。
示例性的第二阶段pcr主混合物是不完整的，缺乏引物对，并且102个第二阶段孔582中的每一个分别预先装有特异性pcr引物对。如果需要，第二阶段pcr主混合物可以缺少其它反应组分，并且这些组分也可以预装在第二阶段孔582中。每个引物对可以与第一阶段pcr引物对相似或相同，或者可以嵌套在第一阶段引物对内。应理解，嵌套引物是在第一阶段引物杂交位置的内部的位置与第一阶段扩增子杂交的引物。嵌套引物可能与第一阶段引物部分重叠，但3'端位于第一阶段引物3'端内部。将样品从泡状结构564移动到第二阶段孔582完成pcr反应物混合。一旦填充了高密度阵列581，如本领域中已知，各个第二阶段反应通过任何数目的方式被密封在它们各自的第二阶段泡状结构中。填充和密封高密度阵列581而没有交叉污染的说明性方式在美国专利第8,895,295号中加以讨论，其以引入的方式并入。例如，高密度阵列581的孔582中的各反应系同时进行热循环以进行第二阶段pcr反应，例如使用一个或多个珀尔帖(peltier)装置，但本领域中已知用于热循环的其它手段。
在某些实施方案中，第二阶段pcr主混合物含有dsdna结合染料
说明性filmarray仪器可以被编程为基于pcr后解链对每个第二阶段反应进行阳性或阴性认定。阳性认定可以指示相应的孔582的成功的第二阶段pcr反应。阳性认定也可以表明在第二阶段pcr反应中产生的扩增子的质量足以允许测序。阳性认定还可以表明第二阶段pcr反应已经产生了基本上同质的分子种的扩增子。阴性认定可以指示相应的孔582的不成功的第二阶段pcr反应。阴性认定也可以表明在第二阶段pcr反应中产生的扩增子的质量不足以允许测序。阴性认定还可以表明第二阶段pcr反应并未产生基本上同质的分子种的扩增子。在一个实施方案中，解链曲线必须在预定义的温度范围内产生解链峰(例如，一阶导数最大值或负的一阶导数最大值)，以使认定为阳性。应理解，这种认定每个第二阶段反应的方法仅仅是说明性的，并且可以使用实时扩增数据或通过本领域中已知的其它方式进行认定，或者可以推迟认定，直到进行随后的测序。
例如，如果仪器被构造为进行阳性或阴性认定，那么可以对仪器进行编程以仅标记产生阳性结果的那些孔，用于随后的测序。在一些实施方案中，在阳性认定和标记用于测序的孔之间可能存在一一对应的一致性。在其它实施方案中，标记用于测序的孔可能与产生阳性认定的孔不存在一一对应的一致性。例如，filmarray小袋510的第二阶段580可以用一式多份的孔点样，例如一式两份或一式三份的孔。如果那些孔中的一个或多个呈现阳性，那么可能需要对所有份数的该靶序列进行标记以用于测序。在其它实施方案中，每一份可能仅需要标记一个孔用于测序。在其它实施方案中，用作对照的孔可以被或可以不被标记用于随后的测序。在其它实施方案中，可以在有或没有阳性或阴性扩增认定的情况下对所有的孔进行测序。
虽然filmarray可用于基于来自粗生物样品的pcr提供阳性或阴性结果，但从粗生物样品到对特定rna和dna靶进行测序的方法也应是有用的。在一个说明性实施方案中，所述程序可以是自动的，可以耗时少于8小时，更具体说少于5小时，再具体说耗时3小时或更少，并且可以提供序列的25个或更多个碱基，例如对于多个扩增子，例如多达1000个扩增子，提供序列的多达200个碱基。例如，粗采样测序过程将在封闭的系统中发生，以使扩增子污染的可能性降到最低。
filmarray小袋510的第二阶段580用于产生所需靶标的扩增子。由于该两步pcr，在每个第二阶段孔582中产生基本上同质的扩增子。相应孔582中的每批扩增子可以通过本领域中已知的测序方法独立地测序。例如，每批扩增子可以通过本领域中已知用于下一代测序(ngs)的几种技术中的任何一种测序，所述ngs如iontorrent(lifetechnologies)、454(roche)、solid(abi)、hiseq或miseq(illumina)和pacificbiosciences。
在许多成功的filmarray小袋运行中，第二阶段阵列581中的孔582中的阳性信号表示基本上纯的单种扩增子。该单种扩增子不一定是一个分子克隆。例如，数字pcr、乳液pcr或分子克隆到质粒中都是产生原始核酸分子的在空间上分离的分子克隆的方法。相比之下，第二阶段扩增子来源于许多相同或密切相关的模板分子。然而，由于第一阶段的富集和稀释，第二阶段pcr的最终结果主要是单种扩增子，在本文中被称为“单分子种”。应理解，如本文所用，单分子种不一定是一个分子克隆，而将是能够实现测序的足够主要的一个种。
在一些实施方案中，在第二阶段pcr中产生的扩增子的解链曲线表明这些扩增子基本上是同质的。解链曲线分析是使用非特异性双链dna结合染料
在一些实施方案中，靶核酸序列以极低的拷贝数存在于样品中。靶核酸可以占整个样品的极小部分和/或可以存在其它核酸。例如，在基于pcr的病原体检测应用中，所关注的病原体可以极低的拷贝数存在于样品中，并且样品可能被大量过量的其它核酸、例如人类核酸(例如血液)或其它微生物基因组(例如粪便)污染，并可能产生复杂的核酸混合物。在常规的单阶段pcr检测系统中，除了所需的特异性扩增子之外，这一复杂的核酸混合物的单阶段pcr扩增常常产生多种非特异性产物。因此，除了基本的单阶段pcr之外，常规的单阶段pcr检测系统通常还需要第二检测机制或“过滤”以分离正确的扩增子和/或确认正确的扩增子的鉴定结果。这一过滤可以包括用于鉴定靶扩增子的尺寸排阻步骤(例如，琼脂糖或丙烯酰胺凝胶)、基于探针的检测方法(例如，使用水解探针或两种杂交探针)或使用捕获到表面(genmark诊断公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)或珠粒(luminex公司，奥斯汀，德克萨斯州)的序列的序列捕获方法。
在一些实施方案中，因为两步pcr产生基本上同质的扩增子，所以可以省略第二检测机制或“过滤”，并且可以直接对第二阶段pcr中产生的扩增子进行测序。因此，通过第二阶段pcr产生的扩增子可以通过本领域中已知的任何方法直接测序。
例如，应该可以通过将扩增子的一部分栓系到孔中来对群体进行测序，例如通过将第二阶段引物或扩增子共价连接到孔的底部，然后使用可能基于iontorrent、454、illumina或abi(solid)的ngs技术的下一代测序技术或如本领域中已知的其它测序方法。与其它系统不同的是，此后续的测序可以在一个或多个第二阶段孔内自动完成。
实例1
在这一实例中，在测序之前，将扩增子的一条链栓系到孔的底部(图2a)。在一个说明性实例中，提供拴系扩增子的一种方式将是以两种形式合成寡核苷酸之一(例如正向引物)，一种具有正常5'oh，另一种具有在5'端提供的化学部分以使其交联到孔表面的5'延伸。存在多种本领域中已知的化学物质用于这一目的。这将提供一些拴系到反应孔的正向引物和一些游离在溶液中的正向引物。应理解，提供游离在溶液中的正向引物以改善扩增反应的动力学。加载第二阶段阵列581的一种说明性方式将是对该阵列点样两次，例如使用如以引用的方式并入本文中的wo2013/158740和us14/395,002中描述的装置。例如，第一次点样阵列581，将经化学修饰的引物24添加到阵列581的每个孔582中。然后将经化学修饰的引物24交联到孔582，随后可以淬灭偶联反应以防止分子进一步交联到阵列。可以干燥阵列581，然后再用反向引物32和任选的其它pcr组分进行点样。任选地，未经修饰的正向引物26可被点样以使得引物浓度升高，从而改进pcr扩增的动力学。然而，这种用于阵列581点样的方法仅仅是示例性的，并且应理解，经化学修饰的引物24(如图2a所示)、未经修饰的正向引物26和反向引物32可以同时或以任何次序点样。在其它实施方案中，经化学修饰的引物24可以与反向引物32一起或在其点样之前点样，并且可以省略未经修饰的正向引物26。例如，反向引物32可以具有5'延伸序列20，其对于阵列581中的所有反向引物来说是相同的。提供此“通用引物”以稍后在测序反应期间使用。在提供游离在溶液中的一些正向引物的说明性实施方案中，大部分pcr反应将在溶液中发生，但是一部分扩增子28将为被拴系到阵列581中的孔582的拴系扩增子29的形式(参见图2a)。
本文中的许多实例描述了将一个或多个引物拴系到阵列上的样品孔或点。然而，应理解，当讨论拴系时，这可以包括拴系到可以移动到测序位置的任何固体表面，包括珠粒。
实例2
在此实例中，描述了作为测序芯片的第二阶段pcr阵列580的几何结构的说明性实例。图3示出了说明性阵列581的部分分解截面视图。在这一说明性实施方案中，硅层589在阵列581的底部上构建，例如替换第二层587(未示出)，如美国专利第8,895,295号中所讨论，并且在每个孔582中形成底表面。
如上所述，填充和密封高密度阵列581而没有交叉污染的说明性方式在美国专利第8,895,295号中加以讨论，其以引入的方式并入。在图3所示的一个说明性实施方案中，提供穿孔层585，其类似于美国专利第8,895,295号的穿孔层585。穿孔层585允许流体在力的存在下进入每个孔582，但是穿孔足够小以基本上防止流体在不存在力的情况下通过。然而，应理解，在复水期间用于保持引物在适当位置的化学机制可能与本实施方案中的穿孔层一样或更加理想，以在后续的测序步骤中提供较少的干扰。在采用化学机制的一个实施方案中，在点样之前，可以将“溶液相”正向引物26和反向引物32与熔融的低熔点琼脂糖(例如ultrapuretm低熔点琼脂糖(lifetechnologies))的溶液组合，以使其在首次大量涌入之时不会洗掉阵列，尽管用于化学机制的其它材料在本领域中是已知的，但是其中一些在美国专利第8,895,295号中有讨论。在大量涌入第二阶段阵列581之后，阵列581中的孔582通过如下方式进行密封：使仪器中的气囊充气(美国专利第8,895,295号中所讨论)，并推动膜518，膜518与如美国专利第8,895,295号中所述的层518相同或相似。在使用低熔点琼脂糖的实施方案中，一旦孔582被密封，加热阵列将正向引物26和反向引物22释放到溶液中。阵列581可以主要由硅制成，或者可以装备有硅层589，其余的材料类似于如美国专利第8,895,295号中所讨论的阵列581，或者可以由其它材料制成并且被构造为使得流过阵列581的液体能够进入孔582并引入新的化学物质或洗去先前的化学物质。可能需要提供具有约50μm至约500μm深度的阵列581，但其它尺寸仍可能是适当的，这取决于测序方法和构造。
参照图1，第二阶段反应区580装备有两个端口，即通道565和通道567，其中每一个都可以通过压力或其它手段进行密封。提供通道565用于接收来自泡状结构566的流体，泡状结构566显示为连接到多个入口通道。注射通道515k可以含有用于测序的材料，或可以具有阀门或可密封端口，从而允许连接到测序所需材料的外部源。类似地，注射通道515l可以接收测序废料，或可以装备有用于连接到单独废物贮器的阀门或可密封端口。因此，在这一说明性实施方案中，液体从注射通道515k，通过通道565，穿过阵列581的所有孔582和出口通道567，流到废物储器515l。应理解，随着流体移动到第二阶段扩增区580中，出口通道可以保持密封。这将在阵列581上形成流体泡，并且搅动可以在阵列上方产生均匀的流体。同步打开和关闭通道565和567可以控制流体在阵列581中的流动。
在扩增第一阶段扩增子21(图2a(i)和(ii))之后，例如可以通过以下步骤进行测序：
1)使拴系扩增子29变性，例如通过加热，并从阵列洗掉未结合的链30(图2a(ii)和图2a(iii))。应理解，这也将洗掉所有未结合的扩增子28。
2)将测序引物32退火至通用尾部20并提供dna聚合酶34以形成起始复合物。洗掉未结合的测序引物和未结合的dna聚合酶(图2b(iv)和(v))
3)测序。当dna聚合酶沿着结合链29移动并扩增结合链29的序列时，可以通过合成来进行测序。分别提供核苷酸a、t、c和g中的每一个，并测量各dntp的掺入，从而揭示结合链29的核苷酸序列。可以通过本领域中已知的方法(例如，质子生成(如iontorrent)、荧光或化学发光(如roche454)或任何适于测序方法的其它信号)来测量各dntp的掺入。洗涤阵列581，重复这个过程直到产生序列(图2b(vi)和(vii))。
在一个替代性实施方案中，可以根据实时曲线和/或解链在小袋510中进行pcr，然后密封每个孔582并且将小袋510的第二阶段扩增区580移到第二仪器进行测序。如上所述，拴系正向引物可以是防止孔间污染的一种方式，但是其它方式也是可能的，例如通过密封孔582来实现。因此，拴系可以是任选的，取决于所用测序方法。
应理解，在这类系统中可以使用其它测序方法。一种这类说明性方法将不需要将扩增子连接到孔，而是使用单分子测序方法(牛津纳米孔(oxfordnanopore)，参见wolnaah等人,固定在α-溶血素离子通道中的单分子dna碱基修饰的电流特征(electricalcurrentsignaturesofdnabasemodificationsinsinglemoleculesimmobilizedintheα-hemolysinionchannel).《以色列化学杂志(isrjchem.)》2013年6月1日；53(6-7):417-430.pubmedpmid:24052667；pubmedcentralpmcid:pmc3773884)。在这类替代性实施方案中，阵列孔582可以连接到具有单个通道的腔室或与其整合在一起，并且随着扩增子通过通道易位，一次一个碱基地读取孔582中的第二阶段扩增子数。与腔室的这种连接可以构建到小袋510中，或者可以在第二阶段pcr运行完成之后进行(只要扩增子保持分离到它们各自的孔中)。例如，在扩增之后，阵列581的一侧被密封到具有安置在每个孔上的单个蛋白质纳米孔通道的膜上。在通道的另一侧是附加流体，以使得电流可以施加在孔582与附加流体之间并且贯穿蛋白质纳米孔通道。然后可以在扩增子按照牛津纳米孔或类似的方法迁移通过蛋白质纳米孔通道时，对扩增子进行测序。例如，牛津纳米孔使用蛋白质α-溶血素作为蛋白质纳米孔通道。蛋白质纳米孔被置于脂质双层中，并具有足够大小的开口以使单链dna分子易位穿过开口。当单链dna分子穿过纳米孔时，原本流动通过纳米孔的质子和其它离子被阻挡，因此改变了流经纳米孔的电流。在牛津纳米孔系统中，单链dna分子的各碱基的身份(a、t、g或c)可以通过电流的这种改变而被分别辨别。因此，通过测量由对应于各碱基对的电流改变引起的电势变化，可以确定单链dna分子内各核苷酸的序列。(参见maglia,giovanni等人,“使用蛋白质纳米孔的单核酸分子的分析(analysisofsinglenucleicacidmoleculeswithproteinnanopores)”《酶学方法(methodsinenzymology)》475(2010):591-623和clarke,james等人,“单分子纳米孔dna测序的连续碱基识别(continuousbaseidentificationforsingle-moleculenanoporednasequencing)”,《自然纳米技术(naturenanotechnology)》4.4(2009):265-270。)然而，应理解，牛津纳米孔系统是说明性的并且涵盖其它测序构造。在另一个版本中，与由加利福尼亚州门洛帕克的太平洋生物科学公司(pacificbiosciencesofmenlopark,california)开发的方法类似，测序孔包含在底表面上的产生小的光检测体积的零模式波导。每个零模式波导由激发光束从下面照射，并且零模式波导防止光的波长有效地穿过波导，由此允许来自激发光束的衰减光穿透每个零模式波导的下20-30nm。然后将扩增子和dna聚合酶复合物的复合物拴系到零模式波导的底部。然后将二氧磷基连接的核苷酸添加到孔中。四种核苷酸中的每一种可以用不同颜色的荧光团标记。当dna聚合酶复合物扩增扩增子时，各二氧磷基连接的核苷酸被掺入到新生链中，每个单独的二氧磷基连接的核苷酸的荧光颜色可以按顺序检测以确定扩增子的核苷酸序列。由于每个原始孔都有多个聚合酶，所以为了得到最好的结果，每个聚合酶所控制的每条链中核苷酸的掺入应该是同步的。
在用于证明由两步嵌套多重pcr产生的单分子种的一个说明性实例中，已对来自filmarray运行的第二阶段扩增子进行测序。作为filmarraybcidpanel(biofirediagnostics)中假阳性测试结果的研究的一部分，使用商业filmarraybcidpanel和实验软件测试了包括光滑念珠菌(candidaglabrata)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseriameningitidis)、大肠杆菌(escherichiacoli)和轻型链球菌(streptococcusmitis)的生物体混合物。在克鲁斯念珠菌(candidakrusei)第二阶段孔中检测到具有非常迟的cp(指示不良扩增)的微弱假阳性结果。
通过用胰岛素注射器刺穿第二阶段阵列上的每个孔并抽出包含扩增子的溶液而从小袋中提取来自这些阳性第二阶段孔中的每一个的扩增子。然后使用与bcidpanel第二阶段中所用相同的克鲁斯念珠菌内部引物在cfx仪器(bio-rad)中再扩增扩增子20个循环。然后在abi仪器上通过sanger测序对这个进一步扩增的材料进行测序。使用phred质量得分大于20(对于51个核苷酸(正向引物)和75个核苷酸(反向引物))的正向和反向引物均可获得可读序列。表1显示了使用针对genbank数据库(美国国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation))的连续序列(由正向和反向序列的重叠区制备的)的blast算法进行序列比较的结果。
表1
这些数据显示，bcidpanel第二阶段的克鲁斯念珠菌分析特异性扩增轻型链球菌基因组的区域。这表明，可以从bcidpanel中的两步嵌套多重pcr获得良好的序列数据，即使当产生序列的pcr具有非常迟的cp，表明扩增子不是丰富的。
实例3
在此实例中，描述了两步pcr系统中的核苷酸测序的说明性实施方案。现在参照图4，图4与图1相似，其中相同的附图标记指示相似的组件。在这个实施方案中，具有孔582的阵列580被具有点682(通常称为特征)的微阵列680替代。点682是至少一个寡核苷酸沉积在其上的阵列区域。尽管在本文中示例性地使用了每个点682点样有一组同质的寡核苷酸，但是应理解，每个点682可以具有引物对的两个成员，或可以具有点样在其上的一组嵌套寡核苷酸，并且其它构造也是可能的。因此，应理解，每个点682具有点样在其上的一组寡核苷酸，其中每组是一个或多个寡核苷酸种，并且所述组特异性针对靶标。
在一个说明性实施方案中，一个寡核苷酸种被点样在每个点682中，用于延伸扩增子的一端，并且多个点682各自具有点样在其上的不同寡核苷酸种。应理解，阵列680的每个点682可以具有不同的种，或可以存在一式多份(例如一式两份或一式三份)的点，或其任何组合。
在下面将更详细讨论的另一个说明性实施方案中，引物对的两个成员被点样在阵列上的同一点682，允许在所述点进行桥式pcr，使得整个点682被一端或另一端锚定的扩增子覆盖。使用桥式pcr的现有技术的下一代测序仪将引物随机地沉积在整个流动池中，允许已经沉积在阵列上的文库的任何单个成员的扩增。通过在单个点682中点样引物对的两个成员，只要存在靶序列就能从所述点682获得序列。因此，从所述点获得序列不仅提供序列，而且还可以提供所述靶标的阳性认定。
举例来说，阵列680的基质材料可以是玻璃。许多微阵列是在玻璃表面上制成的，例如因为：(1)在高负载密度下将寡核苷酸偶联到玻璃上的化学原理是深刻理解的；(2)平坦和无法拉伸意味着阵列打印机可以放置非常接近彼此的小点；以及(3)玻璃具有相对较低的自发荧光，使得阵列上的荧光染料的信噪比更易于检测。将玻璃阵列整合到小袋610中可能需要在阵列680周围或小袋610周围放置硬框架，以减少玻璃阵列680的破损。
然而，应理解，其它材料可以用于阵列680。本领域中已知用于将寡核苷酸附着到塑料的方法。在一些实施方案中，塑料阵列可以具有以下中的一个或多个：(1)塑料易于键合到其它塑料部件并且可以更容易地整合到小袋610中，(2)可以使用柔性塑料，使得如果小袋610受到压迫，阵列681不易破裂。塑料微阵列可以在小袋610中正常工作，因为(a)可以制造相对较大的点，因此信号将相对较大并且点样的准确性不至关重要(1平方厘米的阵列面积上有256个点＝0.39mm2的方形点)。按照微阵列标准，这个尺寸的点相当大。相比之下，商业filmarray孔是1.98mm2面积的圆(孔直径为1.59mm)。较大的点将产生较大的信号，这意味着用于荧光核苷酸掺入成像的相机将需要较少的感应元件，或用于感应ph变化的硅芯片将需要较少的晶体管，这将使这两种装置的制造成本更低，和(b)已知塑料具有低自发荧光，并且仍然能够以相对高密度结合寡核苷酸。应理解，涵盖512个点或更少、或256个点或更少、或任意数目的点的阵列。
应理解，本文所述的说明性阵列可以具有以5'端拴系到孔682的寡核苷酸。从这个意义上说，它们不同于本领域中已知的许多其它阵列，例如affymetrix阵列，其具有通过3'端附着到基质(例如，孔)的寡核苷酸。因此，affymetrix阵列只能用于杂交，而不能像在说明性阵列中那样作为扩增反应中的引物用于延伸。
具有3'至5'核酸外切酶活性的dna聚合酶(例如t4dna聚合酶、t7dna聚合酶或ventdna聚合酶)，除了充当dna聚合酶外，还可以进行下列额外活性(在dntp存在下)：(1)从双链dna的3'突出端去除碱基和(2)将单链dna降解成核苷酸。(参见newenglandbiolabs,newengland.“newenglandbiolabs目录和技术参考”beverly,ma:newenglandbiolabs(2014)和bebenek,k.等人(1989)《核酸研究(nucl.acidsres.)》17,5408，以引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，具有这些额外活性的这些3'至5'核酸外切酶dna聚合酶可用于两步嵌套多重pcr。在某些商业实施方案中，在第一阶段pcr结束时，反应混合物在嵌套第二阶段反应之前被稀释例如100至250倍，并且使用新的内部嵌套引物(嵌套在第一阶段引物内的引物)。这样做是为了防止第一阶段pcr引物继续扩增任何引物二聚体，避免了扩增曲线中的非特异性上升基线和第二阶段pcr中的大的广泛的解链峰。一个说明性处理，具有3'至5'核酸外切酶活性的dna聚合酶(例如exo+dna聚合酶)在dntp存在下将会降解尚未掺入双链扩增子的第一阶段引物。正确的扩增子、非特异性扩增子和引物二聚体全部是双链，所以它们应保持完整。在没有第一阶段pcr引物的情况下，第一阶段pcr中存在的引物二聚体应不在第二阶段pcr中扩增，因此在第一阶段pcr与第二阶段pcr之间能够进行较小的稀释(或不稀释)，这意味着将需要更少的循环来使得第二阶段扩增子超过背景(在第二阶段反应中具有较早的cp)。
另外，exo+dna聚合酶处理将降解低拷贝数的高复杂度基因组(例如人类基因组dna、转化成cdna的人类mrna(当使用rt-pcr步骤时)以及未扩增的病原体和可能存在的污染)片段。这可能发生是因为标准pcr循环条件(特别是退火步骤)可能足够快以防止低拷贝高复杂度dna重退火，并因此将被exo+活性降解，但是一些以较高拷贝数存在的序列可能重退火。在这个步骤中使用核酸外切酶的优点是它降低了进入第二阶段pcr反应的dna的序列复杂性。这可以导致第二阶段pcr中更少的非特异性扩增，其可以通过双链dna结合染料(如lcgreen)检测到。因此，有可能在第二阶段pcr中增加额外的循环，其中由于错误扩增而产生的信号干扰较小。
在一个说明性实例中，在小袋610中，使用来自注射通道616h、615i和/或615j的组分来制备各自约10至15倍的两个连续稀释，等于100至225倍总稀释度。作为进行这种稀释水平的替代方案，在一个说明性的实施方案中，可以在循环结束时，将少量exo+聚合酶直接添加到第一阶段pcr中，例如从注射通道615h。这可能需要更长时间的消化，因为在高度多重的第一阶段pcr中存在大量的引物。应理解，这些引物中的大多数仍然是单链，因为在任何单次运行中通常只有少数靶被扩增。然而，第二阶段pcr中降低速度的任何优点都会因为进行这种大量消化所花费的时间所丢失。因此，可能需要在exo+消化之前或同时进行单次稀释，例如10至15倍。例如，如果exo+酶是t4或t7，那么可以将混合物分别在37至42℃下培育足够的时间以使第一阶段pcr引物降解。在这一步骤结束时，可将混合物加热至80至90℃并持续足够长的时间以使exo+酶失活。然后可以使这一混合物大量涌入第二阶段阵列681。
在一些实施方案中，使用具有3'至5'核酸外切酶的ventdna聚合酶，并且必须采取步骤以防止通过vent聚合酶使第二阶段pcr引物失活。vent聚合酶不耐热，因此在进行第二步pcr扩增之前，不能通过加热钝化。为了防止通过vent聚合酶的3'至5'核酸外切酶活性使第二阶段pcr引物失活，可将vent聚合酶的浓度滴定至足够低以至于不会降解第二阶段引物(参见barneswm.pnasusa.1994年3月15日；91(6):2216-20.pmid:8134376，其描述了使用klentaq聚合酶和ventdna聚合酶的混合物，其中klentaq构成混合物的主要组分并且ventdna聚合酶是混合物的次要组分)。也可以使用在寡核苷酸的3'端含有几个具有硫代磷酸酯键的碱基的第二阶段引物，因为这些碱基对3'至5'核酸外切酶dna聚合酶的exo+活性具有抗性(参见chrisey,l.a.(1991)《反义，研究与发展(antisense,researchanddevelopment)》1(1),65-113；spitzer,s.；eckstein,f.(1988)《核酸研究》16(24),11691-11704.connolly,b.a.；potter,b.v.l.；eckstein,f.；pingoud,a.；grotjahn,l.(1984)《生物化学(biochemistry)》23,3443-3453；stein,c.a.；pal,r.；devico,a.l.；hoke,g.；mumbauer,s.；kinstler,o.；sarngadharan,m.g.；letsinger,r.l.(1991)《生物化学》30(9),2439-2444.sayers,j.r.；olsen,d.b.；eckstein,f.(1989)《核酸研究》17(22)9495.manson,j.；brown,t.；duff,g.(1990)《淋巴因子研究(lymphokineresearch)》9(1),35-42.woolf,t.m.；jennings,c.b.g.；rebagliati,m.；melton,d.a.(1990)《核酸研究》18(7),1763-1769.leiter,j.m.e.；agrawal,s.；palese,p.；zamecnik,p.c.(1990)《美国国家科学院院报(natl.acad.sci.usa)》87(9),3430-3434.reed,j.c.；stein,c.；subasinghe,c.；haldar,s.；croce,c.m.；yum,s.；cohen,j.(1990)《癌症研究(cancerresearch)》50(20),6565-6570；iyer,r.p.；egan,w.；regan,j.b.；beaucage,s.l.(1990)《美国化学协会杂志(j.am.chemsoc.)》112,1254-1255.iyer,r.p.；phillips,l.r.；egan,w.；regan,j.b.；beaucage,s.l.(1990)《有机化学杂志(j.org.chem.)》55,4693-4699；dagle,j.m.；weeks,d.l.；walder,j.a.(1991)《反义，研究与发展》1(1),11-20.maher,l.j.；dolnick,b.j.(1988)《核酸研究》16,3341-3358.walkder,r.y.；walkder,j.a.(1988)《美国国家科学院院报》85,5011-5015，以全文引用的方式并入本文中)。
除了降低第二阶段pcr反应的复杂性之外，exo+dna聚合酶也可用于将较长的第一阶段pcr扩增子转化成较短的第二阶段pcr扩增子，后者在其3'端含有用于测序的通用引物序列的互补序列。
在一些实施方案中，某些测序方法(例如illuminasbs或iontorrent)确定来自单个克隆群体的测序读段。应理解，单核苷酸多态性(snp)和插入和缺失(in/del)不会在自单个克隆群体确定的这些序列中造成错读。因此，通过比较多个序列读段之间的序列，snp和/或in/del可以被定位于经测序的分子群体中，然后可以确定snp和in/del中的特定变化。在其它实施方案中，在序列不是从单个克隆群体确定的情况下，由于多个分子群体可能对序列信号有贡献，因此snp和in/del可能在序列中造成错读。在一些情况下，序列中的这些错读在常规sanger测序中可能由相同的原因引起。与所述技术一样，可以确定多态性的性质，因为snp将在一个特定位置显示为两个不同的碱基。类似地，一个碱基插入将表现为取决于该碱基位置的单个序列以及此后彼此的一碱基框移码的两个序列的混合物。可以将这一信息去卷积以确定snp和in/del，就像sanger测序一样。
返回图4，说明性阵列681可以具有100至1000个点，但是更多或更少的点也是可能的，在一些情况下，点例如可以是直径2mm，总体阵列例如为25mm×25mm。然而，这个尺寸仅仅是说明性的，并且涵盖任何数量的点和任何尺寸的阵列。在一个实施方案中，此阵列上的点将含有在第一阶段扩增中(例如在泡状结构664中)产生的给定扩增子的一对内部引物两者。内部引物例如各自在其5'端具有与通用正向引物或通用反向引物互补的附加序列(例如，类似于在几种不同的ngs方法中在文库生成期间引入的共有测序引物)。在一个实施方案中，条形码引物序列(如下一代测序中通常使用的)可以被省略，因为点的位置编码关于在所述点中存在的扩增子的信息，并因此编码将在所述点产生的序列的身份。
在多个循环之后(取决于具体测定，在约10至约26个循环之间，其中10个循环对于丰富的病原体可能是足够的，并且26个循环用于较少丰度的靶以便在第一阶段pcr中达到饱和产物形成)，如上所述，使此第一阶段pcr材料大量涌入到阵列681中。在一个实例中，将样品趁热转移到阵列681(以使pcr产物变性)，使其冷却并与阵列681上的引物杂交。进入第二阶段扩增区680的dna聚合酶和dntp可以延伸所杂交的拴系寡核苷酸。例如，可以稀释第一阶段扩增产物或可以在不稀释的情况下使用第一阶段扩增产物，因为可以在阵列上的拴系寡核苷酸单轮延伸结束之后进行测序。在延伸之后，额外的材料可以通过通道665推回或通过通道667排出，并且可以从任何或所有入口孔615i、615j和615k引入新的pcr缓冲液、酶和dntp。这将去除所有溶液扩增子和第一阶段引物。
如上所述，在泡状结构664中扩增之后，可通过将扩增子221移动到第二阶段扩增区680中而在该区680中进行扩增。在阵列681上使用拴系引物224和反向引物进行扩增，该反向引物任选具有与通用引物互补的序列，如上述。图5a-5c示出了使用桥式pcr的一个实例。使用正向引物224(图5a(i)-(iii))的sifx部分首先出现扩增第一阶段扩增子221，以产生第二阶段扩增子229。使用反向引物sirx可以产生反向链230(图5b(iv)-(v))。exo+dna聚合酶可以用于修复长的第一阶段扩增子的末端234，使其在3'端具有ur引物序列(图5c(vi)和(vii))可用于使用ur引物进行测序。链230在其3'端包含通用引物uf的互补序列，使得链230任选地也可以是使用通用引物uf并使用在miseq或hiseq(illumina)上所用方法类似的方法被测序。任选地，在这个实施方案中，可以对一条或两条链229、230进行测序。
桥式pcr可以在dsdna结合染料如
如果在阵列上存在扩增子，那么可以使用通道665和667来引入和去除用于测序的溶液。然后可以通过任何常规方法进行测序，包括在本申请中描述的那些方法，包括通过如由illumina描述的那些方法(参见例如专利第7,544,794号和第8,946,397号，其以引用的方式并入本文中)。
应理解，也可以使用其它测序机制。例如可以使用类似于454焦磷酸测序技术的实施方案，其中掺入特定点682的dntp产生焦磷酸，并且另外的酶将其转化为atp并接着转化为光。检测此光以揭示核苷酸序列。类似地，可以使用iontorrent型技术，其中产生的信号是质子并且检测是阵列下的ph敏感性晶体管元件。
还可以通过测量流经并入阵列681中的nanopore型通道的分子的电流变化来进行测序，或者可以将阵列681移动到nanopore仪器。其它测序方法是本领域中已知的并且涵盖在本文中。
在一个替代性实施方案中，可以使用如上所述的相同小袋610，或可以使用用于两步pcr的其它容器。然而，在这一实施方案中，每个引物对的仅一个内部引物被拴系到阵列，并且所有内部引物都存在于第二阶段扩增区680中的扩增溶液中。这一实施方式的优点在于溶液中的扩增以及阵列上的扩增是快速且高效的，但是其也具有所有内部引物存在于混合物中的缺点，因此将会有更多的非特异性产物制成，并且这可能导致与每个点结合的产物不是单分子物。在这一实施方式中，在扩增和解链分析之后，可以洗掉阵列的反向链并且阵列变得像测序文库一样，并使适当系列的测序化学物质大量涌入到小容量阵列上并如上所述检测。除了在单个反应混合物中进行阵列682上的扩增之外，这一实施方案与图1所描述的类似。
例如，在一类似实施方案中，只有特异性内部正向引物(sifx是324，拴系到阵列681，并且仅有反向引物332存在于溶液中(图6a)，用于进一步扩增第一阶段扩增子321。一个优势在于多重第二阶段反应具有大致半数的引物存在，这将减少非特异性扩增。然而，这也意味着扩增动力学较慢，因为一条链仅在阵列上形成，而另一条链只在溶液中形成(图6a-6b(i)-(iv))。在这一实施方案中，在扩增和任选的解链分析(图6a-6b(i)-(iv))之后，洗掉阵列上的反向链(在变性之后，图6b(iii)-(iv))并且阵列充当测序文库，并使适当系列的测序化学物质大量涌入小容量阵列上并检测，如上所述。
此外，第二阶段反向引物在阵列681周围的溶液中的非特异性扩增不应干扰在阵列681上的每个点682处产生第二阶段扩增子的单分子种，因为进入这个第二阶段反应的材料的序列复杂性已经由于第一阶段pcr的富集而降低。然而，应理解，可以一起或分别采取额外的步骤来确保单分子种。在一个这样的步骤中，如上所述，可以使用3'至5'exo+dna聚合酶以更进一步降低输入材料的序列复杂性。
在另一个说明性实例中，pcr的特异性可以使用如genaco生物医学产品公司的templex法(hanj等人.jcm.2006年11月；44(11):4157-62.pmid:17005760)来提高。在这一说明性实施方案中，存在于阵列681上的溶液中的引物332包括结合在特异性内部引物的5'侧的通用反向序列330(最好参见图6c-6d)。例如，这些引物以标准pcr中存在的正常浓度(标准为0.4至0.8μm)的1/10至1/100存在。引物二聚体的形成需要两个引物和dna聚合酶的三分子复合物，并且这一复合物的形成速率随引物浓度而改变。因此，如果每个引物以标准pcr中浓度的1/10存在，那么引物二聚体形成的速率应降低到1/100。除了以低浓度存在的ursir引物332之外，还存在以标准引物浓度存在的另外的引物——ur序列。在进行长时间延伸使得低浓度ursir引物有时间与其靶标杂交(图6c-6d(v)-(viii))的几个pcr循环(例如3至10个循环)后，在新生扩增子329中有足够的ur序列的互补序列。此时，任选地可以洗掉ursir引物并且可以引入exo+dna聚合酶来修复扩增子329以产生扩增子329a，使其含有与通用引物320互补的序列(图6d-6e(viii)-(ix))。然后可以引入高浓度的单ur引物以退火至此模板(图6e(xi))，并且pcr循环可以按照标准退火和延伸时间进行。最终结果是第二阶段pcr的特异性增加，因此阵列上的每个特征更可能是单分子种。因此，在pcr的早期阶段，获得增加的特异性，以几个较慢的循环作为交换。
在第三实例中，templex法的进一步扩展使用benner的“自避免分子识别系统”(samrs)和“人工扩展的遗传信息系统”(aegis)(glushakova等人,《病毒学方法杂志(j.virol.methods)》2015年3月；214:60-74.pmid:25680538)，其以引用的方式并入本文中。这使嵌套pcr格式的干净的高水平多重pcr扩增成为可能。这可以如在第二阶段反应区680中的第二阶段多重反应中所述的那样直接进行。
实例4
现在描述嵌套在第一阶段pcr扩增子内的多个区域的测序。在一些情况下，确定第一阶段pcr扩增子的许多区域，例如来源于嵌套在第一阶段pcr靶标内的不同第二阶段扩增子的序列，将是有利的。例如，赋予esbl表型的temβ-内酰胺酶的突变可以在基因中扩散。可以在第一阶段扩增反应中扩增基因的一大部分，然后在第二阶段pcr中扩增多个更小的区域。
在一个说明性实例中，在第二阶段pcr中产生重叠扩增子。当以不连续的反应进行时，如在图1装置的孔582中，可以容易地产生这些重叠的扩增子。在图4的阵列681中，扩增的特异性来自附着到阵列点682的引物。然而，溶液中的引物和点682上的引物可重叠(参见图7a(i)-(ii))，其方式并非制备一组离散的重叠第二阶段扩增子(图7a(i)中的i1至i5)，甚至可以产生更短的不重叠并且不完全覆盖序列的扩增子(例如在sifb1和sira1之间，其将产生仅仅是i1和i2的重叠部分的扩增子)。
这个问题可以通过将第二阶段pcr分成两个隔室来避免，它们两个都与第二阶段扩增区680类似，具有两组反应(图7b和7c)。在这一实施方式中，在第二阶段a(图7b(iv))中产生的扩增子不重叠，从而使得不需要的短扩增子减到最少或消除。插入的扩增子在第二阶段b(图7b(v))中产生，并且它们类似地不重叠，从而使得不需要的短扩增子类似地被减到最少或消除。
实例5
除了所有的内部引物都存在于混合物中之外(图8a)，这一实施方式类似于上述实例3。其优势在于溶液中的扩增以及阵列上的扩增是快速和高效的(图8b)。为了添加针对在阵列681上合成的单分子种的特异性的任选过滤器，捕获引物可以是“内部-内部”。内部-内部siifx杂交到基于溶液的内部引物sifx内部的序列，其在外部引物sofx内部(参见图8a(i))。只要几个碱基(例如至少4个碱基)位于sifx序列的内部(或3')，内部-内部引物siifx就可以在该方向上与内部引物sifx部分重叠。使用如图8b(iv)所示的内部引物sifn和ursirn，并且同时在如图8b(iii)所示的阵列682上进行基于溶液的pcr，产生具有如图8c(v)所示的适当通用引物的拴系扩增子。在这一实施方案中，因为使用两组嵌套引物sifx和siifx提供增加的特异性，所以应理解，用sofx进行的第一阶段扩增是任选的，并且所有的扩增都可以在单个扩增腔室中进行。可以根据上面讨论的任何方法制备用于测序的阵列681。
本发明可以在不脱离其精神或基本特征的情况下以其它具体形式来实施。所描述的实施方案在所有方面仅被认为是说明性的而非限制性的。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前面的描述来指示。尽管为了说明本发明，本文和所附的发明公开内容中已经包括某些实施方案和详情，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以对本文公开的方法和设备进行各种改变。在权利要求的含义和等效范围内的所有变化都将被包括在其范围内。
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