不适用。
技术领域：
：本发明的领域为药物缀合的双特异性抗原结合构建体，例如抗体，其包含CD3抗原结合多肽构建体(例如CD3结合结构域)和第二抗原结合多肽构建体，例如结合靶细胞(例如肿瘤细胞)上表达的靶抗原的结构域。发明背景在治疗性蛋白质的领域中，具有多价靶结合特征的抗体是用于设计药物候选物的优秀支架。进一步推进这些特征，设计的双特异性抗体及其它融合的多特异性治疗剂展现双重或多重靶特异性及产生具有新型作用模式的药物的机会。具有有利的药代动力学和功能活性的这种多价及多特异性治疗性蛋白质的开发是一个挑战。已鉴别能够使T细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体并测试其治疗癌症的功效。博纳吐单抗是呈称为BiTETM(双特异性T细胞接合物)形式的双特异性抗CD3-CD19抗体的一个实例，其已被鉴别用于治疗B细胞疾病，如复发性B细胞非何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病(Baeuerle等人(2009)12：4941-4944)并且经FDA批准。还制造了针对其它肿瘤相关靶抗原的T细胞接合物，并且其中几种已进入临床试验：AMG110/MT110EpCAM用于肺癌、胃癌和结肠直肠癌；AMG211/MEDI565CEA用于胃肠腺癌；以及AMG212/BAY2010112PSMA用于前列腺癌(参见Suruadevara，C.M.等人，Oncoimmunology.2015Jun；4(6)：e1008339)。BiTETM形式是连接来源于两种不同抗体的可变结构域的双特异性单链抗体构建体。博纳吐单抗对B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)非常有效，总反应率超过80％，尽管有高功效，但许多患者还是在治疗之后不久或期间复发。另外，已经显示T细胞接合物在像慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的恶性肿瘤中不太有效。需要更有效且更持久的T细胞接合物疗法。T细胞接合物抗原结合构建体描述于以下中：2013年7月13日提交且名称为“BispecificAsymmetricHeterodimersComprisingAnti-CD3Constructs”的国际申请号PCT/US2013/050411；2014年7月11日提交且名称为“BispecificCD3andCD19AntigenBindingConstructs”的国际申请号PCT/US2014/046436；2015年1月15日提交且名称为“BispecificCD3andCD19AntigenBindingConstructs”的PCT/US2015/011664。发明概述本文描述了一种药物缀合的抗原结合构建体，其包含：第一抗原结合多肽构建体，所述第一抗原结合多肽构建体特异性地结合T细胞上表达的CD3抗原；和第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体特异性地结合靶细胞上表达的疾病相关靶抗原。第一与第二抗原结合多肽被可操作地连接；并且抗原结合构建体被缀合至药物，任选缀合至2种不同药物。在一些实施方案中，所述药物缀合的抗原结合构建体展示比参照抗原结合构建体更高的对靶细胞的体外杀伤效力，该参照抗原结合构建体不缀合至药物且当向受试者施用时基本上不耗竭T细胞。所述药物缀合的抗原结合构建体包含一种或多种药物分子。所述药物缀合的抗原结合构建体可包含异二聚Fc，所述异二聚Fc包含在有或没有第一接头下与第一抗原结合多肽构建体连接的第一Fc多肽以及在有或没有第二接头下与第二抗原结合多肽构建体连接的第二Fc多肽。在一些实施方案中，靶抗原为CD19。在一些实施方案中，靶抗原为CDH3。在一些实施方案中，靶抗原为HER2。在一些实施方案中，靶抗原为CDH3。在一些实施方案中，靶抗原为EGFR。在一些实施方案中，靶抗原选自表LL。本公开的一方面为一种杀伤在细胞表面上表达靶抗原的靶细胞的方法，所述方法包括在效应T细胞存在下使所述靶细胞与有效量的药物缀合的抗原结合构建体接触，其中所述药物缀合的抗原结合构建体包含：特异性地结合所述效应T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合多肽构建体，所述第一抗原结合多肽构建体包含第一重链可变(VH)区和第一轻链可变(VL)区；包含第二VH区和第二VL区的第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体特异性地结合所述靶抗原；及至少一种缀合至所述抗原结合构建体的药物；其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接；且所述靶抗原不为CD3；且其中(a)如通过SPR或FACS分析所测量，所述抗原结合构建体对所述靶抗原展示比对CD3更高的亲和力；和/或(b)如在体外测定中所测量，所述抗原结合构建体对带有所述靶抗原的靶细胞展示比对T细胞更高的杀伤效力。本公开的另一方面为一种杀伤受试者中细胞表面上表达靶抗原的靶细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物缀合的抗原结合构建体，其中所述药物缀合的抗原结合构建体包含：特异性地结合受试者的T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合多肽构建体，所述第一抗原结合多肽构建体包含第一重链可变(VH)区和第一轻链可变(VL)区；包含第二VH区和第二VL区的第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体特异性地结合所述靶抗原；及至少一种缀合至所述抗原结合构建体的药物；其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接；且所述靶抗原不为CD3；且其中(a)如通过SPR或FACS分析所测量，所述抗原结合构建体对所述靶抗原展示比对CD3更高的亲和力；和/或(b)如在体外测定中所测量，所述抗原结合构建体对带有所述靶抗原的靶细胞展示比对T细胞更高的杀伤效力。本公开的另一方面为一种治疗有此需要的受试者中的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的药物缀合的抗原结合构建体，其中所述药物缀合的抗原结合构建体包含：特异性地结合受试者的T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合多肽构建体，所述第一抗原结合多肽构建体包含第一重链可变(VH)区和第一轻链可变(VL)区；包含第二VH区和第二VL区的第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体特异性地结合所述靶抗原；及至少一种缀合至所述抗原结合构建体的药物；其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接；且所述靶抗原不为CD3；且其中(a)如通过SPR或FACS分析所测量，所述抗原结合构建体对所述靶抗原展示比对CD3更高的亲和力；和/或(b)如在体外测定中所测量，所述抗原结合构建体对带有所述靶抗原的靶细胞展示比对T细胞更高的杀伤效力。本公开的另一方面为一种由药物缀合的抗原结合构建体组成的组合物，所述构建体包含：含有第一VH区和任选第一VL区的第一抗原结合多肽构建体，所述第一抗原结合多肽构建体特异性地结合T细胞上表达的CD3抗原；包含第二VH区和任选第二VL区的第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体特异性地结合靶细胞上表达的靶抗原；及至少一种缀合至所述抗原结合构建体的药物；其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接；且其中所述靶抗原不为CD3；且其中所述靶抗原不为CD3；且其中如通过SPR或FACS分析所测量，所述抗原结合构建体对所述靶抗原展示比对CD3更高的亲和力。在一些实施方案中，如在体外测定中所测量，所述抗原结合构建体对带有所述靶抗原的靶细胞展示比对T细胞更高的杀伤效力。本公开的另一方面为一种结合至CD3ε亚基的抗原结合构建体，其包含含有VH区和VL区的第一抗原结合多肽构建体，其中所述VH区包含3个含有表S1中的OKT3的人源化变体的VHCDR的氨基酸序列的CDR；且所述VL区包含3个含有表S1中的OKT3的人源化变体的VLCDR的氨基酸序列的CDR。在一个实施方案中，所述构建体包含：VH区，其包含选自图2中的hVH1或hVH2的氨基酸序列和与图4中的hVH1或hVH2的氨基酸序列有至少80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列；和VL区，其包含选自图4中的hVL1或hVL2的氨基酸序列和与图4中的hVL1或hVL2的氨基酸序列有至少80、85、90、95、96、97、98或99％同一性的氨基酸序列的氨基酸序列。附图说明图1A描绘了缀合至药物的抗原结合构建体的设计示意图，所述药物是由“星”描绘。抗原结合构建体的一个结合结构域结合至CD3抗原，而另一结合结构域结合至靶细胞的细胞表面上表达的“靶抗原”。虽然仅存在一个“星”，但构建体可含有多个药物分子，所述药物分子可为相同或不同的。图1A(i)示出了示例性抗原结合构建体的图示，其中抗原结合构建体的两个抗原结合结构域都为scFv，其中每个scFv的VH和VL区与多肽接头相连接。每个scFv还以铰链多肽接头连接到异二聚Fc的一条多肽链。抗原结合构建体的两条多肽链经由二硫键(描绘为粗实线)共价连接在一起。图1A(ii)描绘了类似于1A(i)的示例性抗原结合构建体的图示，例外之处在于CD3结合结构域为Fab且靶抗原结合结构域为scFv。图1A(iii)描绘了类似的抗原结合构建体，其中CD3结合结构域为scFv且靶抗原结合结构域为Fab。图1A(iv)描绘了类似的抗原结合构建体，其中CD3和靶抗原结合结构域都为Fab。图1B描绘了抗原结合构建体药物缀合物(ADC)的示例性实施方案。图1B(i)示出了4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(MCC)-DM1缀合物，其中接头-毒素经由赖氨酸残基缀合于抗原结合构建体上；图1B(ii)示出了N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)-DM4缀合物，其中接头-毒素经由赖氨酸残基缀合于抗原结合构建体上；图1B(iii)示出了马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-Val-Cit-PABC)-MMAE缀合物，其中接头-毒素经由半胱氨酸残基缀合于抗原结合构建体上。“Ab”表示抗原结合构建体，其可为图1A-1D中示出的任一种设计。“n”表示缀合至抗原结合构建体的接头-毒素部分的数量并且介于1与20之间。图2描绘了基于小鼠HD37VL和VH序列的人源化CD19VL和VH序列。已提供三个人源化VL序列：hVL2、hVL2(D-E)和hVL2(D-S)。hVL2(D-E)在CDRL1中含有D至E的取代，而hVL2(D-S)在CDRL1中含有D至S的取代。已提供两个人源化VH序列：hVH2和hVH3。CDR序列由方框标示。此图中鉴别的CDR仅为示例性的。如本领域中已知，CDR的鉴别可根据用于鉴别它们的方法而变化。抗CD19VL和VH序列的替代CDR定义示于表S1中。相对于野生型小鼠HD37抗体序列人源化这些序列的修饰加下划线指示。图3描绘了显示基于抗CD19HD37抗体的根据抗CD19VH和VL序列的Kabat的数量的表。图4描绘了基于小鼠OKT3和替利珠单抗(teplizumab)(已知的人源化OKT3)序列的人源化CD3VL和VH序列。已提供两个VH序列：hVH1和hVH2。已提供两个VL序列：hVL1和hVL2。CDR序列由方框标示。此图中鉴别的CDR仅为示例性的。如本领域中已知，CDR的鉴别可根据用于鉴别它们的方法而变化。抗CD3VL和VH序列的替代CDR定义示于表S1中。这些序列相对于野生型替利珠单抗抗体序列的修饰加下划线指示。图5描绘了显示基于抗CD3OKT3抗体的抗CD3VH和VL序列的根据Kabat的编号的表。图6描绘了亲代鼠科抗CD3-CD19抗原结合构建体v6751(左)和人源化抗CD3-CD19抗原结合构建体v15192(右)的SEC分布图，显示v15192极大提高的纯度。图7描绘了与亲代鼠科抗CD3-CD19抗原结合构建体相比示例性人源化抗CD3-CD19抗原结合构建体的DSC热分析图，显示人源化变体的Tm的升高。标记为A和B的变体代表相同变体的不同生产批次。图8描绘了人源化抗CD3-CD19抗原结合构建体v15195与(图A)RajiCD19+B细胞；(图B)JurkatCD3+T细胞的结合。图(C)描绘了当v15195与人外周血单核细胞(PBMC)孵育时检测到的T∶B细胞双联体的百分比。T∶B细胞双联体被检测为CD20+和CD4+或CD8+。图9描绘了在使用SMCC接头缀合至毒素DM1之后抗CD3-CD19抗原结合构建体v12043的示例性UPLC-SEC分布图。图10描绘了以下测定的结果：其中以各种浓度测试缀合至DM1或DM4的选出的示例性抗CD3-CD19变体抑制以下细胞生长的能力：(A)表达CD19的RamosB细胞；(B)表达CD3而不表达CD19的JurkatT细胞；及(C)表达CD19而不表达CD3的RajiB细胞。图11描绘了在与已耗竭B细胞的同种异体外周血单核细胞一起孵育的Raji细胞的72小时培养物中各种浓度的非缀合变体抗CD3-CD19变体12043、v12043-DM1及v12043-DM4对以下细胞的作用：(A)Raji细胞(CD19+)；(B)CD8+T细胞；及(C)CD8+/CD69+T细胞。图12描绘了如图11中进行的第二实验的结果。图13描绘了在与已耗竭B细胞的同种异体外周血单核细胞一起孵育的Ramos细胞的72小时培养物中各种浓度的DM1缀合的抗CD3-CD19变体6754和6751以及DM1缀合的对照变体(v891、博纳吐单抗及v4372二价单特异性抗CD19抗体)对以下细胞的作用：(A)Ramos(CD19+)靶B细胞；(B)CD4+T细胞；及(C)PD-1+T细胞。图14描绘了如图13中进行的第二实验的结果。图15描绘了各种浓度的缀合至DM1的示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v6751对Raji(即ALL细胞系)和Ramos(即NHL细胞系)、Jurkat(T细胞系)和K562(既不表达CD19也不表达CD3的细胞系)的细胞毒性作用。对照抗体为缀合至DM1huB12的单特异性二价抗CD19抗体和缀合至DM1的同种型非特异性IgG。图16描绘了在培养72小时之后示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v15195、缀合至DM1的v15195及博纳吐单抗对Raji细胞的作用。图17描绘了缀合至DM1的v15195在各种浓度下对以下各种ALL和NHL细胞系的作用：RS4-11、Nalm-6、Daudi、SUDHL-4及SUDHL-6。图18A描绘了v15195、缀合至DM1的v15195及博纳吐单抗在Raji细胞与人PBMC共培养的培养物中对CD8+T细胞、CD8+/CD69+T细胞及CD8+/CD25+T细胞的作用。图18B描绘了在v6751、博纳吐单抗及OKT3抗体下在Raji细胞与人PBMC-B细胞共培养的培养物中观察到的增殖。图19描绘了示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v6751、缀合至DM1的v6751及对照二价单特异性抗体抗CD19抗体、huBU12及缀合至DM1的huBU12在PBMC-B细胞的培养物中对以下各种T细胞亚群的作用：CD4+、CD8+、CD4+/CD25+及CD8+/CD25+。图20A描绘了v15195和缀合至DM1的v15195在Raji细胞与PBMC-B细胞的共培养物中对CD8+和CD8+/CD25+T细胞的作用。图20B描绘了细胞因子IFNg、IL6及IL10在培养物中在72小时时的水平。图21描绘了示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v15193及缀合至MMAE的v15193在各种浓度下在与PBMC的共培养物中对CD8+T细胞和靶RamosB细胞的作用。图22描绘了向人源化小鼠单次静脉内施用在0.1至1.0mg/kg范围内的变化剂量的示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v12043(无药物缀合)、v12043-DM1及v12043-DM4在施用之后的5天时期在人源化NSG小鼠中对B和T细胞计数的作用。图23描绘了向人源化小鼠单次静脉内施用在0.3至9.0mg/kg范围内的变化剂量的缀合至DM1的示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体v15195在施用之后第8天在脾脏和外周血中对CD3+T细胞的作用。图24描绘了pHAb标记的示例性抗原结合构建体抗CD3-CD19v15195、抗CD3-EGFRv16371及抗CD3-CDH3v13831和对照抗体(v2171UCHT1抗CD3单特异性二价抗体；和抗RSV抗体，Synagis)的细胞内化。所测试的细胞系为Jurkat、A431、SKOV3、HCT-116及JIMT1。图25描绘了在T细胞不存在下示例性抗原结合构建体抗CD3-CDH3v13831、抗CD3-HER2v13792、抗CD3-HER3v13790(全部都缀合至DM1)与非特异性IgG对照v6249相比对靶细胞系的直接细胞毒性/生长抑制。所测试的细胞系为MCF7、SKOV3、JIMT1及Jurkat。图26描绘了示例性抗原结合构建体抗CD3-CDH3v13831及抗CD3-HER2v13792及其DM1缀合物在各种浓度下对与PBMC共培养的JIMT1肿瘤靶细胞的作用。图27描绘了不同T细胞亚群在JIMT1肿瘤靶细胞和PBMC的共培养物中的T细胞增殖和活化，向共培养物中添加各种浓度的DM1缀合或非缀合的抗CD3-CDH3v13831或抗CD3-HER2v13792。对于每个构建体评估CD4、CD4+CD69、CD4+CD25、CD8、CD8+CD69、CD8+CD25阳性T细胞的水平。图28描绘了在JIMT肿瘤靶细胞和PBMC的共培养物中DM1缀合的和非缀合的抗CD3-CDH3的作用及不同效应细胞与靶细胞比率。发明详述本文描述了药物缀合的双特异性抗原结合构建体，例如抗体，常称为抗体药物缀合物或ADC。本文提供了药物缀合的抗原结合构建体，其结合至T细胞上表达的CD3抗原和在靶细胞(例如肿瘤细胞、负责自身免疫的细胞或感染了病原体的细胞)表面上表达的第二靶抗原。这些药物缀合的抗原结合构建体包含特异性地结合至T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合结构域、和特异性地结合至靶细胞表面上表达的另一靶抗原的第二抗原结合结构域、及缀合至所述抗原结合构建体的至少一种药物分子。第一与第二抗原结合结构域可彼此可操作地连接，或者它们可各自连接至支架，如Fc结构域，如本文进一步描述。在本文中用于产生ADC的某些示例性双特异性抗原结合构建体在别处已显示能够将表达CD3的T细胞与表达CD19的B细胞桥接，其中形成免疫突触。如通过体外和离体测定所测量，这些抗原结合构建体能够介导T细胞定向的B细胞耗竭，且如在疾病体内模型中所评价。在本文所述的一些实施方案中，显示抗CD3靶抗原药物缀合的抗原结合构建体在体外耗竭靶肿瘤细胞方面展现比不包含药物的相同抗原结合构建体更高的杀伤效力。出乎意料的是，若干示例性CD3靶抗原药物缀合的抗原结合构建体在本文中显示在体外展现对表达靶抗原的肿瘤细胞的高杀伤效力，同时展现对T细胞的低效力。另外，在一些实施方案中，显示这些ADC当以高达3mg/kg的剂量施用时不显著地耗竭人源化小鼠中的体内循环T细胞。鉴于缺乏对T细胞的影响，且不希望受理论约束，CD3靶抗原药物缀合的抗原结合构建体似乎可通过两种不同的机制发挥其对靶细胞的作用：T细胞介导的杀伤、和由CD3靶抗原药物缀合的抗原结合构建体的内化引起的毒素/小分子介导的杀伤。因此，本文所述的抗CD3靶抗原药物缀合的抗原结合构建体在治疗如癌症的疾病中可具有优于常规T细胞接合物治疗剂的附加益处，据我们所知，它们都没有掺入毒素或其它药物。另外，包含对CD3和靶抗原的抗原结合结构域的药物缀合的双特异性抗原结合构建体通过将T细胞介导的杀伤机制与药物介导的杀伤机制组合而在治疗除癌症以外的疾病如自身免疫或炎性疾病及由细胞内病原体引起的疾病中具有潜力。还描述了包含药物缀合的抗原结合构建体的药物组合物及使用本文所述的药物缀合的抗原结合构建体治疗疾病、病症或病状(例如癌症)的方法。本文描述了药物缀合的抗原结合构建体，其包含：特异性地结合T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合多肽构建体；和特异性地结合靶抗原(如在肿瘤细胞表面上表达的肿瘤抗原)的第二抗原结合多肽构建体。第一与第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接；且抗原结合构建体被缀合至药物。药物缀合的抗原结合构建体展示比不缀合至药物的参照抗原结合构建体更高的对带有靶抗原的靶细胞的杀伤效力。抗原结合多肽构建体可具有不同形式。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合多肽各自包含Fab或scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合多肽构建体为Fab且第二抗原结合多肽为scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合多肽构建体为scFv且第二抗原结合多肽为scFv。在其它实施方案中，第一和第二抗原结合多肽构建体可都包含Fab或可都包含scFv。在某些实施方案中，CD3结合多肽构建体为scFv且靶抗原结合构建体为Fab。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体还包含异二聚Fc，所述异二聚Fc包含在有或没有第一接头下与第一抗原结合多肽构建体连接的第一Fc多肽以及在有或没有第二接头下与第二抗原结合多肽构建体连接的第二Fc多肽。如下文中详细描述，在一些实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，所述修饰的CH3结构域包含促进异二聚Fc形成的不对称氨基酸修饰和具有约68℃或更高的解链温度(Tm)的二聚CH3结构域。在一些实施方案中，不对称氨基酸修饰选自下表C。在一些实施方案中，第二抗原结合多肽构建体包含对CD3有特异性且来源于选自以下的抗体的抗原结合多肽构建体：OKT3；TeplizumabTM(MGA031，EliLilly)；博纳吐单抗；UCHT1；NI0401；维西珠单抗；X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SP34、SMC2及F101.01；或其人源化形式。其它CD3结合部分是可能的，并且可通过本文所述的方法制得。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体具有表S1中的野生型OKT3的6个CDR、或OKT3的稳定化变体的6个CDR、或OKT3的人源化变体。在本文所述的一些实施方案中，靶抗原(同源抗原-针对第二抗原结合多肽构建体)为B细胞抗原。在一些实施方案中，靶抗原为CD19。因此，在其中肿瘤抗原为CD19的一些实施方案中，第二抗原结合多肽构建体具有HD37或如表S1中所示的HD37的人源化变体的6个CDR。在一些实施方案中，第二抗原结合多肽构建体包含对CD19有特异性且来源于选自由以下组成的组的抗体的抗原结合多肽构建体：4G7；B4；B43；BU12；CLB-CD19；Leu-12；SJ25-C1；J4.119、B43、SJ25C1、FMC63(IgG2a)HD237(IgG2b)、Mor-208、MEDI-551及MDX-1342。在其它实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体可为缀合至药物的以下变体中的任一种：6754、6751、1853、10151、6475、6749、10152、10153、6476、5850、5851、5852、6325、1661、1653、1662、1660、1666、1801、6747、10149、10150、1380或12043、151912、15193、15194、15195、17118或17119。在具有Fc的药物缀合的抗原结合构建体的许多实施方案中，在CH2结构域中存在修饰以减少或消除Fcγ受体结合且因此它们不具有相关免疫细胞介导的效应物活性。在药物缀合的抗原结合构建体的一些实施方案中，第一抗原结合多肽构建体对CD3的亲和力比第二抗原结合多肽构建体对靶抗原的亲和力低至少2、5、10、15或20倍，如通过SPR或FACS分析所测定。还提供了一种治疗受试者中的疾病、病症或病状的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的药物缀合的抗原结合构建体。在一些实施方案中，所述癌症为造血癌，白血病，淋巴瘤，血液癌，B细胞淋巴瘤，非何杰金氏淋巴瘤，对CD19溶解性抗体、CD20溶解性抗体和博纳吐单抗中的至少一个无反应的癌症，在用博纳吐单抗治疗之后消退的癌细胞，ALL，CLL，NHL，套细胞淋巴瘤，播散性B细胞疾病以及脑、肺、肝和/或骨的转移。在一些实施方案中，肿瘤为实体肿瘤。还提供了一种耗竭受试者中的靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的药物缀合的抗原结合多肽构建体，所述构建体包含：单价且特异性地结合至受试者的T细胞上表达的CD3抗原的第一抗原结合多肽构建体；和特异性地结合至靶细胞上表达的抗原的第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体中第一与第二抗原结合多肽构建体被可操作地连接，且其中抗原结合构建体缀合至药物。在一些实施方案中，受试者中的肿瘤细胞被耗竭，但T细胞基本上未被耗竭。在一些实施方案中，施用不会造成受试者中PD-1+(抑制性)T细胞的上调。用于药物缀合的双特异性抗原结合构建体本文提供了双特异性抗原结合构建体(例如抗体)的药物缀合物，其结合CD3和靶细胞上表达的第二抗原。抗原结合构建体本身包含两种抗原结合多肽构建体，例如特异性地结合CD3或靶抗原的抗原结合结构域。在一些实施方案中，靶抗原与肿瘤有关，例如CD19、HER2、HER3、CDH3或EGFR。在一些实施方案中，抗原结合构建体来源于已知的抗体或抗原结合构建体。如下文中更详细描述，抗原结合多肽构建体可具有Fab或scFv(单链Fv)的形式并且可包括Fc。在一些实施方案中，第一抗原结合多肽构建体(抗CD3)可包含第二scFv，所述第二scFv包含第二VL、第二scFv接头及第二VH；或者抗CD3可包含Fab，所述Fab包含第二VL和第二VH。第二scFv可选自由以下组成的组：OKT3scFv、修饰的OKT3scFv、OKT3阻断抗体scFv及修饰的OKT3阻断抗体scFv，其中OKT3阻断抗体将OKT3与CD3抗原的ε亚基的结合阻断了50％或更多。第二抗原结合多肽构建体可包含对CD3有特异性且来源于选自以下的抗体的抗原结合多肽构建体：OKT3；TeplizumabTM(MGA031，EliLilly)；Micromet、博纳吐单抗；UCHT1；NI0401；维西珠单抗；X35-3、VIT3、BMA030(BW264/56)、CLB-T3/3、CRIS7、YTH12.5、F111-409、CLB-T3.4.2、WT31、WT32、SPv-T3b、11D8、XIII-141、XIII-46、XIII-87、12F6、T3/RW2-8C8、T3/RW2-4B6、OKT3D、M-T301、SMC2、F101.01或SP34。在一些实施方案中，例如，第二抗原结合多肽构建体(抗CD19)可包含scFv，所述scFv包含第一VL、第一scFv接头及第一VH；或者抗CD19可包含Fab，所述Fab包含第一VL和第一VH。第一scFv可选自由以下组成的组：抗CD19抗体HD37scFv、修饰的HD37scFv、HD37阻断抗体scFv及修饰的HD37阻断抗体scFv，其中HD37阻断抗体将HD37与CD19抗原的结合阻断了50％或更多。或者，抗原结合多肽构建体(抗CD19)可包含相应的Fab。第一抗原结合多肽构建体可包含对CD19有特异性且来源于选自由以下组成的组的抗体的抗原结合多肽构建体：4G7；B4；B43；BU12；CLB-CD19；Leu-12；SJ25-C1；J4.119、B43、SJ25C1、FMC63(IgG2a)HD237(IgG2b)、Mor-208、MEDI-551或MDX-1342。异二聚Fc包含第一和第二Fc多肽，其各自包含能够形成二聚CH3结构域的修饰的CH3序列，其中每个修饰的CH3序列包含促进异二聚Fc形成的不对称氨基酸修饰和具有约68℃或更高的解链温度(Tm)的二聚CH3结构域。第一Fc多肽以第一铰链接头与第一抗原结合多肽构建体连接，且第二Fc多肽以第二铰链接头与第二抗原结合多肽构建体连接。在一些实施方案中，且如下所述，Fc的CH2结构域被修饰以减少或消除药物缀合的抗原结合构建体与Fc受体的结合。术语“抗原结合构建体”是指能够结合至抗原的任何因子，例如多肽或多肽复合物。在一些方面中，抗原结合构建体为特异性地结合至目标抗原的多肽。抗原结合构建体可为单体、二聚体、多聚体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物：抗体、抗体片段、或其抗原结合片段；scFv等等。抗原结合构建体可为单特异性、双特异性或多特异性多肽构建体。在一些方面中，抗原结合构建体可包括例如连接至一个或多个Fc上的一种或多种抗原结合组分(例如Fab或scFv)。适用于ADC中的抗原结合构建体的其它实例描述如下并且提供于实施例中。术语“双特异性”旨在包括具有两种抗原结合部分(例如抗原结合多肽构建体)的任何因子，例如抗原结合构建体，其中每个具有独特的结合特异性。举例来说，第一抗原结合部分结合至第一抗原上的表位，且第二抗原结合部分结合至第二抗原上的表位，其中第一抗原不同于第二抗原。例如，在一些实施方案中，双特异性因子可结合至以下或与以下相互作用：(a)细胞表面靶分子，和(b)效应细胞表面上的Fc受体。在另一实施方案中，所述因子可结合至以下或与以下相互作用：(a)第一细胞表面靶分子，和(b)不同于第一细胞表面靶分子的第二细胞表面靶分子。在另一实施方案中，所述因子可结合至并桥接两种细胞，即与以下相互作用：(a)第一细胞上的第一细胞表面靶分子，和(b)第二细胞上的第二细胞表面靶分子，其不同于第一细胞表面靶分子。在一些实施方案中，双特异性抗原结合构建体将表达CD3的T细胞与表达CD19的B细胞桥接，其中形成免疫突触和/或介导T细胞定向的B细胞耗竭。单特异性抗原结合构建体是指具有单一结合特异性的抗原结合构建体。换言之，抗原结合部分都结合至相同抗原上的同一表位。单特异性抗原结合构建体的实例包括抗CD19抗体HD37和抗CD3抗体OKT3。抗原结合构建体可为抗体或其抗原结合部分。如本文所用，“抗体”或“免疫球蛋白”是指基本上由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性地结合并识别分析物(例如抗原)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指为其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，且其中几种可进一步被分成亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别被称作α、δ、ε、γ和μ。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端结构域定义约100至110或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N末端至C末端分别包含VH、CH1、CH2及CH3结构域。轻链从N末端至C末端包含VL和CL结构域。IgG1重链包含介于CH1与CH2结构域之间的铰链。如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域在序列上高变和/或形成结构上定义的环(“高变环”)的每个区。通常，天然的四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列可变性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，且这些术语在本文中关于形成抗原结合区的可变区部分可互换使用。此特殊区已在Kabat等人，U.S.Dept.ofHealthandHumanServices.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1983)和Chothia等人，JMolBiol196：901-917(1987)中描述，其中当互相对比时，这些定义包括氨基酸残基的重叠或子区。尽管如此，对用来指抗体或其变体的CDR的两个定义中的任一个的应用旨在处于文中所定义及所用术语的范围之内。构成特定CDR的精确残基数目将根据CDR的序列和大小而变化。假定抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规确定哪些残基构成特定的CDR。抗体的CDR区可用于构建结合蛋白，包括但不限于抗体、scFv、双抗体等。在某一实施方案中，本文所述的抗原结合构建体将包含来自抗体的至少一个或所有CDR区。CDR序列可用于抗体主链或其片段上，且同样可包括人源化抗体或含有人源化序列的抗体。鉴别抗体的CDR部分的方法在本领域中是公知的。参见，Shirai，H.，Kidera，A.和Nakamura，H.，H3-rules：IdentificationofCDR-H3structuresinantibodies，FEBSLett.，455(1)：188-197，1999；及AlmagroJC，Fransson，J.FrontBiosci.13：1619-33(2008)。抗原结合多肽构建体--形式双特异性抗原结合构建体包含两种抗原结合多肽构建体，例如抗原结合结构域。抗原结合多肽构建体的形式决定了双特异性抗原结合构建体的功能特征。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体具有scFv-scFv形式，即两个抗原结合多肽构建体都为scFv。在另一实施方案中，抗原结合构建体具有scFv-Fab形式。在另一实施方案中，两个抗原结合多肽构建体都为Fab。形式“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一些实施方案中，scFv多肽还包含介于VH与VL结构域之间的多肽接头。关于scFv的综述，参见PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag，NewYork，第269-315页(1994)。其它抗原结合多肽构建体形式包括Fab片段或sdAb。“Fab片段”(也称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定环(CDR，也称为高变区)。Fab‘片段不同于Fab片段之处在于在重链CH1结构域的羧基端处添加了几个残基，包括来自抗体绞链区的一个或多个半胱氨酸。“单结构域抗体”或“sdAb”形式为个别免疫球蛋白结构域。Sdab相当地稳定且便于表示成与抗体的Fc链的融合配偶体(HarmsenMM，DeHaardHJ(2007).″Properties，production，andapplicationsofcamelidsingle-domainantibodyfragments″.Appl.MicrobiolBiotechnol.77(1)：13-22)。在一些实施方案中，本文所提供的抗原结合构建体包含缺乏轻链的抗原结合多肽构建体，因此包含单个结构域抗体。scFv形式本文所述的抗原结合构建体为双特异性的，例如，它们包含两种抗原结合多肽构建体，其各自能够特异性结合至不同抗原。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体中的任一个或两者呈scFv形式(即，抗原结合结构域包含重链可变结构域和轻链可变结构域，以多肽接头相连)。在一个实施方案中，所述scFv为人。在另一实施方案中，所述scFv分子为人源化的。通过如下所述的修饰就蛋白质表达和产量对scFv进行优化。scFv可通过改变可变结构域VL和VH在scFv中的顺序而优化。在本文所述的抗原结合构建体的scFv的一些实施方案中，轻链可变区的C末端可连接到重链可变区的N末端，或重链可变区的C末端可连接到轻链可变区的N末端。可变区可经由接头肽或scFv接头连接，由此允许形成功能性抗原结合部分。可通过改变scFv接头多肽的组成和/或长度就蛋白质表达和产量对scFv进行优化。典型的肽接头包含约2-20个氨基酸，且如本文中所描述或本领域中已知。合适的非免疫原性接头肽包括例如(G4S)n、(SG4)n、(G4S)n、G4(SG4)n或G2(SG2)n接头肽，其中n一般为在1与10之间的数值，通常介于2与4之间。在一些实施方案中，scFv接头选自下表：表A：scFv接头多肽序列可通过在重链与轻链可变结构域之间纳入稳定二硫桥而就蛋白质表达和产量对scFv分子进行优化，例如如Reiter等人(NatBiotechnol14，1239-1245(1996))中所述。因此，在一个实施方案中，本发明的T细胞活化的双特异性抗原结合分子包含scFv分子，其中重链可变结构域中的氨基酸和轻链可变结构域中的氨基酸已被半胱氨酸取代，以便可在重链与轻链可变结构域之间形成二硫桥。在特定的实施方案中，轻链可变结构域的位置44处的氨基酸和重链可变结构域的位置100处的氨基酸已被半胱氨酸取代(Kabat编号)。如本领域中已知，scFv也可通过CDR序列的突变而稳定化，如[Miller等人，ProteinEngDesSel.2010Jul；23(7)：549-57；Igawa等人，MAbs.2011May-Jun；3(3)：243-5；Perchiacca&Tessier，AnnuRevChemBiomolEng.2012；3：263-86.]中所述。scFv的形式和序列的一个或多个上述修饰可应用于抗原结合构建体的scFv。人源化的CD19VH和VL在一些实施方案中，且为了进一步稳定化本文所述的抗原结合构建体，HD37抗CD19抗体的野生型序列可被修饰以生成人源化VH和VL多肽序列。可对构架区和CDR两者进行修饰以获得将要用于抗原结合构建体的CD19结合scFv和Fab中的VH和VL多肽序列。在一些实施方案中，修饰为图2中所描绘的那些。在一些实施方案中，人源化抗CD19结合结构域的Tm比HD37结合结构域的Tm更高。在一些实施方案中，人源化抗CD19结合结构域的Tm比HD37结合结构域的Tm高至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少10℃。人源化的CD3VH和VL在一些实施方案中，且为了进一步稳定化本文所述的抗原结合构建体，OKT3抗CDS3抗体的野生型序列可被修饰以生成人源化VH和VL多肽序列。可对构架区和CDR两者进行修饰以获得将要用于抗原结合构建体的CD3结合scFv和Fab中的VH和VL多肽序列。在一些实施方案中，修饰为图4中所描绘的那些。在一些实施方案中，人源化抗CD19scFv结合结构域的Tm比OKT3或替利珠单抗结合结构域的Tm更高。在一些实施方案中，人源化抗CD19scFv结合结构域的Tm比OKT3或替利珠单抗结合结构域的Tm高至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少10℃。抗原结合多肽构建体--抗原本文所述的抗原结合构建体特异性地结合CD3抗原和第二靶抗原。如本文所用，术语“抗原决定簇”与“抗原”和“表位”同义并且是指抗原结合部分所结合的多肽大分子上的位点(例如，氨基酸的连续区段或由非连续氨基酸的不同区构成的构象组态)，由此形成抗原结合部分抗原复合物。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个，且更通常至少5或8-10个氨基酸。所述表位可包含直接参与结合的氨基酸残基及其它不直接参与结合的氨基酸残基，如通过特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换言之，所述氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。识别相同表位的抗体可在简单的免疫测定中被验证，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原结合的能力。“特异性地结合”、“特异性结合”或“选择性结合”意指针对抗原的结合是选择性的并且可与不需要的或非特异性相互作用相区分。抗原结合构建体结合至特异性抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员所熟知的其它技术来测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，GlycoJ17，323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，EndocrRes28，217-229(2002))。在一个实施方案中，如例如通过SPR所测量，抗原结合部分结合至不相关蛋白质的程度小于抗原结合构建体结合至抗原的约10％。在某些实施方案中，结合至抗原的抗原结合构建体或包含抗原结合部分的抗原结合分子具有以下解离常数(KD)：＜1μM、＜100nM、＜10nM、＜1nM、＜0.1nM、＜0.01nM、或＜0.001nM(例如，10～8M或更小，例如10～8M至10″13M，例如10″9M至10″13M)。“亲和力”是指分子(例如受体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指出，如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如，抗原结合部分与抗原、或受体与其配体)的成员之间的1∶1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(KD)表示，其为解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等价亲和力可包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可通过本领域中已知的良好确立的方法测量，包括本文所述的那些。测量亲和力的具体方法为表面等离子体共振(SPR)或用表达目标抗原的细胞进行的全细胞结合测定。“减少的结合”，例如，减少的与Fc受体的结合，是指如例如通过SPR所测量，对于相应的相互作用的亲和力的降低。为了清楚起见，该术语还包括亲和力降至零(或低于分析方法的检测极限)，即相互作用的完全消除。反之，“增加的结合”是指对于相应的相互作用的结合亲和力的提高。如本文所用的“活化的T细胞抗原”是指在T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞的表面上表达的抗原决定簇，所述抗原决定簇一旦与抗原结合分子相互作用便能够诱导T细胞活化。具体来说，抗原结合分子与活化的T细胞抗原的相互作用可通过触发T细胞受体复合物的信号传导级联来诱导T细胞活化。在一个具体实施方案中，活化的T细胞抗原为CD3。如本文所用的“T细胞活化”是指T淋巴细胞、特别是细胞毒性T淋巴细胞选自以下的一种或多种细胞反应：增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性及活化标记物的表达。本发明的T细胞活化的双特异性抗原结合分子能够诱导T细胞活化。测量T细胞活化的合适的测定是本文所述的领域中已知的。如本文所用的“靶细胞抗原”或“靶抗原”是指在靶细胞表面上呈递的抗原决定簇，例如肿瘤中的B细胞，如癌细胞或肿瘤基质细胞。肿瘤抗原为在肿瘤细胞上表达的靶细胞抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原可在肿瘤细胞上过度表达。如本文所用，关于抗原结合部分等的术语“第一”和“第二”当存在一个以上每一类型部分时是为了便于区分而使用。除非如此明确地阐述，这些术语的使用不意图为T细胞活化双特异性抗原结合分子赋予特定顺序或定向。如本文所用的术语“交叉物种结合”或“种间结合”或“物种交叉反应性”意指本文所述的结合结构域与人及其它生物体(例如但不限于非黑猩猩灵长类动物)中的相同靶分子的结合。因此，“交叉物种结合”或“种间结合”应理解为对在不同物种中表达的相同分子“X”(即同源物)而非对除“X”以外的分子的种间反应性。识别例如人CD3ε的单克隆抗体对非黑猩猩灵长类动物CD3ε(例如猕猴CD3ε)的交叉物种特异性可例如通过FACS分析来确定。FACS分析是以如下方式进行：就结合至人和非黑猩猩灵长类动物细胞(例如，分别表达所述人和非黑猩猩灵长类动物CD3ε抗原的猕猴细胞)来测试相应的单克隆抗体。适当的测定示于以下实施例中。以上主题可在作出必要修改后用于CD19。FACS分析是以如下方式进行：就结合至人和非黑猩猩灵长类动物细胞(例如，分别表达所述人和非黑猩猩灵长类动物CD3或CD19抗原的猕猴细胞)来测试相应的单克隆抗体。CD3本文所述的抗原结合构建体特异性地结合CD3抗原。如本文所述的“CD3”或“CD3复合物”为成熟T-淋巴细胞中的至少五种膜结合多肽彼此非共价地结合且与T细胞受体非共价结合的复合物。CD3复合物包括γ、δ、ε和ξ链(也称为亚基)。已经开发了针对其中一些链的非人单克隆抗体，如由鼠科抗体OKT3、SP34、UCHT1或64.1所例示。(参见，例如June等人，J.Immunol.136：3945-3952(1986)；Yang等人，J.Immunoi.137：1097-1100(1986)；及Hayward等人，Immunol.64：87-92(1988))。例如通过固定抗CD3抗体使CD3在T细胞上的成簇造成T细胞活化，这类似于T细胞受体的接合，但与其克隆典型的特异性无关。大多数抗CD3抗体识别CD3ε链。在一些实施方案中，抗CD3scFv或Fab为已知抗CD3抗体的scFV或Fab，或来源于，例如修饰形式的已知抗CD3抗体的scFv或Fab。针对提供用于本文所述的双特异性抗原结合构建体中的可变区(VH和VL)的人CD3的抗体在本领域中是已知的并且包括OKT3(ORTHOCLONE-OKT3TM(莫罗单抗-CD3)。另外的抗CD3抗体包括“OKT3阻断抗体”，其将OKT3与CD3抗原的ε亚基的结合阻断了50％或更多。实例包括但不限于TeplizumabTM(MGA031，EliLilly)；UCHT1(Pollard等人1987JHistochemCytochem.35(11)：1329-38)；N10401(WO2007/033230)；及维西珠单抗(US25834597)。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体包含单价且特异性地结合CD3抗原的CD3抗原结合多肽构建体，其中CD3抗原结合多肽构建体来源于OKT3(ORTHOCLONE-OKT3TM(莫罗单抗-CD3)。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体包含单价且特异性地结合CD3抗原的CD3抗原结合多肽构建体，所述CD3抗原结合多肽的VH和VL区来源于CD3ε特异性抗体OKT3。在一些实施方案中，对CD3的ε亚基有特异性的第一抗原结合多肽构建体的结合亲和力在约1nM至约100nM之间，或在约20nM至约100nM之间，或例如大于2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80或大于90nM。OKT3抗体所结合至的CD3ε亚基上的表位通过对结合至CD3ε的OKT3的晶体结构的分析来鉴别(Kjer-NielsenL.等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA101：7675-7680)。CD3ε的多肽序列提供于下表中。表B：CD3ε序列此结构的分析表明OKT3抗体的CDR(关于表B中的序列)在以下残基处接触人CD3ε：残基56-57(SE)、68-70(GDE)及101-107(RGSKPED)。这些残基中的结合热点以下划线标注。这些残基被视为OKT3所结合至的表位。因此，本文所述的抗原结合构建体可包含特异性地结合至此表位的抗原结合多肽构建体。本文提供了抗原结合构建体，其包含至少一种CD3结合多肽构建体，所述CD3结合多肽构建体结合至在至少一个表达CD3的细胞上的CD3复合物，其中表达CD3的细胞为T细胞。在某些实施方案中，表达CD3的细胞为人细胞。在一些实施方案中，表达CD3的细胞为非人、哺乳动物细胞。在一些实施方案中，T细胞为细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+或CD8+T细胞。在本文所提供的抗原结合构建体的某些实施方案中，构建体能够活化T细胞且将T细胞的细胞毒性活性重定向至靶细胞如B细胞。在一个具体实施方案中，所述重定向与通过靶细胞的MHC介导的肽抗原呈递和/或T细胞的特异性无关。靶抗原CD19B细胞抗原CD19(CD19，也称为B细胞表面抗原B4，Leu-12；UniprotID#P15391)为人全B细胞表面标记物，其是从前B细胞发育早期表达，直到终期分化到浆细胞中。CD19促进成熟B细胞的增殖和存活。其与细胞表面上的CD21结合成复合物。其还与CD81和Leu-13结合并强化B细胞受体(BCR)信号传导。与BCR一起，CD19调节内在和抗原受体诱导的信号传导阈值，该阈值对B细胞的克隆扩增和体液免疫很重要。与CD21合作，其联系适应性和先天性免疫系统。一旦活化，CD19的细胞质尾便被磷酸化，由此造成Src-家族激酶的结合和PT-3激酶的募集。其还在绝大多数非何杰金氏淋巴瘤(NHL)细胞以及一些白血病上表达。因为B细胞在调控免疫系统中的关键作用，所以B细胞的失调与多种病症有关。B细胞病症，在本文中也称为B细胞相关疾病，被分成过度或不受控制的增殖(淋巴瘤、白血病)、和B细胞发育/免疫球蛋白产生的缺陷(免疫缺陷)。CD19的氨基酸序列如下：MPPPRLLFFLLFLTPMEVRPEEPLVVKVEEGDNAVLQCLKGTSDGPTQQLTWSRESPLKPFLKLSLGLPGLGIHMRPLAIWLFIFNVSQQMGGFYLCQPGPPSEKAWQPGWTVNVEGSGELFRWNVSDLGGLGCGLKNRSSEGPSSPSGKLMSPKLYVWAKDRPEIWEGEPPCLPPRDSLNQSLSQDLTMAPGSTLWLSCGVPPDSVSRGPLSWTHVHPKGPKSLLSLELKDDRPARDMWVMETGLLLPRATAQDAGKYYCHRGNLTMSFHLEITARPVLWHWLLRTGGWKVSAVTLAYLIFCLCSLVGILHLQRALVLRRKRKRMTDPTRRFFKVTPPPGSGPQNQYGNVLSLPTPTSGLGRAQRWAAGLGGTAPSYGNPSSDVQADGALGSRSPPGVGPEEEEGEGYEEPDSEEDSEFYENDSNLGQDQLSQDGSGYENPEDEPLGPEDEDSFSNAESYENEDEELTQPVARTMDFLSPHGSAWDPSREATSLGSQSYEDMRGILYAAPQLRSIRGQPGPNHEEDADSYENMDNPDGPDPAWGGGGRMGTWSTR。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体包括结合至CD19抗原的抗原结合多肽构建体(抗CD19scFv或Fab)。在一些实施方案中，抗CD19scFv或Fab为已知抗CD19抗体的scFV或Fab，或来源于，例如修饰形式的已知抗CD19抗体的scFv或Fab。针对提供用于本文所述的双特异性抗原结合构建体中的可变区(VH和VL)的CD19的抗体在本领域中是已知的并且包括HD37，由HD37杂交瘤提供(Pezzutto(1997)，J.Immunol.138，2793-9)。另外的抗CD19抗体包括“HD37阻断抗体”，其将HD37与CD19抗原的结合阻断了50％或更多。实例包括但不限于HD237(IgG2b)(FourthInternationalWorkshoponHumanLeukocyteDifferentiationAntigens.Vienna，Austria，1989；及Pezzutto等人，J.Immunol.，138(9)：2793-2799(1987))；4G7(Meecker(1984)Hybridoma3，305-20)；B4(Freedman(1987)Blood70，418-27)；B43(Bejcek(1995)CancerRes.55，2346-51)及Mor-208(Hammer(2012)Mabs4：5，571-577)。在一个实施方案中，所述VH(CD19)和VL(CD19)区(或其部分，像CDR)来源于抗CD19抗体HD37，由HD37杂交瘤提供(Pezzutto(1997)，J.Immunol.138，2793-9)。在一些实施方案中，第二抗原结合多肽构建体对靶抗原的结合亲和力在约0.1nM至约10nM之间或小于5.0、4.0、3.0、2.0、1.0、0.9、.09、0.9、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或小于0.2nM。在一些实施方案中，如通过FACS分析所测量，第二抗原结合多肽构建体对CD19+靶细胞表面上的CD19的结合亲和力在以下范围内：0.1至0.5、0.5-1、1-3、3-5、5-7、7-9、9-11、11-13、13-15、15-17、17-19或19-21nM。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体为结合B细胞上的CD19的scFv或Fab构建体。在一些实施方案中，scFv或Fab构建体为哺乳动物。在一个实施方案中，所述scFv或Fab构建体为人的。在另一实施方案中，所述scFv或Fab构建体为人源化的。在又一实施方案中，所述scFv或Fab构建体包含人重链和轻链可变区中的至少一个。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体展现与B细胞表面上表达的至少一个抗原交叉物种结合。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体结合至哺乳动物CD19中的至少一个。在某些实施方案中，CD19抗原结合多肽构建体结合人CD19。CDH3在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体可具有针对CDH3的抗原结合多肽构建体。CDH3，也称为CADH3；钙粘蛋白3，1型或P-钙粘蛋白(UniprotID#P22223)为细胞粘连蛋白的钙粘蛋白家族的一个成员，其在细胞-细胞粘附中以同嗜性方式优先自身相互作用。CDH3过度表达与几种类型的癌症有关。在一些实施方案中，表KK中的抗CDH3抗体被用于获得对CDH3有特异性的抗原结合多肽构建体。表KKHER2、HER3和EGFRHER2、HER3和EGFR为HER受体。“HER受体”为属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白酪氨酸激酶并且包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含细胞外结构域，其可结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守的细胞内酪氨酸激酶结构域；及羧基端信号结构域，其含有若干可被磷酸化的酪氨酸残基。HER2、HER3和EGFR在许多类型的癌症中过度表达。在一些实施方案中，表KK中的抗HER2、抗HER3和抗EGFR抗体被用于获得抗原结合多肽构建体。其它靶抗原在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体包含第二抗原结合多肽构建体，所述第二抗原结合多肽构建体对表LL中所提供的靶抗原中的一个有特异性。在一些实施方案中，靶抗原为源自病原体的抗原。在一个实施方案中，靶抗原为病毒抗原。在一些实施方案中，靶抗原为真菌抗原。在一些实施方案中，靶抗原为细菌。在一些实施方案中，靶抗原为寄生虫抗原。在一些实施方案中，靶抗原与血液癌有关。在一些实施方案中，靶抗原在实体肿瘤上表达。在一些实施方案中，靶抗原与自身免疫疾病有关。表LL靶抗原支架在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体包含支架。支架可为肽、多肽、聚合物、纳米颗粒或其它化学实体。在其中支架为Fc或二聚Fc的实施方案中，抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体可连接到支架的N或C末端。二聚Fc可为同二聚或异二聚的。在其中支架为肽或多肽的实施方案中，抗原结合构建体或抗原结合多肽构建体可通过有或没有多肽接头的基因融合连接到支架上。在其中支架为聚合物或纳米颗粒的其它实施方案中，抗原结合构建体可通过化学缀合连接到支架上。在一些实施方案中，支架为白蛋白多肽或分裂白蛋白多肽。分裂白蛋白多肽作为抗原结合多肽构建体的支架的用途充分描述于PCT/CA2012/050131、PCT/US2013/050408及PCT/US2013/050411中，所有专利据此以引用的方式整体并入。抗原结合构建体的Fc。Fc多肽产生用于抗原结合多肽构建体的优秀支架。本文所述的某些抗原结合构建体包含Fc，例如二聚Fc。在一些实施方案中，Fc是包含第一和第二Fc多肽的异二聚Fc，所述第一和第二Fc多肽各自包含修饰的CH3序列，其中每个修饰的CH3序列包含促进异二聚Fc形成的不对称氨基酸修饰和具有约68℃或更高的解链温度(Tm)的二聚CH3结构域，且其中第一Fc多肽以第一铰链接头与第一抗原结合多肽构建体连接，且第二Fc多肽以第二铰链接头与第二抗原结合多肽构建体连接。术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有规定，Fc区或恒定区中的氨基酸残基编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，MD，1991中所述。如本文所用的二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两种多肽中的一种，即包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区、能够稳定自缔合的多肽。例如，二聚IgGFc的Fc多肽包含IgGCH2和IgGCH3恒定结构域序列。Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列，每个来自二聚Fc的两种Fc多肽中的每种。CH2结构域包含两个CH2序列，每个来自二聚Fc的两种Fc多肽中的每种。在一些方面中，Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面中，Fc用或不用一个或多个接头偶联至第一抗原结合构建体和/或第二抗原结合构建体。在一些方面中，Fc是人Fc。在一些方面中，Fc是人IgG或IgG1Fc。在一些方面中，Fc是异二聚Fc。在一些方面中，Fc包含至少一个或两个CH2序列。在一些方面中，Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面中，Fc在CH2序列的至少一个中包含一个或多个修饰。在一些方面中，Fc为单个多肽。在一些方面中，Fc为多种肽，例如两种多肽。在一些方面中，Fc是在2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780中所述的Fc，其各自的全部公开内容出于所有目的据此以引用的方式整体并入。修饰的CH3结构域在一些方面中，本文所述的抗原结合构建体包含异二聚Fc，所述异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域已被不对称地修饰。异二聚Fc可包含两个重链恒定结构域多肽：第一Fc多肽和第二Fc多肽，其可互换地使用，条件是Fc包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。一般说来，第一Fc多肽包含第一CH3序列且第二Fc多肽包含第二CH3序列。包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列当所述两个CH3序列二聚时通常产生异二聚Fc，而非同二聚体。如本文所用，“不对称氨基酸修饰”是指其中在第一CH3序列的特定位置处的氨基酸不同于在第二CH3序列的相同位置处的氨基酸的任何修饰，且第一和第二CH3序列优先配对以形成异二聚体，而非同二聚体。此异二聚化可为以下的结果：在每个序列的相同的相应氨基酸位置处的两个氨基酸中仅一个的修饰；或在第一和第二CH3序列各自相同的相应位置处的每个序列上的两个氨基酸的修饰。异二聚Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或一个以上不对称氨基酸修饰。表C提供人IgG1Fc序列的氨基酸序列，对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。氨基酸231-238也被称为下铰链。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。Fc通常可包含能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。关于本文所述的抗原结合构建体，在一些实施方案中，第一scFv与异二聚Fc的链A连接且第二scFv与异二聚Fc的链B连接。在一些实施方案中，第二scFv与异二聚Fc的链A连接且第一scFv与异二聚Fc的链B连接。在一些方面中，Fc的一个或两个序列包含在以下位置处的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号。在一些方面中，Fc包含表X中所示的突变序列。在一些方面中，Fc包含变体1A-B的突变。在一些方面中，Fc包含变体2A-B的突变。在一些方面中，Fc包含变体3A-B的突变。在一些方面中，Fc包含变体4A-B的突变。在一些方面中，Fc包含变体5A-B的突变。表C：IgG1Fc序列和变体第一和第二CH3序列可包含如本文所述的氨基酸突变，参考全长人IgG1重链的氨基酸231至447。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有在位置F405和Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：拥有一个或多个选自L351Y、F405A及Y407V的氨基酸修饰的第一CH3序列和拥有一个或多个选自T366L、T366I、K392L、K392M及T394W的氨基酸修饰的第二CH3序列。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：在位置L351、F405及Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392及T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列，并且第一或第二CH3序列中的一个进一步包含在位置Q347处的氨基酸修饰，且另一个CH3序列进一步包含在位置K360处的氨基酸修饰。在另一实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：在位置L351、F405及Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392及T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列，第一或第二CH3序列中的一个进一步包含在位置Q347处的氨基酸修饰，且另一个CH3序列进一步包含在位置K360处的氨基酸修饰，且所述CH3序列中的一个或两个进一步包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：在位置L351、F405及Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392及T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列，并且所述第一和第二CH3序列中的一个进一步包含D399R或D399K的氨基酸修饰，且另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E及K392D中的一个或多个。在另一实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：在位置L351、F405及Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392及T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列，所述第一和第二CH3序列中的一个进一步包含D399R或D399K的氨基酸修饰，且另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E及K392D中的一个或多个，且所述CH3序列中的一个或两个进一步包含氨基酸修饰T350V。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域具有：在位置L351、F405及Y407处具有氨基酸修饰的第一CH3序列和在位置T366、K392及T394处具有氨基酸修饰的第二CH3序列，其中所述CH3序列中的一个或两个进一步包含T350V的氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚Fc包含修饰的CH3结构域，该结构域包含以下氨基酸修饰，其中“A”表示对第一CH3序列的氨基酸修饰，且“B”表示对第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407V；B：T366L_K392M_T394W；A：L351Y_F405A_Y407V；B：T366L_K392L_T394W；A：T350V_L351Y_F405A_Y407V；B：T350V_T366L_K392L_T394W；A：T350V_L351Y_F405A_Y407V；B：T350V_T366L_K392M_T394W；A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V；和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。所述一个或多个不对称氨基酸修饰可促进异二聚Fc的形成，其中异二聚CH3结构域具有与野生型同二聚CH3结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚Fc结构域的形成，其中异二聚Fc结构域具有与野生型同二聚Fc结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚Fc结构域的形成，其中异二聚Fc结构域具有经由差示扫描量热研究中的解链温度(Tm)观察到的稳定性，且其中解链温度在针对相应的对称野生型同二聚Fc结构域所观察到的4℃范围内。在一些方面中，Fc在CH3序列的至少一个中包含一个或多个修饰，所述修饰促进具有与野生型同二聚Fc相当的稳定性的异二聚Fc的形成。在一个实施方案中，CH3结构域的稳定性可通过测量CH3结构域的解链温度，例如通过差示扫描量热法(DSC)来测量。因此，在又一实施方案中，CH3结构域具有约68℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约70℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约72℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约73℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约75℃或更高的解链温度。在另一实施方案中，CH3结构域具有约78℃或更高的解链温度。在一些方面中，二聚CH3序列具有以下解链温度(Tm)：约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高。在一些实施方案中，包含修饰的CH3序列的异二聚Fc可以与表达产物中的同二聚Fc相比至少约75％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约80％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约85％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约90％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约95％的纯度形成。在另一实施方案中，异二聚Fc以大于约97％的纯度形成。在一些方面中，Fc为当表达时以大于以下的纯度形成的异二聚体：约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。在一些方面中，Fc为当经由单个细胞表达时以大于以下的纯度形成的异二聚体：约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。修饰单体Fc多肽以促进异二聚Fc形成的另外方法在本领域中是已知的。例如，参见国际专利公布号WO96/027011(knobsintoholes)；Gunasekaran等人(GunasekaranK.等人(2010)JBiolChem.285，19637-46，electrostaticdesigntoachieveselectiveheterodimerization)；Davis等人(Davis，JH.等人(2010)ProtEngDesSel；23(4)：195-202，strandexchangeengineereddomain(SEED)technology)；及Labrijn等人[Efficientgenerationofstablebi-specificIgG1bycontrolledFab-armexchange.LabrijnAF，MeestersJI，deGoeijBE，vandenBremerET，NeijssenJ，vanKampenMD，StrumaneK，VerploegenS，KunduA，GramerMJ，vanBerkelPH，vandeWinkelJG，SchuurmanJ，ParrenPW.ProcNatlAcadSciUSA.2013Mar26；110(13)：5145-50。CH2结构域如上所指出，在一些实施方案中，抗原结合构建体的Fc除CH3结构域之外还包含CH2结构域。举例来说，IgG1Fc的CH2结构域的氨基酸序列被鉴别为表A中所示序列的氨基酸239-340。Fc的CH2结构域结合至Fc受体和补体且因此参与介导效应细胞功能。术语“Fc受体”和“FcR”是用于描述结合至抗体的Fc区的受体，并且包括Fcγ受体(FcγR)和新生受体FcRn。一般说来，FcγR为结合IgG抗体的受体(γ受体)并且包括人中的FcγRI、FcγRII及FcγRIII亚类的受体，包括等位基因变体及这些受体的选择性剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有区别主要在于其细胞质结构域的类似氨基酸序列。其它同种型的免疫球蛋白也可被某些FcR结合(参见，例如Janeway等人，ImmunoBiology：theimmunesysteminhealthanddisease，(ElsevierScienceLtd.，NY)(第4版，1999))。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(在Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997)中有所综述)。FcR在以下文献中有所综述：Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol9：457-92(1991)；Capel等人，Immunomethods4：25-34(1994)；及deHaas等人，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。其它FcγR(包括未来将要鉴别的那些)由本文中的术语“FcR”所涵盖。FcyR还见于其它生物体中，包括但不限于小鼠、大鼠、兔及猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)及FcγRIII-2(CD16-2)。FcγR是由效应细胞如NK细胞或B细胞所表达。补体激活需要补体蛋白C1q与抗原抗体复合物的结合。Fc的CH2结构域中的残基参与了C1q与Fc之间的相互作用。本文所述的一些抗原结合构建体能够结合FcRn。如本领域中已知，与FcRn的结合将内吞抗体从核内体再循环回到血流中(Raghavan等人，1996，AnnuRevCellDevBiol12：181-220；Ghetie等人，2000，AnnuRevImmunol18：739-766)。此过程与由全长分子的大尺寸所致的肾过滤的排除一起产生在1至3周范围内的有利的抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合还在抗体转运中发挥关键作用。FcRn造成母体IgG转移至胎儿(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)；及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。FcRn与IgG的结合涉及Fc的CH2和CH3结构域中的残基。CH2结构域中的修饰可影响FcR与Fc的结合。如上所指出，Fc的CH2结构域包含两个CH2序列，各自在二聚Fc的两种Fc多肽的每个上。通常，对CH2结构域的修饰是对称的且因此在Fc多肽的两个CH2序列上是相同的。然而，不对称突变在CH3结构域上增强异二聚化的突变存在下也是可能的。在一个实施方案中，CH2结构域包含减少FcγR或C1q结合和/或效应功能的修饰。降低效应功能的修饰：减少FcγR和/或补体结合和/或效应功能的Fc修饰在本领域中是已知的。近期出版物描述了已用于工程化具有降低或沉默的效应物活性的抗体的策略(参见Strohl，WR(2009)，CurrOpinBiotech20：685-691及Strohl，WR和StrohlLM，“AntibodyFcengineeringforoptimalantibodyperformance”InTherapeuticAntibodyEngineering，Cambridge：WoodheadPublishing(2012)，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化的修饰、IgG2/IgG4支架的使用或在Fc的铰链或CH2区中引入突变来降低效应功能。例如，美国专利公布号201I/0212087(Strohl)、国际专利公布号WO2006/105338(Xencor)、美国专利公布号2012/0225058(Xencor)、美国专利公布号2012/0251531(Genentech)及Strop等人((2012)J.M0l.Bi0l.420：204-219)描述了减少FcγR或补体结合至Fc的特异性修饰。减少FcγR或补体结合至Fc的已知对称氨基酸修饰的具体非限制性实例包括下表中所鉴别的那些：表D：减少FcγR或补体结合至Fc的修饰公司突变GSKN297AOrthoBiotechL234A/L235AProteinDesignlabsIGG2V234A/G237AWellcomeLabsIGG4L235A/G237A/E318AGSKIGG4S228P/L236EAlexionIGG2/IgG4组合MerckIGG2H268Q/V309L/A330S/A331SBristol-MyersC220S/C226S/C229S/P238SSeattleGeneticsC226S/C229S/E3233P/L235V/L235AAmgen大肠杆菌产生、非糖基化MedimuneL234F/L235E/P331STrubion铰链突变，可能为C226S/P230S在一个实施方案中，Fc包含上表中所鉴别的至少一个氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中的至少一个的氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc包含在L234、L235及D265处的氨基酸修饰。在另一实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A及D265S。在一些实施方案中，Fc包含在Fc的下绞链区中的一个或多个不对称氨基酸修饰，如国际专利申请号PCT/CA2014/050507中所述。减少FcγR结合的这种不对称氨基酸修饰的实例示于表E中：表E：减少FcγR结合的不对称突变链A链BL234D/L235EL234K/L235KE233A/L234D/L235EE233A/L234R/L235RL234D/L235EE233K/L234R/L235RE233A/L234K/L235AE233K/L234A/L235K铰链接头在本文所述的抗原结合构建体中，第一Fc多肽以第一铰链接头与第一抗原结合多肽构建体连接，且第二Fc多肽以第二铰链接头与第二抗原结合多肽构建体连接。铰链接头序列的实例为本领域技术人员熟知且可用于本文所述的抗原结合构建体中。或者，可使用修饰形式的已知铰链接头。铰链接头多肽被选出以便它们维持或优化抗原结合构建体的功能活性。合适的接头多肽包括IgG绞链区，例如像来自IgG1、IgG2或IgG4的那些，包括上铰链序列和核心铰链序列。对应于上铰链序列和核心铰链序列的氨基酸残基根据IgG类型而变化，如本领域中已知且本领域技术人员将能够容易鉴别对于给定IgG类型的这种序列。也可使用修饰形式的这些示例性接头。例如，提高IgG4铰链的稳定性的修饰在本领域中是已知的(参见，例如Labrijn等人(2009)NatureBiotechnology27，767-771)。铰链接头序列的实例见于下表中。在一些实施方案中，本文所述的药物缀合的抗原结合构建体具有针对绞链区的修饰以改进或优化构建体的效力。表F：铰链接头多肽序列(SEQIDNO：)解离常数(KD)和最大结合(Bmax)在一些实施方案中，抗原结合构建体是由包括但不限于解离常数和最大结合的功能特征来描述。如本文所用的术语“解离常数(KD)”意图表示特定的配体-蛋白质相互作用的平衡解离常数。如本文所用，配体-蛋白质相互作用指的是但不限于蛋白质-蛋白质相互作用或抗体-抗原相互作用。KD量度两种蛋白质(例如AB)可逆地解离成较小组分(A+B)的倾向，且被定义为解离速率(也称为“解离速率(koff)”)与缔合速率或“缔合速率(k。n)”的比率。因此，KD等于koff/kon且表示为摩尔浓度(M)。由此可见，KD越小，结合亲和力越强。因此，1mM的KD表示与1nM的KD相比的弱结合亲和力。可使用在本领域中广为接受的方法测定抗原结合构建体的KD值。测定抗原结合构建体的KD的一种方法是通过使用表面等离子体共振(SPR)，通常使用生物传感器系统，如系统。等温滴定量热法(ITC)是可用于测定另一种方法。术语“Bmax”或最大结合是指在饱和浓度的抗原结合构建体下细胞上的最大抗原结合构建体结合水平。此参数可以任意单位MFI报道以用于相对比较，或借助于标准曲线转化为对应于结合至细胞的抗原结合构建体的数目的绝对值。抗原结合构建体的结合特征可通过各种技术测定。其中一种是通过流式细胞术(FACS，荧光激活细胞分选法)测量与表达抗原的靶细胞的结合。通常，在这样一个实验中，将表达目标抗原的靶细胞与抗原结合构建体在不同浓度下孵育，洗涤，与用于检测抗原结合构建体的第二试剂孵育，洗涤，且在流式细胞仪中分析以测量表示对细胞的检测信号的强度的中值荧光强度(MFI)，其又与结合至细胞的抗原结合构建体的数目有关。然后将对比MFI数据的抗原结合构建体浓度拟合至饱和结合方程式中以产生两个关键结合参数，即Bmax和表观KD。表观KD或表观平衡解离常数表示观察到一半最大细胞结合的抗原结合构建体浓度。显然，KD值越小，达到最大细胞结合所需的抗原结合构建体浓度越低，且因此抗原结合构建体的亲和力越高。表观KD取决于细胞结合实验的条件，如在细胞上表达的不同受体水平及孵育条件，且因此，表观KD一般不同于由无细胞的分子实验如SPR和ITC所测得的KD值。然而，在不同方法之间通常存在良好一致性。在本文所述的药物缀合的抗原结合构建体的一些实施方案中，一种抗原结合多肽构建体对其同源抗原具有比另一种更高的亲和力。在药物缀合的抗原结合构建体的大多数实施方案中，第一抗原结合多肽构建体对靶抗原对CD3比第二抗原结合多肽构建体对靶抗原具有更低的亲和力。在一些实施方案中，如通过SPR所测量，所述构建体对CD3抗原的亲和力比对靶抗原的亲和力低至少2、至少5、至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100倍；和/或如通过FACS所测量，对带有靶抗原的靶细胞具有小于10nM的亲和力且对T细胞具有在10nM-500nM范围内的亲和力。在许多实施方案中，对CD3的亲和力对比靶抗原的亲和力要低。在CD3-CD19药物缀合的抗原结合构建体的一个实施方案中，对CD3的亲和力比对CD19的亲和力要低。在其它实施方案中，对CD3的亲和力比对CD19的亲和力低至少2、5、10、15或20倍。在一个具体的实施方案中，CD3-CD19药物缀合的抗原结合构建体的亲和力对CD19为2nM且对CD3为30nM。亲和力可通过SPR来测定。在一些实施方案中，第二抗原结合多肽构建体对B细胞上表达的CD19抗原的亲和力在约0.5-1、1-3、3-5、5-7、7-9、9-11、11-13、13-15、15-17、17-19或19-21nM范围内，且所述第一抗原结合多肽构建体对T细胞上表达的CD3的亲和力在约5-10、10-15、15-20、20-15、25-30、30-35、35-40、40-50、50-55、55-60、60-70、70-80、80-90或90-100nm范围内，如通过FACS分析所测定。制备抗原结合构建体的方法本文所述的抗原结合构建体可使用重组方法和组合物产生，例如如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供一种编码本文所述的抗原结合构建体的分离的核酸。这种核酸可编码包含抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和/或包含抗原结合构建体的VH的氨基酸序列(例如，抗原结合构建体的轻链和/或重链)。在又一实施方案中，提供一种或多种包含所述核酸的载体(例如表达载体)。在一个实施方案中，所述核酸提供于多顺反子载体中。在又一实施方案中，提供包含所述核酸的宿主细胞。在一个这类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已用以下转化)：(1)包含核酸的载体，所述核酸编码包含抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列，或(2)包含核酸的第一载体，所述核酸编码包含抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列，和包含核酸的第二载体，所述核酸编码包含抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列。在一个实施方案中，宿主细胞为真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供一种制造抗原结合构建体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗原结合构建体的条件下培养如上所提供的包含编码抗原结合构建体的核酸的宿主细胞，且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗原结合构建体。对于抗原结合构建体的重组产生，分离编码抗原结合构建体的核酸(例如，如上所述)并且将其插入一种或多种载体中以用于在宿主细胞中的进一步克隆和/或表达。这类核酸可易于使用常规方法(例如，通过使用能够特异性地结合至编码抗原结合构建体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)分离和测序。用于克隆或表达编码抗原结合构建体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包含外源性多核苷酸的细胞，不考虑用于插入的方法，例如直接摄取、转导、f-接合或本领域中已知产生重组宿主细胞的其它方法。外源性多核苷酸可维持为非整合的载体，例如质粒，或者可以被整合到宿主基因组中。如本文所用，术语“真核生物”是指在系统进化树内属于真核生物域的生物体，如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬虫、鸟等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。举例来说，非真核生物体可在系统进化树内属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、荧光极毛杆菌、绿脓假单胞菌、恶臭极毛杆菌等)域、或古细菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、盐杆菌属如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和盐杆菌物种NRC-1、闪烁古生球菌、强烈火球菌、超嗜热古菌、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrumpemix)等)域。例如，抗原结合构建体可在细菌中产生，特别是当不需要糖基化和Fc效应功能时。关于抗原结合构建体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523(也参见Charlton，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，N.J.，2003)，第245-254页，描述了抗体片段在大肠杆菌中的表达)。表达之后，可将抗原结合构建体以可溶级分从细菌细胞浆中分离并可进一步纯化。除原核生物之外，真核微生物如丝状真菌或酵母也是适合于编码抗原结合构建体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已被“人源化”，从而产生具有部分或全人糖基化模式的抗原结合构建体的真菌和酵母菌株。参见，Gemgross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。适用于表达糖基化抗原结合构建体的宿主细胞还来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴别了许多杆状病毒毒株，其可联合昆虫细胞使用，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7，125,978及6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可为有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(293或293细胞，如例如在Graham等人，J.GenVirol.36：59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠足细胞(TM4细胞，如例如在Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；法布罗大鼠肝细胞(BRL3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(HepG2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC5细胞；以及FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适合于产生抗原结合构建体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见，例如Yazaki和Wu，MethodsinMolecularBiology，第248卷(B.K.C.Lo编著，HumanaPress，Totowa，N.J.)，第255-268页(2003)。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合构建体通过包括以下步骤的方法在稳定的哺乳动物细胞中产生：用编码抗原结合构建体的核酸以预定比率转染至少一种稳定的哺乳动物细胞；及在至少一种哺乳动物细胞中表达核酸。在一些实施方案中，在瞬时转染实验中测定核酸的预定比率以确定在表达产物中产生最高百分比的抗原结合构建体的输入核酸的相对比率。如果需要的话，可在表达之后纯化或分离抗原结合构建体。蛋白质可以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化。标准纯化方法包括色谱技术，包括离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、尺寸或凝胶过滤色谱及逆相色谱，使用如FPLC和HPLC的系统在大气压或高压下进行。纯化方法还包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。联合蛋白质浓度的超滤和渗滤技术也是有用的。如本领域中公知的，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，且这些蛋白质可在本发明中应用于纯化抗原结合构建体。例如，细菌蛋白A和G结合至Fc区。同样，细菌蛋白L结合至一些抗体的Fab区。纯化常常可由特定的融合配偶体实现。例如，如果采用GST融合物，那么抗体可使用谷胱甘肽树脂来纯化；如果采用His标签，那么使用Ni+2亲和色谱法；或者如果采用flag标签，那么使用固定的抗flag抗体。关于合适的纯化技术中的一般指导，参见，例如ProteinPurification：PrinciplesandPractice，第3版，Scopes，Springer-Verlag，NY，1994，其以引用的方式全部并入。必需的纯化度将根据抗原结合构建体的使用而变化。在一些情况下，无需纯化。在某些实施方案中，使用包括但不限于以下的阴离子交换色谱法纯化抗原结合构建体：在Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、porosHQ、porosDEAF、ToyopearlQ、ToyopearlQAE、ToyopearlDEAE、Resource/SourceQ和DEAE、FractogelQ和DEAE柱上的色谱。在具体的实施方案中，使用包括但不限于以下的阳离子交换色谱法纯化本文所述的蛋白质：SP-琼脂糖、CM琼脂糖、porosHS、porosCM、ToyopearlSP、ToyopearlCM、Resource/SourceS和CM、FractogelS和CM柱及它们的等效物和可比物。另外，本文所述的抗原结合构建体可使用本领域中已知的技术化学合成(例如，参见Creighton，1983，Proteins：StructuresandMolecularPrinciples，W.H.Freeman&Co.，N.Y及Hunkapiller等人，Nature，310：105-111(1984))。例如，对应于多肽片段的多肽可通过利用肽合成仪来合成。此外，如果需要的话，可将非典型氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入到多肽序列中。非典型氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D异构体、2，4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、-丙氨酸、氟代氨基酸、设计者氨基酸如I-甲基氨基酸、CI-甲基氨基酸、N-甲基氨基酸及一般氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋)或L(左旋)。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体为基本上纯化的。术语“基本上纯化的”是指可大体上或基本上不含通常伴随或与其天然存在的环境(即天然细胞、或在重组产生的抗原结合构建体的情况下为宿主细胞)中所见的蛋白质相互作用的组分的本文所述的构建体或其变体，在某些实施方案中，基本上不含包含具有以下污染蛋白的蛋白质制剂的细胞物质：小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)。当抗原结合构建体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更小百分比存在。当抗原结合构建体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质在培养基中以如下浓度存在：细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L、或约1mg/L或更小。在某些实施方案中，通过本文所述的方法产生的“基本上纯化的”抗原结合构建体具有以下纯度水平：至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％；具体地，至少约75％、80％、85％的纯度水平；且更具体地，至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或更高的纯度水平，如通过适当的方法如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC及毛细管电泳所测定。翻译后修饰：在某些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体在翻译期间或之后被差异性修饰。如本文所用的术语“修饰的”是指对给定多肽做出的任何改变，如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变、共翻译修饰或多肽的翻译后修饰。术语“(修饰的)”形式意指所论述的多肽任选被修饰，亦即，讨论中的多肽可被修饰或未被修饰。术语“翻译后修饰”是指天然或非天然氨基酸在掺入到多肽链中之后在这样一个氨基酸上发生的任何修饰。术语包括(仅举例来说)共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(如在无细胞的翻译系统中)、翻译后体内修饰及翻译后体外修饰。在一些实施方案中，修饰为以下至少一种：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/封端基团的衍生化、蛋白水解裂解及键合至抗体分子或抗原结合构建体或其它细胞配体。在一些实施方案中，抗原结合构建体通过包括但不限于以下的已知技术被化学修饰：通过溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特定化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；以及在衣霉素存在下的代谢合成。本文所述的抗原结合构建体的另外的翻译后修饰包括例如N-连接或O-连接的碳水化合物链、N末端或C末端的加工)、化学部分与氨基酸主链的连接、N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰、以及由原核宿主细胞表达造成的N末端甲硫氨酸残基的添加或缺失。将本文所述的抗原结合构建体用可检测的标记修饰，如酶促、荧光、同位素或亲和标记以允许蛋白质的检测和分离。在某些实施方案中，合适的酶标记的实例包括辣根过氧化酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素及水母发光蛋白；且合适的放射性材料的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体连接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体通过天然过程如翻译后加工或通过本领域中公知的化学修饰技术来修饰。在某些实施方案中，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的若干位点处。在某些实施方案中，来自本文所述的抗原结合构建体的多肽被支化，例如作为泛素化的结果，且在一些实施方案中，为环状，有或没有分支。环状、分支及分支环状多肽是翻译后天然加工的结果或可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、亚铁血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、消旋、硒基化、硫酸化、转运RNA介导的氨基酸向蛋白的添加，如精氨酰化和泛素化。(参见，例如PROTEINS--STRUCTUREANDMOLECULARPROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.FreemanandCompany，NewYork(1993)；POST-TRANSLATIONALCOVALENTMODIFICATIONOFPROTEINS，B.C.Johnson编著，AcademicPress，NewYork，第1-12页(1983)；Seifter等人，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)；Rattan等人，Ann.N.Y..Acad.Sci.663：48-62(1992))。在某些实施方案中，本文所描述的抗原结合构建体连接至固体支持体，所述固体支持体特别适用于通过本文所述的蛋白质结合、与本文所述的蛋白质结合或缔合的多肽的免疫测定或纯化。这类固体支持物包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。药物缀合的抗原结合构建体的功能活性及测量功能的测定可使用本领域中已知的常规修饰测定以及本文所述的测定就功能活性(例如生物活性)对本文所述的抗原结合构建体进行分析。测试本文所述的抗原结合构建体和药物缀合的抗原结合构建体的生物活性的方法可通过实施例中所述的各种测定来测量。这类方法包括测量带有靶抗原的靶细胞的T细胞介导杀伤的体外测定，所述靶抗原特异性地结合第二抗原结合多肽构建体。例如，带有相关靶抗原的靶细胞的杀伤可在包含人全血、PBMC或其中已除去B细胞的PBMC(在本文中称为“PBMC-B”)作为效应T细胞来源的培养物中测量。这类测定也可使用纯化的T细胞培养物进行。这种类型的测定检测带有靶抗原的靶细胞的T细胞介导的杀伤及通过靶细胞内化药物缀合构建体而发生的任何杀伤。因此，在本文所述的一些实施方案中，观察到药物缀合的抗原结合构建体如抗CD3-CD19、CD3-CDH3、CD3-HER2、CD3-HER3或CD3-EGFR对带有靶抗原的靶细胞的杀伤效力比参照非缀合构建体更高。在一些实施方案中，本文所述的药物缀合的抗原结合构建体与具有相同CDR和结合亲和力的参照非缀合抗原结合构建体相比展示增强的Raji或Ramos肿瘤B细胞杀伤。药物缀合的抗原结合构建体的直接细胞毒性可通过将构建体与带有第二抗原结合多肽构建体所针对的靶抗原的靶细胞一起培养来测定。在本文所述的一些实施方案中，靶抗原为CD19、HER2、HER3、EGFR或CDH3，且细胞毒性通过将构建体与带有相关靶抗原的靶细胞一起培养来测定，例如如实施例22中所述。在此类测定中，有可能评价在任何T细胞介导的杀伤不存在下细胞杀伤是否是藉助于药物的内化。药物缀合的抗原结合构建体对T细胞的影响可以若干方式测量。构建体的T细胞内化可通过以下操作来测量：将染料或其它可检测的试剂偶联至构建体并将其与T细胞一起培养并且监测积聚在T细胞中的染料的量，例如如实施例21中所述，其中使用JurkatT细胞。这可在与构建体在带有靶抗原的靶细胞中的内化相同的实验中比较。在本文所述的一些实施方案中，药物缀合构建体在T细胞中的内化比在带有靶抗原的靶细胞中的内化要低。在一些实施方案中，T细胞中的内化比带有靶抗原的靶细胞中的内化低至少10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。在一些实施方案中，T细胞为Jurkat细胞。在一些实施方案中，靶抗原为EGFR且构建体在靶细胞中的内化比T细胞中高至少10-50倍。在一些实施方案中，靶抗原为EGFR且构建体在靶细胞中的内化比JurkatT细胞中高至少10-50倍。在一些实施方案中，靶抗原为CDH3且构建体在靶细胞中的内化比JurkatT细胞中高至少10-50倍。在一些实施方案中，靶抗原为CD19且构建体在靶细胞中的内化比JurkatT细胞中高至少10-50倍。药物缀合的抗原结合构建体对T细胞的影响还可通过以下操作来评价：将来自人血(PBMC)的T细胞与构建体在有或没有带有靶抗原的靶细胞下培养，并使用FACS分析培养物中生成的T细胞亚群以检测T细胞表面标记物PD1、CD4、CD8、CD25、CD69及CD45。在一些实施方案中，该测定如实施例14、15或16中一样进行。在一些实施方案中，所述构建体不增加抑制性PD1+细胞的数量。在一些实施方案中，抗CD3-CD19药物缀合物造成与博纳吐单抗相比抑制性(PD-1+)T细胞的更少活化。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体展示以高效力杀伤Raji或Ramos肿瘤B细胞，且以低效力杀伤Jurkat肿瘤T细胞。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体的效力对B细胞比对T细胞高至少1.5、2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50倍或更多倍。在一个特定实施方案中，CD3-CD19抗原结合构建体对RamosB细胞的效力为约0.5nM，且对T细胞的效力为约23nM。在一些实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少2倍。在另一实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少4倍。在另一实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少6倍。在另一实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少8倍。在另一实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少10倍。在另一实施方案中，对靶细胞的效力比对T细胞高至少15倍。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体具有可裂解的接头且在测定中与具有不可裂解的接头的参照构建体或不缀合至药物的参照构建体相比不减少T细胞的数量。药物缀合的抗原结合构建体对T细胞的影响也可在体内评估，如实施例18和19中所进行。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体当以在0.1mg/kg至3.0mg/kg范围内的剂量施用时不减少人源化NSG小鼠中的循环T细胞的数量或脾T细胞的数量。在一些实施方案中，所测试的构建体是抗CD3-CD19药物缀合物。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体在5天期间内基本上不影响人源化NSG小鼠的外周血中的CD45+/CD8+T细胞水平。在一些实施方案中，本文所述的抗CD3-CD19抗原结合构建体能够在CD19+RajiB细胞与JurkatT细胞之间形成突触和桥接，如通过FACS和/或显微术所测定。在一些实施方案中，本文所述的药物缀合的抗原结合构建体与博纳吐单抗相比展示抑制性(PD-1+)T细胞的更少活化。在某些实施方案中，测定为以下实施例中描述的那些。在一些实施方案中，将本文所述的双特异性抗原结合构建体的功能特征与参照抗原结合构建体的功能特征相比。参照抗原结合构建体的身份取决于被测量的功能特征或做出的区分。例如，当比较示例性抗CD3-CD19双特异性抗原结合构建体的功能特征时，参照抗原结合构建体可为抗CD19抗体HD37和/或抗CD3抗体OKT3或替利珠单抗。在其它实施方案中，参照抗原结合构建体为本文所述的构建体，例如v891(博纳吐单抗)或二价抗CD19(v4371)。在一些实施方案中，参照抗原结合构建体为无缀合药物的相同变体，例如将v12043与用SMCC接头缀合至DM1的v12043进行比较。抗体阻断结合至参照抗体(例如OKT3或HD37)的程度可使用竞争测定来评价，在该测定中测试抗体能够抑制或阻断OKT3或HD37抗体(参照抗体)特异性结合至其靶抗原(关于测定的实例，参见，例如Junghans等人，CancerRes.50：1495，1990；Fendly等人CancerResearch50：1550-1558；US6,949,245)。如竞争性结合测定中所测量，如果过量的测试抗体(例如至少2x、5x、10x、20x或100x)将参照抗体的结合抑制或阻断了例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，那么测试抗体与参照抗体竞争。通过竞争测定(阻断抗体)鉴别的测试抗体包括与一种或多种参照抗体结合至与参照抗体所结合的表位足够靠近以产生位阻的相邻表位的相同表位的那些抗体。例如，在其中针对本文所述的抗原结合构建体结合抗原或与另一种多肽竞争结合至抗原或结合至Fc受体和/或抗白蛋白抗体进行分析的一个实施方案中，可使用本领域中已知的各种免疫测定，包括但不限于使用以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定(使用例如胶态金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测定(例如凝胶凝集测定、血细胞凝集测定)、补体固定测定、免疫荧光测定、蛋白A测定及免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测一级抗体上的标记来检测抗体结合。在另一实施方案中，通过检测二级抗体或试剂与一级抗体的结合来检测一级抗体。在又一实施方案中，二级抗体是标记过的。用于在免疫测定中检测结合的许多手段是本领域中已知的且在本发明的范围内。在某些实施方案中，当针对由本文所述的抗原结合构建体所包含的抗原结合结构域来鉴别结合配偶体(例如受体或配体)时，例如通过本领域中公知的以下手段分析本文所述的抗原结合构建体与那个结合配偶体的结合，例如像还原和非还原的凝胶色谱、蛋白质亲和色谱法及亲和力印迹。通常参见Phizicky等人，Microbiol.Rev.59：94-123(1995)。在另一实施方案中，抗原结合构建体蛋白结合至本文所述的抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体的一种或多种底物的生理关联的能力常规可使用本领域中已知的技术来分析。抗原结合构建体药物缀合物(ADC)在本文所提供的许多实施方案中，抗原结合构建体缀合至药物，例如毒素、化疗剂、小分子治疗剂、免疫调节剂(例如细胞因子)或放射性同位素。制备ADC(抗体药物缀合物或抗原结合构建体药物缀合物)的许多方法是本领域中已知的且描述于例如美国专利号8,624,003(锅方法)、8,163,888(一步)及5,208,020(两步法)中。在一些实施方案中，药物选自美登素、奥瑞斯他汀、加利车霉素或其衍生物。在其它实施方案中，药物为选自DM1和DM4的美登素。其它实例描述如下。在某些实施方案中，抗原结合构建体经由接头缀合至药物。所述接头可为可裂解的或不可裂解的。接头的非限制性实例描述如下。在一些实施方案中，一个药物分子缀合至一个抗原结合构建体，但在其它中，多个药物分子可缀合至同一抗原结合构建体。药物与抗原结合构建体比率(DAR)可例如在1.0至6.0、或3.0至5.0、或2.0至4.0范围内。在本文所述的一些实施方案中，DAR在2.2至3.5范围内。在一些实施方案中，DAR为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0或8.0。在某些实施方案中，ADC具有通式I：A-(L-(D)m)n(I)其中A为如本文所述的抗原结合构建体；L为接头；D为药物；m为介于1与约10之间的整数，且n为介于1与约20之间的整数。在某些实施方案中，m介于约1与约5之间或介于1与2之间。在一些实施方案中，m为1。在一些实施方案中，n介于1与10之间，例如，介于1与8之间、介于2与8之间、介于2与6之间或介于2与4之间。在一些实施方案中，L可不存在。药物ADC的药物部分可为具有细胞抑制性或细胞毒性作用的化合物或部分。在一些实施方案中，抗原结合构建体缀合至细胞毒性剂。如本文所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或破坏细胞的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如211At、131I、125I、90y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P及177Lu)、化疗剂、和毒素如小分子毒素或细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素，包括其片段和/或变体。本领域技术人员应理解药物的其中一些分类有重叠且因此不是彼此排他的。例如，毒素在其为可用于治疗癌症的化合物的意义上还可被认为是化疗剂。在一些实施方案中，药物为天然存在的毒素的类似物或衍生物。这种天然存在的毒素的实例包括但不限于：美登素、奥瑞斯他汀、多拉司他汀、微管溶素、哈米特林(hemiasterlin)、加利车霉素、倍癌霉素、吡咯并苯并二氮杂毒伞肽、喜树碱、假单胞菌外毒素(PE)、白喉毒素(DT)、去糖基化的蓖麻毒蛋白A(dgA)及白树毒蛋白。在一些实施方案中，药物为具有肽基支架的天然存在的毒素的类似物或衍生物。这种毒素的非限制性实例包括：奥瑞斯他汀、多拉司他汀、微管溶素、哈米特林及毒伞肽。在某些实施方案中，由ADC所包含的药物为毒素或毒素衍生物或类似物，其中所述毒素、衍生物或类似物为微管破坏剂或DNA修饰剂。作为微管破坏剂的毒素的实例包括但不限于美登素、奥瑞斯他汀、多拉司他汀、微管溶素、哈米特林及其类似物和衍生物。作为DNA修饰剂的毒素的实例包括但不限于加利车霉素及其它烯二炔抗生素、倍癌霉素、吡咯并苯并二氮杂毒伞肽、喜树碱及其类似物和衍生物。美登素如上所指出，在一些实施方案中，药物为美登素或美登素类似物或衍生物(“美登木素生物碱”)。示例性美登木素生物碱包括DM1(mertansine、emtansine、N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素)、DM3(N2′-脱乙酰基-N2′-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素)及DM4(ravtansine、soravtansine、N2′-脱乙酰基-N2′-(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)美登素)(参见美国专利公布号US2009/0202536)。天然存在的、合成的及半合成的美登木素生物碱的其它实例描述于以下文献中：Cassady等人，(2004)Chem.Pharm.Bull.52(1)：1-26；及美国专利号4,256,746；4,361,650；4,307,016；4,294,757；4,424,219；4,331,598；4,364,866；4,313,946；4,315,929；4,362,663；4,322,348和4,371,533。已知美登素化合物上的许多位置适用作键合位置，取决于连接的类型。举例来说，关于形成酯键，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修饰的C-15位及具有羟基的C-20位都是合适的。在某些实施方案中，ADC中所包括的药物为具有通式(II)的美登木素生物碱：其中Y为-(CR2)m-，各R独立地为H或C1-C6烷基，m为1、2或3，且表示与接头L的连接点(参见U.S.5,208,020、RE39151、WO2007/056550及Widdison等人，(2006)J.Med.Chem.，49：4392-4408)。在一些实施方案中，ADC中所包括的药物为具有通式(II)的美登木素生物碱，其中Y为-CH2CH2-、-CH2CH2CH(CH3)-或-CH2CH2C(CH3)2。可以考虑将美登素药物部分的所有立体异构体用于本文所述的ADC，即在手性碳处的R和S构型的任何组合。在一些实施方案中，ADC中所包括的药物为具有以下立体化学结构(通式(IIA))的美登木素生物碱：其中Y如上关于通式(II)所定义。在一些实施方案中，ADC中所包括的药物为具有通式(II)或(IIA)的美登木素生物碱，其中Y为-CH2CH2-(例如DM1)、-CH2CH2CH(CH3)-(例如DM3)或-CH2CH2C(CH3)2-(例如DM4)。在一些实施方案中，ADC中所包括的药物为具有通式(II)或(IIA)的美登木素生物碱，其中Y为-CH2CH2-(例如DM1)或-CH2CH2C(CH3)2-(例如DM4)。多拉司他汀和奥瑞斯他汀在一些实施方案中，药物为多拉司他汀或奥瑞斯他汀，如奥瑞斯他汀E(在本领域中还已知作为多拉司他汀-10的衍生物)或奥瑞斯他汀F或其类似物或衍生物。奥瑞斯他汀可为例如在奥瑞斯他汀E与酮酸之间形成的酯。例如，奥瑞斯他汀E可与对乙酰基安息香酸或苯甲酰基戊酸反应以分别产生奥瑞斯他汀EB(AEB)和奥瑞斯他汀EVB(AEVB)。其它典型的奥瑞斯他汀包括奥瑞斯他汀F苯二胺(AFP)、单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)及单甲基奥瑞斯他汀E(MMAE)。示例性奥瑞斯他汀的合成和结构描述于美国专利号6,884,869；7,098,308；7,256,257；7,423,116；7,498,298及7,745,394中，其各自出于所有目的以引用的方式整体并入本文。多拉司他汀或奥瑞斯他汀可经由药物分子的氨基(N)-末端或羧基(C)-末端缀合至抗原结合构建体。在一些实施方案中，药物为奥瑞斯他汀或其类似物或衍生物并且经由药物分子的N末端缀合至抗原结合构建体。适于经由药物分子的N末端缀合的奥瑞斯他汀类似物的实例包括美国专利号7,498,298和7,659,241中所述的那些。在一些实施方案中，药物为MMAE或MMAF。在一些实施方案中，药物为MMAE或MMAF并且经由如下所示的药物分子的N末端缀合至抗原结合构建体，其中表示与接头L的连接点：在一些实施方案中，药物为奥瑞斯他汀或其类似物或衍生物并且经由药物分子的C末端缀合至抗原结合构建体。适于经由药物分子的C末端缀合的奥瑞斯他汀类似物的实例包括国际专利公布号WO2002/088172和WO2016/041082中所述的那些。在一些实施方案中，药物为通式(III)的奥瑞斯他汀：其中：R2选自C2-C6烷基、芳基、芳基-C1-C6烷基、C4-C7环烷基、C3-C7环烷基-C1-C6烷基、杂芳基、杂芳基-C1-C6烷基及杂环基，各自任选被一个或多个选自以下的取代基取代：C1-C6烷氧基、C1-C6烷氧羰基、C1-C6烷基、C1-C6烷基氨基、氨基、氨基-C1-C6烷基、氨基-芳基、氨基-C3-C7环烷基、芳基、羧酰胺、羧基、氰基、C1-C6卤烷基、C1-C6卤烷氧基、卤基、羟基、硝基、硫代和硫代-C1-C6烷基；X为-C(O)NHCH(CH2R3)-，或X不存在；R3选自芳基、杂芳基及C3-C7环烷基，各自任选被一个选自氨基和羟基的取代基取代，且R4和R5各自独立地为H或C1-C6烷基。在通式(III)的背景中，术语“芳基”是指衍生自6至12元单环或二环烃环系统的基团，其中至少一个环是芳族的；术语“芳基-烷基”是指被一个芳基取代基取代的烷基；术语“环烷基-烷基”是指被一个环烷基取代基取代的烷基；术语“杂芳基”是指衍生自6至12元单环或二环环系统的基团，其中至少一个环原子是杂原子如O、N或S且至少一个环是芳族的；术语“杂芳基-烷基”是指被一个杂芳基取代基取代的烷基；术语“杂环基”是指衍生自3至12元单环或二环非芳族环系统的基团，其中至少一个环原子是杂原子如O、N或S；术语“烷氧羰基”是指-C(O)O-烷基；术语“烷基氨基”是指-NH-烷基；术语“氨基-烷基”是指被一个氨基取代基取代的烷基；术语“氨基-芳基”是指被一个氨基取代基取代的芳基；术语“氨基-环烷基”是指被一个氨基取代基取代的环烷基；术语“甲酰胺”是指-C(O)NH2；术语“卤烷基”是指被一个或多个卤基取代基取代的烷基；术语“卤烷氧基”是指-O-卤烷基，且术语“硫代-烷基”是指-S-烷基。在某些实施方案中，药物为通式(III)的奥瑞斯他汀并经由R2基团缀合至抗原结合部分。微管溶素在一些实施方案中，药物为微管溶素。天然存在的微管溶素包括例如微管溶素A、B、C、D、E、F、G、H、I、U、V、W及Z：微管溶素A：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH(CH3)2；R3＝OH微管溶素B：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH2CH2；R3＝OH微管溶素C：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH3；R3＝OH微管溶素D：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH(CH3)2；R3＝H微管溶素E：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH2CH2；R3＝H微管溶素F：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH2CH3；R3＝H微管溶素G：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH＝C(CH3)2；R3＝OH微管溶素H：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH3；R3＝H微管溶素I：R1＝Ac；R2＝CH2OC(O)CH3；R3＝OH微管溶素U：R1＝Ac；R2＝R3＝H微管溶素V：R1＝R2＝R3＝H微管溶素W：R1＝H；R2＝CH2OC(O)CH2CH2CH2；R3＝OH微管溶素X：R1＝Ac；R2＝H；R3＝OH微管溶素Z：R1＝R2＝H；R3＝OH还描述了微管溶素的治疗上有用的类似物和衍生物(参见，例如国际专利公布号WO2014/126836和美国专利公布号US2016/0130299)。微管溶素或微管溶素类似物或衍生物可经由自由羟基缀合至抗原结合构建体，或可被修饰以包括可用于缀合的胺基，如美国专利公布US2016/0130299中所述。哈米特林在一些实施方案中，药物为哈米特林或其类似物或衍生物。已描述了具有抗有丝分裂活性的哈米特林的各种类似物和衍生物(参见，例如国际专利公布号WO1996/33211和WO2004/026293)。美国专利号7,579,323描述了一种哈米特林类似物，称为HTI-286，其具有有力的抗有丝分裂活性且已在临床试验中关于癌症的治疗对其进行评价。在某些实施方案中，药物为HTI-286或其衍生物：哈米特林类似物的另外的实例描述于国际专利公布号WO2014/144871中。在某些实施方案中，药物为具有通式(IV)的哈米特林类似物或衍生物：其中：R26选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基及任选被取代的杂芳基；R27选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基及任选被取代的杂芳基；R16和R17各自独立地为H或C1-6烷基，且R18为C1-6烷基或-SH。在通式(IV)的背景中，术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链取代基，其为饱和或不饱和的且具有1至12个碳原子；术语“烷基氨基”是指式-NHRa或-NRaRa的取代基，其中各Ra独立地为含有1至12个碳原子的烷基取代基；术语“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的稳定的非芳族单环或多环烃取代基，其可包括具有3至10个碳原子的融合或桥接环系统；术语“芳基”是指包含氢、6至18个碳原子和至少一个芳族环的烃环取代基；术语“杂环基”是指由2至12个碳原子和1至6个选自N、O及S的杂原子组成的稳定的3至18元非芳族环取代基；且术语“杂芳基”是指包含氢原子、1至13个碳原子、1至6个选自N、O及S的杂原子以及至少一个芳族环的5至14元环系统取代基。在某些实施方案中，药物为通式(IV)的哈米特林并且经由R26取代基缀合至抗原结合构建体。在一些实施方案中，药物为通式(IV)的哈米特林并且经由R27取代基缀合至抗原结合构建体。加利车霉素在一些实施方案中，药物为加利车霉素或其类似物或衍生物。已描述了适于缀合至抗原结合构建体的加利车霉素的各种类似物和衍生物(参见，例如国际专利公布号WO2015/063680；美国专利号5,773,001；5，714,586和5,770,701)。倍癌霉素在一些实施方案中，药物为倍癌霉素或其类似物或衍生物。天然存在的倍癌霉素包括例如倍癌霉素A、B1、B2、C1、C2、D及SA，以及CC-1065。已描述了倍癌霉素的各种类似物和衍生物，包括阿多来新、比折来新及centanamycin。其它类似物和衍生物描述于美国专利号4,912,227；5,070,092；5,084,468；5,332,837；5,641,780；5,739,350及8,889,868中。倍癌霉素分子上的各种基团可被修饰以允许缀合至抗原结合构建体。非限制性实例提供于Elgersma等人，(2015)Mol.Pharmaceutics，12：1813-1835中。吡咯并苯并二氮杂在一些实施方案中，药物为吡咯并苯并二氮杂(PBD)或其类似物或衍生物，如PBD二聚体。已经描述了各种PBD二聚体，包括例如美国专利号6,884,799；7,049,311；7,511,032；7,528,126；7,557,099及9,056,914中所述的那些。在一些实施方案中，药物为PBD二聚体或其类似物或衍生物。据信PBD二聚体结构改善在DNA的结合位点处的配合。PBD二聚体可经由PBD二聚体上的以下许多潜在键合位点中的一个缀合至抗原结合构建体，如5元吡咯并环、介于PBD单位之间的连接、N10-C11亚胺基团或C2位(参见，例如国际专利公布号WO2007/085930、WO2009/016516、WO2011/130598、WO2011/130613及WO2011/130616；美国专利公布号US2011/0256157)。毒伞肽在一些实施方案中，药物为毒伞肽，如α-鹅膏菌素、β-鹅膏菌素、γ-鹅膏菌素或ε-鹅膏菌素、或其类似物或衍生物。在一些实施方案中，药物为α-鹅膏菌素或其类似物或衍生物。毒伞肽为包含八个氨基酸的环肽且因此提供许多供缀合的潜在位点。已经描述了各种毒伞肽及其类似物(参见，例如欧洲专利号EP1859811、美国专利号9,233,173及国际专利公布号WO2014/043403)。喜树碱在一些实施方案中，药物为喜树碱(CPT)或其类似物或衍生物，如依立替康(CPT-11)、SN-38(7-乙基-10-羟基-喜树碱)、10-羟基喜树碱、拓扑替康、勒托替康、9-氨基喜树碱或9-硝基喜树碱。CPT类似物和衍生物的其它实例包括7-丁基-10-氨基-喜树碱和7-丁基-9-氨基-10，11-亚甲二氧基-喜树碱(参见美国专利公布号US2005/0209263)及含有这些化合物的衍生物的苯胺，如Burke等人，(2009)，Bioconj.Chem.20(6)：1242-1250中所述。喜树碱及其类似物或衍生物与抗原结合构建体的缀合可经由药物分子中的各种基团的修饰而实现。非限制性实例提供于Burke等人，(2009)，Bioconj.Chem.20(6)：1242-1250及Sharkey等人，(2012)Mol.CancerTher.11：224-234中。化疗剂在一些实施方案中，抗原结合构建体缀合至化疗剂。实例包括但不限于顺铂和拉帕替尼。“化疗剂”为适用于治疗癌症的化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，如硫替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡及保释芬；乙烯亚胺，如苯并多巴、卡波醌、迈托多巴及脲多巴；氮丙啶和甲基安美拉胺，包括六甲蜜胺、曲他胺、三亚乙基磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺及三甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、环磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、甲二氯二乙胺、甲二氯二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、胆固醇苯乙酸氮芥、松龙苯芥、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如aclacinomysins、放线菌素、authramycin、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、carabicin、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如环胞苷、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素，如二甲睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酮戊酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfomithine；依利醋铵；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；蘑菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；硝基可润；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；足叶草酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；PSK7；丙亚胺；西佐喃；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2’，2’，2’-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；氮烯唑胺；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；双溴丙基哌嗪；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷，例如紫杉醇(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton，N.J.)和多西他赛(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫代鸟嘌呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；米托蒽醌；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；卡培他滨；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯培拉霉素；卡培他滨；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在此定义中还包括用于调控或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬、LY117018、奥那司酮及托瑞米芬(Fareston)；以及抗雄激素，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林及戈舍瑞林；以及上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，化疗剂为蒽环霉素，如阿霉素、表柔比星、伊达比星、柔红霉素(也称为道诺霉素)、奈莫柔比星或其类似物或衍生物。蒽环霉素分子内的各种基团可被修饰以用于缀合至抗原结合构建体。例如，已经描述了用于缀合至抗体的柔红霉素和阿霉素的衍生化(参见，例如Kratz等人，(2006)CurrentMed.Chem.13：477-523；美国专利号6,630,579)。接头在一些实施方案中，药物通过接头与抗原结合构建体(例如抗体)连接。接头为能够将一种或多种药物与抗原结合构建体连接的双官能或多官能部分。在一些实施方案中，接头可为双官能的(或单价的)以便其将单个药物与抗原结合构建体上的单个位点连接。在一些实施方案中，接头可为多官能的(或多价的)以便其将多于一个药物与抗原结合构建体上的单个位点连接。在一些实施方案中，多官能接头还可用于将一个药物与抗原结合构建体上的多于一个位点连接。接头与抗体或其它抗原结合构建体的连接可以多种方式实现，如经由表面赖氨酸、还原性偶联至氧化的碳水化合物及经由通过还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基。或者，接头与抗原结合构建体的连接可通过以下操作完成：修饰抗原结合构建体以包括另外的半胱氨酸残基(参见，例如美国专利号7,521,541；8,455,622及9,000,130)或提供反应性处理的非天然氨基酸，如硒代蛋氨酸、对乙酰苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮基甲基-L-苯丙氨酸(参见，例如Hofer等人，(2009)Biochemistry48：12047-12057；Axup等人，(2012)PNAS109：16101-16106；Wu等人，(2009)PNAS106：3000-3005；Zimmerman等人，(2014)Bioconj.Chem.25：351-361)，以便允许位点特异性缀合。接头包括能够与抗原结合构建体上的一个或多个靶基团反应的官能团及能够与药物上的靶基团反应的一个或多个官能团。合适的官能团是本领域中已知的且包括例如在BioconjugateTechniques(G.T.Hermanson，2013，AcademicPress)中所述的那些。与游离半胱氨酸或硫醇反应的官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、卤代乙酰基、活性酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰基氯、磺酰氯、异氰酸酯及异硫氰酸酯。在此情形下如Lyon等人，(2014)Nat.Biotechnol.32：1059-1062中所述的“自稳定”马来酰亚胺也是有用的。与表面赖氨酸和胺反应的官能团的非限制性实例包括活性酯，如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或磺基-NHS酯、亚氨基酯如Traut试剂、异硫氰酸酯、醛及酸酐，如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)。其它实例包括琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四-甲基尿四氟硼酸盐(TSTU)和苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷六氟磷酸盐(PyBOP)。能够与抗原结合构建体或药物(如醛或酮羰基)上的亲电子基团反应的官能团的非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯及芳酰肼。在某些实施方案中，可使用包括允许抗体结合构建体上的两个链间半胱氨酸的桥接的官能团的接头，如ThioBridgeTM接头(Badescu等人，(2014)Bioconjug.Chem.25：1124-1136)、二硫代马来酰亚胺(DTM)接头(Behrens等人，2015，Mol.Pharm.12：3986-3998)、基于二硫代芳基(TCEP)哒嗪二酮的接头(Lee等人，(2016)Chem.Sci.7：799-802)或基于二溴代哒嗪二酮的接头(Maruani等人，(2015)Nat.Commun.6：6645)。用于将药物与抗体及其它抗原结合构建体连接的多种接头是本领域中已知的，包括基于腙、二硫化物及肽的接头。合适的接头通常对细胞外的条件比对细胞内的条件在化学上更稳定，但在某些情况下可考虑稳定性较小的接头，如当药物具有选择性或靶向性且对正常细胞具有低毒性时。合适的接头包括例如可裂解的和不可裂解的接头。可裂解的接头通常在细胞内条件下易受裂解，例如经由溶酶体加工。实例包括为蛋白酶敏感性、酸敏感性或还原敏感性的接头。相反，不可裂解的接头依赖抗体在细胞中的降解，这通常造成氨基酸-接头-细胞毒素部分的释放。合适的可裂解接头包括例如可被细胞内蛋白酶(如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶)裂解的含有肽的接头。在示例性实施方案中，接头可为含有二肽的接头，如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)接头。包含在接头中的合适的二肽的其它实例包括Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys及Met-(D)Lys。在一些实施方案中，接头还可包含更长的肽序列，如三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys或(D)Ala-Phe-Lys、或四肽Gly-Phe-Leu-Gly或Ala-Leu-Ala-Leu。另外合适的可裂解的接头包括含有二硫化物的接头。含有二硫化物的接头的实例包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPBD)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基SPBD)。含有二硫化物的接头可任选地包含提供与二硫键相邻的位阻的另外的基团，以便提高接头(例如包含偕二甲基)的细胞外稳定性。其它合适的接头包括在特定的pH下或pH范围内可水解的接头，如腙接头。包含这些官能团的组合的接头也可适用，例如，包含腙和二硫化物的接头是本领域中已知的。可裂解的接头的另一实例是包含β-葡糖苷酸的接头，其可被β-葡糖醛酸酶裂解，β-葡糖醛酸酶是一种存在于溶酶体和肿瘤间质中的酶(参见，例如DeGraaf等人，(2002)Curr.Pharm.Des.8：1391-1403)。可裂解的接头可任选进一步包含一个或多个另外的官能团，如自我牺牲型和自我清除型基团、延伸段或亲水性部分。应用于接头中的自我牺牲型和自我清除型基团包括例如对氨基苄氧基羰基(PABC)和对氨基苄基醚(PABE)基团、及甲基化乙二胺(MED)。自我牺牲型基团的其它实例包括但不限于电子上类似于PABC或PABE基团的芳族化合物，如杂环衍生物，例如2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物，如美国专利号7,375,078中所述。其它实例包括一旦酰胺键水解便经历环化的基团，如取代的和未被取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人(1995)ChemistryBiology2：223-227)和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55：5867-5877)。单独或以组合形式的自我牺牲型/自我清除型基团常常包括在基于肽的接头中，但也可包括在其它类型的接头中。在一些实施方案中，接头可包含一个或多个自我牺牲型和自我清除型基团，例如PABC基团、PABE基团、或PABC或PABE基团与MED的组合。应用于ADC的接头中的延伸段包括例如亚烷基及基于脂族酸、二酸、胺或二胺的延伸段，如二乙醇酸酯、丙二酸酯、已酸酯及己酰胺。其它延伸段包括例如基于甘氨酸的延伸段和聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)延伸段。PEG和mPEG延伸段还用作亲水性部分且可尤其适用于疏水性药物，但在一些实施方案中，还预期其在具有其它药物的接头中的使用。在某些实施方案中，本公开的ADC中所包括的接头为通式(VI)的基于肽的接头：其中：Z为能够与抗原结合构建体上的靶基团反应的官能团；Str为延伸段；AA1和AA2各自独立地为氨基酸，其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶裂解位点；X为自我牺牲型基团；D为药物；n为0或1；m为1、2或3，且o为0、1或2。在一些实施方案中，在通式(VI)中：Z为在一些实施方案中，在通式(VI)中：Str为其中R为H或C1-C6烷基；p为介于2与10之间的整数，且q为介于1与10之间的整数。在一些实施方案中，在通式(VI)中：Str为其中p和q如上所定义。在一些实施方案中，在通式(VI)中：Str为其中p为介于2与6之间的整数，且q为介于2与8之间的整数。在一些实施方案中，在通式(VI)中：AA1-[AA2]m选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、苯基Gly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys、(D)Ala-Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly及Ala-Leu-Ala-Leu。在一些实施方案中，在通式(VI)中：m为1(即AA1-[AA2]m为二肽)。在一些实施方案中，在通式(VI)中：AA1-[AA2]m为选自以下的二肽：Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit及Trp-Cit。在一些实施方案中，在通式(VI)中：各X独立地选自对氨基苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)及甲基化乙二胺(MED)。在一些实施方案中，在通式(VI)中：n为1。在一些实施方案中，在通式(VI)中：o为1或2。在一些实施方案中，在通式(VI)中：Z为Str为其中p为介于2与6之间的整数，且q为介于2与8之间的整数；m为1且AA1-[AA2]m为选自以下的二肽：Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit及Trp-Cit；各X独立地选自对氨基苄氧基羰基(PABC)、对氨基苄基醚(PABE)及甲基化乙二胺(MED)。n为1，且o为1或2。在一些实施方案中，接头为含有二硫化物的接头且ADC具有通式(VII)：其中：A为抗原结合构建体；D为药物；Y为-(CH2)p-或-(CH2CH2O)q-，其中p和q各自独立地为介于1与10之间的整数；各R独立地为H或C1-C6烷基；n为1、2或3，且其中表示在接头与抗原结合构建体上的表面赖氨酸的ε-氨基之间形成的酰胺键。在一些实施方案中，在通式(VII)中：p和q各自独立地为介于1与4之间的整数。在一些实施方案中，在通式(VII)中：Y为-(CH2)p-且p为介于1与4之间的整数。在一些实施方案中，在通式(VII)中：各R独立地为H或Me。在一些实施方案中，在通式(VII)中：n为1或2。在一些实施方案中，在通式(VII)中：Y为-(CH2)p-且p为介于1与4之间的整数；各R独立地为H或Me，且n为1或2。在一些实施方案中，可应用于本公开的ADC中的常用的可裂解接头的实例包括但不限于包含以下的接头：SPBD、磺基-SPBD、腙、Val-Cit、马来酰亚胺己酰基(MC或mc)、mc-Val-Cit、mc-Val-Cit-PABC、Phe-Lys、mc-Phe-Lys或mc-Phe-Lys-PABC。各种不可裂解的接头在本领域中已知用于连接药物与靶向部分并且可适用于本公开的ADC中。不可裂解的接头的实例包括具有以下的接头：N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯部分以供与细胞结合剂反应以及基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分以供与药物反应，或反之亦然。这种不可裂解的接头的一个实例是基于磺基琥珀酰亚胺基-4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)。磺基-SMCC缀合通常经由马来酰亚胺基团发生，马来酰亚胺与药物部分上的巯基(硫醇，-SH)反应，而磺基-NHS酯对伯胺(如见于赖氨酸及蛋白质或肽N-末端中)有反应性。这种接头的其它非限制性实例包括基于以下的那些：N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸酯)(“长链”SMCC或LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰氧基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基4-(对马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)及N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。其它实例包括包含基于卤代乙酰基的官能团的那些，如N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯羧酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)及N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。不可裂解的接头的其它实例包括马来酰亚胺基羧酸，如马来酰亚胺基己酰基(MC)。在某些实施方案中，抗原结合构建体经由含有磺酰胺的接头缀合至药物，如国际专利公布号WO2015/095953中所述。在一些实施方案中，抗原结合构建体经由具有通式(VIII)的接头缀合至药物：其中：R选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的杂芳基、-COR27-、-CSR27-、-OR27-及-NHR27-，其中各R27独立地选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基及任选被取代的杂芳基；P3为药物或药物的一部分；L3为接头或接头的一部分，且A为抗原结合构建体。在一些实施方案中，抗原结合构建体经由具有通式(IX)的接头缀合至药物：其中-L3-A具有结构：其中：P3为药物的其余部分；-NH-基团键结至R’形成与(AA)1的肽键(接合肽键或JPB)；R’选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的杂芳基、-COR27-、-CSR27-、-OR27-及-NHR27-，其中各R27独立地选自任选被取代的烷基、任选被取代的烷基氨基、任选被取代的环烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的杂环基及任选被取代的杂芳基；各AA独立地为氨基酸，其中(AA)1-(AA)x合起来包含能够促进JPB裂解的氨基酸序列；x为0至25的整数；L’为接头的其余部分或不存在；A为抗原结合构建体。在一些实施方案中，抗原结合构建体经由可裂解的接头(例如，SPBD接头或马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-Val-Cit-PABC)接头)偶联到药物上。在一些实施方案中，抗原结合构建体经由不可裂解的接头(例如，使用SMCC或磺基-SMCC形成的MCC接头)偶联到药物上。对于给定ADC的适当接头的选择可易于由具有本领域的公知常识的本领域技术人员考量以下相关因素后做出：如连接到抗原结合构建体的位点、药物的任何结构限制及药物的疏水性(参见，例如综述于Nolting，第5章，Antibody-DrugConjugates：MethodsinMolecularBiology，2013，Ducry(编著)，Springer中)。已经描述了许多特定的接头-毒素组合且在某些实施方案中可与本文所述的抗原结合构建体一起用于制备ADC。实例包括但不限于基于可裂解的肽的接头与奥瑞斯他汀如MMAE和MMAF、喜树碱如SN-38、倍癌霉素及PBD二聚体；基于不可裂解的MC的接头与奥瑞斯他汀MMAF和MMAE；基于酸不稳定的腙的接头与加利车霉素和阿霉素；基于二硫化物的接头与美登木素生物碱如DM1和DM4；以及基于双马来酰亚胺基三氧代乙二醇(BMPEO)的接头与美登木素生物碱DM1(参见，例如Peters&Brown，(2015)Biosci.Rep.e00225；Dosio等人，(2014)RecentPatentsonAnti-CancerDrugDiscovery9：35-65；美国专利公布号US2015/0374847)。ADC的制备ADC可通过本领域中已知的若干途径中的一种，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件及试剂来制备(参见，例如BioconjugateTechniques(G.T.Hermanson，2013，AcademicPress)。例如，缀合可通过以下实现：(1)抗体的亲核基团或亲电子基团与二价接头试剂反应以经由共价键形成抗体-接头中间体Ab-L，然后与活性药物部分D反应；或(2)药物部分的亲核基团或亲电子基团与接头试剂反应以经由共价键形成药物-接头中间体D-L，然后与抗体的亲核基团或亲电子基团反应。缀合方法(1)和(2)可用多种抗体、药物部分及接头来制备本文所述的ADC。各种制备的接头、接头组分及毒素可商购获得或可使用标准合成有机化学技术来制备(参见，例如March’sAdvancedOrganicChemistry(Smith&March，2006，第六版，Wiley)；Toki等人，(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Frisch等人，(1997)Bioconj.Chem.7：180-186；BioconjugateTechniques(G.T.Hermanson，2013，AcademicPress))。另外，适于与选出的抗原结合构建体反应的许多预成形药物-接头也可商购获得的，例如，包含DM1、DM4、MMAE、MMAF或倍癌霉素SA的接头-毒素可购自CreativeBioLabs(Shirley,NY)。制备ADC的方法的若干具体实例是本领域中已知的且描述于美国专利号8,624,003(锅方法)、8，163,888(一步)及5,208,020(两步法)中。其它方法是本领域中已知的且包括Antibody-DrugConjugates：MethodsinMolecularBiology，2013，Ducry(编著)，Springer中所述的那些。另外，各种抗体药物缀合业务可商购获自以下公司：如LonzaInc.(Allendale，NJ)、AbzenaPLC(Cambridge，UK)、ADCBiotechnology(St.Asaph，UK)、BaxterBioPharmaSolutions(BaxterHealthcareCorporation，Deerfield，IL)及PiramelPharmaSolutions(Grangemouth，UK)。缀合至抗原结合构建体的药物的平均数量(药物与抗体比率或DAR)可通过以下标准技术来测定：如UV/VIS光谱分析、基于ELISA的技术、色谱技术如疏水性相互作用色谱法(HIC)、UV-MALDI质谱法(MS)及MALDI-TOFMS。另外，药物连接的形式(例如，含有0、1、2、3个等药物的抗原结合构建体的部分)的分布也可任选被分析。测量这种分布的各种技术是本领域中已知的，包括MS(有或没有伴随的色谱分离步骤)、疏水性相互作用色谱法、逆相HPLC或等电聚焦凝胶电泳(IEF)(参见，例如Wakankar等人，(2011)mAbs3：161-172)。药物组合物本文还提供了药物组合物，其包含本文所述的药物缀合的抗原结合构建体。药物组合物包含所述构建体和药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典中列出，以用于动物并且更具体地用于人。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体可为无菌液体，如水和油类，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。在一些方面中，载体为自然界中未曾发现的人工载体。当静脉内施用药物组合物时，水可用作载体。盐水溶液及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体，尤其是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。如果需要的话，组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。可用传统的粘合剂及载体如甘油三酯将组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例由E.W.Martin描述于″Remington′sPharmaceuticalSciences″中。这种组合物将含有治疗有效量的化合物，优选呈纯化形式，以及适量载体，以便提供向患者适当施用的形式。制剂应与施药模式相适应。在某些实施方案中，包含构建体的组合物是根据常规程序被配制成适合于向人静脉内施用的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物为在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂，如利多卡因以在注射位点处止痛。一般来说，所述成分单独或混合在一起以单位剂型(例如作为干燥冻干粉末或无水浓缩物)提供于指示活性剂的量的密闭容器(如安瓿或药囊)中。当组合物有待通过输注施用时，可以用含无菌药用级水或盐水的输液瓶来配送。当组合物通过注射施用时，可提供灭菌注射用水或盐水的安瓿以便成分可在施用之前混合。在某些实施方案中，本文所述的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括用以下阴离子形成的盐：如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子；和用以下阳离子形成的盐：如来源于钠、钾、铵、钙、氢氧化铁异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的阳离子。治疗方法本文还描述了治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向其中需要这种治疗、预防或改善的受试者施用有效治疗、预防或改善所述疾病或病症的量的本文所述的抗原结合构建体。病症与疾病可互换使用并且是指将受益于用本文所述的抗原结合构建体或方法的治疗的任何情况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括易使哺乳动物患上所讨论的病症的那些病理情况。在一些实施方案中，所述病症为癌症。术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。动物可为人、非人灵长类动物、伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如，奶牛、绵羊、猪、马等)或实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠等)。如本文所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物及猪科动物。“治疗”是指在改变待治个体或细胞的自然过程的尝试中进行的临床干预，它可以是为了预防而实施，或者可以在临床病理过程中实施。治疗希望达到的效果包括：阻止疾病的发生或复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻病情、以及缓和或改善预后。在一些实施方案中，本文所述的抗原结合构建体用于延迟疾病或病症的发展。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合构建体和方法实现肿瘤消退。在一个实施方案中，本文所述的抗原结合构建体和方法实现肿瘤/癌生长的抑制。治疗希望达到的效果包括但不限于：阻止疾病的发生或复发、缓解症状、消除疾病的任何直接或间接病理学结果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻病情、以及缓和或改善预后。在一些实施方案中，本文所述的构建体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。如本文所用的术语“有效量”是指所施用的构建体的量，其将实现所述方法的目标，例如在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一个或多个症状。将在治疗、抑制及预防与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性有关的疾病或病症中有效的本文所述的组合物的量可通过标准临床技术来测定。另外，体外测定可任选地用于帮助鉴别最佳剂量范围。有待用于制剂中的精确剂量还将取决于施用途径及疾病或病症的严重程度，且应根据专业人员的判断及每位患者的状况来决定。从来源于体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线外推出有效剂量。治疗用途：一方面，将本文所述的抗原结合构建体和药物缀合的抗原结合构建体用于基于抗体的疗法中，所述疗法涉及向患者施用抗原结合构建体或编码抗原结合构建体的核酸以用于治疗一种或多种疾病、病症或病状。这种病症、疾病及病状可包括但不限于癌症(血液学、实体肿瘤或转移性)、自身免疫疾病、炎性疾病、以及由如病毒、细菌、寄生虫或真菌的病原体所引起的疾病，这些病原体在受感染宿主的细胞表面上表达抗原。适用于这些构建体中的靶标见于表LL中。在一些实施方案中，药物缀合的抗原结合构建体基本上不耗竭施用构建体的受试者的T细胞。如本文所用的“基本上耗竭”T细胞意指T细胞数量减少至小于施用前数量的约75％、小于约50％或小于约25％。在某些实施方案中，提供一种用于预防、治疗或改善癌症的方法，所述方法包括向需要这种预防、治疗或改善的受试者施用包含本文所述的抗原结合构建体的药物组合物。在某些实施方案中，提供一种治疗有此需要的哺乳动物中的癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含有效量的本文所述的药物组合物任选与其它药学活性分子组合的组合物。在某些实施方案中，癌症为淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，癌症为淋巴瘤或白血病或B细胞恶性肿瘤、或表达CD19的癌症、或非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或套细胞淋巴瘤(MCL)或急性淋巴母细胞性白血病(ALL)或慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或利妥昔单抗或CHOP(cytoxanTM/AdriamycinTM长春新碱/强的松疗法)耐药性B细胞癌、或博纳吐单抗耐药性或难治性B细胞癌。在一些实施方案中，癌症为实体肿瘤。在一些实施方案中，癌症为不容易被淋巴细胞浸润的非炎性肿瘤。另一方面，本文所述的抗原结合构建体和药物缀合的抗原结合构建体是用于制造或制备药剂。在一个实施方案中，所述药剂是用于治疗癌症。在某些实施方案中，所述药剂是用于治疗淋巴瘤或白血病。在其它实施方案中，所述药剂是用于治疗如上所述的癌症。在另一实施方案中，所述药剂是用于治疗癌症的方法中，所述方法包括向患有癌症的患者施用有效量的所述药剂。在某些实施方案中，本文所述的方法和用途进一步包括向患者施用有效量的至少一种另外的治疗剂，例如，细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、心脏保护剂、免疫刺激剂、免疫抑制剂、蛋白质酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、其它抗体、Fc融合物或免疫球蛋白、或其它治疗剂。在某些实施方案中，另外的治疗剂是用于预防和/或治疗癌症。这种组合疗法包括组合施用和分隔施用，在组合施用中，两种或更多种治疗剂包含在同一制剂或不同制剂中；而在分隔施用中，本文所述的抗原结合构建体可在施用另外的治疗剂和/或佐剂之前、同时和/或之后施用。本文所述的抗原结合构建体和药物缀合的抗原结合构建体可单独或以与其它类型治疗(例如放射疗法、化疗、激素疗法、免疫疗法及抗肿瘤剂)组合的形式施用。治疗或预防活性的证明：在人中使用之前，将本文所述的药物缀合的抗原结合构建体或药物组合物在体外然后在体内就所需的治疗或预防活性进行测试。例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防效用的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的效果。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的效果可利用本领域技术人员已知的技术来确定，包括但不限于玫瑰花结形成测定和细胞裂解测定。治疗性/预防性施用及组合物：提供了通过向受试者施用有效量的本文所述的抗原结合构建体或药物组合物来治疗、抑制及预防的方法。在一个实施方案中，抗原结合构建体被基本上纯化(例如，基本上不含限制其效果或产生不希望有的副作用的物质)。在某些实施方案中，受试者为动物，包括但不限于以下动物，如奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等，且在某些实施方案中，为哺乳动物，且最优选为人。各种递送系统是已知的且可用于施用本文所述的抗原结合构建体制剂，例如，脂质体包囊、微颗粒、微胶囊、能表达抗原结合构建体的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见，例如Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、核酸构建为逆转录病毒或其它载体的一部分，等等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及经口途径。抗原结合构建体可通过任何便利的途径，例如通过输注或弹丸注射、通过经由上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)的吸收来施用且可与其它治疗剂一起施用。施用可为全身或局部的。合适的施用途径包括心室内和鞘内注射；可通过例如附着于贮器(如Ommaya贮器)的心室内导管来便于心室内注射。还可通过例如使用吸入器或喷雾器以及含气雾剂的制剂来进行肺部施用。在一个具体实施方案中，希望向需要治疗的区域施用本文所述的抗原结合构建体或组合物；这可通过例如但不限于以下方式来实现：在外科手术中局部灌注、局部应用(例如在外科手术后结合伤口敷剂)、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或者借助于植入物；所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状材料，包括膜(如硅化橡胶膜)或纤维。优选地，当施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须注意使用所述蛋白质不会吸收的材料。在另一实施方案中，抗原结合构建体或组合物可在囊中递送，特别是在脂质体中(参见Langer,Science249：1527-1533(1990)；Treat等人，于LiposomesintheTherapyofInfectiousDiseaseandCancer，Lopez-Berestein和Fidler(编著)，Liss，NewYork，第353-365页(1989)中；Lopez-Berestein，出处同上，第317-327页；一般参见，出处同上)在又一实施方案中，抗原结合构建体或组合物可在控释系统中递送。在一个实施方案中，可使用泵(参见Langer,同上；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：201(1987)；Buchwald等人，Surgery88：507(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.321：574(1989))。在另一实施方案中，可使用聚合材料(参见MedicalApplicationsofControlledRelease，Langer和Wise(编著)，CRCPres.，BocaRaton，Fla.(1974)；ControlledDrugBioavailability，DrugProductDesignandPerformance，Smolen和Ball(编著)，Wiley,NewYork(1984)；Ranger和Peppas，J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61(1983)；也参见Levy等人，Science228：190(1985)；During等人，Ann.Neurol.25：351(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.71：105(1989))。在又一实施方案中，可将控释系统置于治疗目标(例如脑)的邻近处，这样仅需要全身剂量的一部分(参见，例如Goodson，MedicalApplicationsofControlledRelease，同上，第2卷，第115-138页(1984))。其它控释系统论述于中Langer(Science249：1527-1533(1990))的综述中。试剂盒和制品本文还描述了包含本文所述的一种或多种抗原结合构建体的试剂盒。所述试剂盒的单个成分包装在独立容器中，并且与这些容器相关的可以是规范药物或生物制品的制造、使用和销售的政府机构批准形式的公告，该公告反映经制造、使用或销售的机构批准。试剂盒可任选地含有概述抗原结合构建体的使用方法或施用方案的指导或说明书，有时称为“包装说明书(packageinsert)”。当试剂盒的一种或多种成分以溶液、例如水溶液或无菌水溶液提供时，所述容器本身可以是吸入器、注射器、移液器、滴眼器或其它类似装置，所述溶液可自所述装置施用或应用于受试者，或与试剂盒中的其它成分混合。试剂盒的成分也可以干燥或冻干形式提供并且所述试剂盒可另外含有合适的溶剂来使冻干成分复原。与容器的数目或类型无关，本文所述的试剂盒也可包括辅助将组合物施用于患者的器具。这样一种器具可为吸入器、鼻用喷雾装置、注射器、移液器、镊子、量匙、滴眼器或类似的医学上认可的递送媒介物。在本文所述的另一方面中，提供了一种含有适用于治疗、预防和/或诊断如上所述的病症的材料的制品。所述制品包括容器及在容器上或与容器有关的标签或包装说明书。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。容器装有本身或以与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断病状的组合物，并可具有无菌存取口(例如，该容器可以是具有皮下注射器针头可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是本文所述的T细胞活化的抗原结合构建体。标签或包装说明书指出所述组合物是用来治疗特定病状的。此外，所述制品可包括：(a)其中容纳含有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文所述的抗原结合构建体；以及(b)其中容纳含有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性或另外的治疗剂。在此实施方案中，本文所述的制品可进一步包括包装说明书，所述包装说明书指出组合物可用于治疗特定的病状。或者或另外，所述制品可进一步包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液及葡萄糖溶液。其还可包括具有商业需要以及符合用户需要的材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。多肽和多核苷酸本文所述的抗原结合构建体包含至少一种多肽。还描述了编码本文所述的多肽的多核苷酸。多肽和多核苷酸通常是分离的。如本文所用的“分离的”意指已从其天然细胞培养环境组分中鉴别和分离和/或收获的物质(例如多肽或多核苷酸)。其天然环境的污染组分是将干扰抗原结合构建体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素及其它蛋白质或非蛋白质的溶质。分离的也指例如经由人工干预合成产生的物质。术语“多肽”、“肽”及“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的说明同样适用于肽的说明及蛋白质的说明，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语包括任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在的氨基酸、以及以类似于天然存在的氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即碳结合到氢、羧基、氨基和R基团，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。对氨基酸的提及包括例如天然存在的蛋白质性L-氨基酸；D-氨基酸、化学修饰的氨基酸，如氨基酸变体和衍生物；天然存在的非蛋白质性氨基酸，如β-丙氨酸、鸟氨酸等；以及具有本领域中已知为氨基酸特征的性质的化学合成的化合物。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)以及侧链中的羧酸官能团被磺酸基取代的氨基酸(例如，磺基丙氨酸)。非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸)向本发明的蛋白质中的掺入可在许多不同的方面是有利的。含D-氨基酸的肽等与含L-氨基酸的对应物相比展现提高的体外或体内稳定性。因此，掺入D-氨基酸的肽等的构建当需要或要求更高的细胞内稳定性时可尤其有用。更具体地，D-肽等是抗内源性肽酶和蛋白酶的，由此提供分子的改善的生物利用度及当需要这种性质时延长的体内寿命。另外，D-肽等不能被有效加工以用于向T辅助细胞进行II类主要组织相容性复合物限制的呈递，且因此，不容易在整个生物体内诱导体液免疫应答。氨基酸在本文中可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号表示。同样，核苷酸可由其通常接受的单字母代码表示。本文还描述编码抗原结合构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”意在表示两个或更多个核苷酸分子的连续区段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源、或其任何组合。术语“核酸”是指以单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制，该术语包括含有天然核苷酸已知类似物的核酸，具有与参照的核酸类似的结合特性，并以类似于天然存在的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特别限制，该术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA的类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另有陈述，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)及互补序列以及明确所示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现(Batzer等人，NucleicAcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列两者。关于特定核酸序列，“保守修饰的变体”是指那些编码相同或基本上相同的氨基酸序列的核酸，或者当核酸并不编码氨基酸序列时，是指基本相同的序列。因为遗传密码的简并性，很多功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG及GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸用密码子表示的每个位置处，密码子可被改变为在未改变所编码的多肽情况下所述的任何相应的密码子。这种核酸变异是“沉默变异”，它是一种保守修饰的变异。编码多肽的本文中的每个核酸序列还描述核酸的每个可能的沉默变异。本领域普通技术人员将认识到在核酸中的每个密码子(除AUG和TGG外，AUG通常是甲硫氨酸唯一的密码子，而TGG通常是色氨酸唯一的密码子)可被修饰以产生功能性相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种沉默变异暗含在每种所述序列中。至于氨基酸序列，本领域普通技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小部分氨基酸的各个取代、缺失或添加都是“保守性修饰变体”，其中变化造成氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表为本领域普通技术人员所知。这类保守修饰变体补充且不排除本文描述的多态变体、种间同源物及等位基因。提供功能上类似的氨基酸的保守取代表为本领域普通技术人员所知。下面8组的每一组都含有能彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见，例如Creighton，Proteins：StructuresandMolecularProperties(WHFreeman&Co.；第2版(1993年12月)在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列。如果使用下面的序列比较算法之一(或本领域普通技术人员可利用的其它算法)或通过手工比对和视觉检查来测量，在比较窗口上或所指定的区域中比较和比对序列以得到最大一致性时，序列的一定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(即，在指定区域上约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、或约95％同一性)，那么所述序列是“基本上相同的”。此定义还指测试序列的互补序列。同一性可存在于长度至少约50个氨基酸或核苷酸的区域，或在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或当未指定时，在多核苷酸或多肽的整个序列上。可以通过包括下列步骤的方法来获得编码本发明多肽的多核苷酸，包括来自非人物种的同系物：在严格杂交条件下用具有本文所述的多核苷酸序列或其片段的经标记探针筛选文库；并分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。这种杂交技术是熟练技术人员公知的。对于序列比较，通常一个序列被用作参照序列，将测试序列与参照序列相比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列都输入计算机，如果需要，设定子序列座标，然后设定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或者可设定选择参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。如本文所用的“比较窗”包括提及任何一个选自由以下组成的组的数目的连续位置的区段：20至600，通常约50至约200，更通常是约100至约150，其中在两个序列最佳对比后，可将一个序列与相同数目连续位置的参照序列比较。用来比较的序列比对方法为本领域普通技术人员所知。可通过包括但不限于以下的方法进行用于比较的最佳序列对比：Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444的搜索相似性法；这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA，在WisconsinGeneticsSoftwarePackage，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，Wis.中)的计算机化实施；或人工比对和视觉检查(参见，例如Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(1995增刊))。适用于测定百分比序列同一性及序列相似性的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1997)Nuc.AcidsRes.25：3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心在万维网的ncbi.nlm.nih.gov处公开获得。BLAST算法参数W、T及X决定所述比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用如下默认参数：字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4并且对两条链进行比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用如下默认参数：字长为3、且期望值(E)为10、且BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4，且对两条链进行比较。BLAST算法通常在“低复杂性”过滤器关闭下进行。BLAST算法还在两个序列之间进行相似性的统计分析(参见，例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787)。BLAST算法提供的一个相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列间偶然出现匹配的概率指标。举例来说，如果在比较测试核酸与参照核酸时发现最小总和概率小于约0.2、或小于约0.01、或小于约0.001，那么认为核酸与参照序列相似。短语“选择性地(或特异性地)杂交至”是指在严格的杂交条件下，分子仅与存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。短语“严格杂交条件”是指在如本领域中已知的低离子强度及高温的条件下DNA、RNA、或其它核酸序列、或其组合的杂交。通常，在严格条件下，探针将与在核酸的复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的其靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。较长序列尤其是在较高温度下杂交。核酸杂交的广泛指导见于Tijssen，LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，“Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)中。如本文所用，术语“工程化(engineer/engineered/engineering)”被认为包括肽主链的任何操作或天然存在的或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括氨基酸序列、糖基化模式、或个别氨基酸的侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。通过标准分子生物学技术表达和产生工程化的蛋白质。“分离的核酸分子或多核苷酸”是指已从其天然环境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，包含在载体中的编码多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或在溶液中的纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常含有多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子，但多核苷酸分子存在于染色体外或存在于不同于其天然染色体位置的染色体位置处。分离的RNA分子包括体内或体外RNA转录物以及正链和负链形式及双链形式。本文所述的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子，例如，经由PCR或化学合成。另外，在某些实施方案中，多核苷酸或核酸包括调控元件，如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。术语“聚合酶链反应”或“PCR”一般是指用于体外扩增所需核苷酸序列的方法，例如，按美国专利号4,683,195中描述的方法。一般来说，PCR方法包括使用能够与模板核酸优先杂交的寡核苷酸引物来使引物延伸合成的反复循环。至于具有与本发明的参照核苷酸序列存在至少，例如95％“同一性”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，意指多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同，除了多核苷酸序列可以包括参照核苷酸序列的每100个核苷酸中最多5个的点突变。换句话说，为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述参照序列中的最多5％的核苷酸可以缺失或者用另一种核苷酸取代，或者可以将参照序列的所有核苷酸的最多5％的核苷酸插入所述参照序列。参照序列的改变可在参照氨基酸序列的5′或3′末端位置或这些末端位置间任何地方发生，单独散布在参照序列的残基中或在参照序列的一个或多个连续基团中。作为实践的问题，可以使用已知的计算机程序、如上文针对多肽所述的那种(例如ALIGN-2)，来常规确定是否任何特定的多核苷酸序列与本发明的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的100个氨基酸序列具有至少50％同一性，那么便称多肽的衍生物或变体与该肽享有“同源性”或是“同源的”。在某些实施方案中，衍生物或变体与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的任一者至少75％相同。在某些实施方案中，衍生物或变体与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的任一者至少85％相同。在某些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少90％相同。在一些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少95％相同。在某些实施方案中，衍生物或变体与同衍生物具有相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的任一者至少99％相同。如本文所用的术语“修饰的”是指对给定多肽做出的任何改变，如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的改变、共翻译修饰或多肽的翻译后修饰。形式“修饰的”术语意指所论述的多肽任选被修饰，亦即讨论中的多肽可被修饰或未被修饰。在一些方面中，抗原结合构建体包含与本文所公开的表或登录号中列出的相关氨基酸序列或其片段有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面中，分离的抗原结合构建体包含由与本文所公开的表或登录号中列出的相关核苷酸序列或其片段有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语都具有要求保护的主题所属领域技术人员通常理解的相同含义。在对这里的术语有多种定义的情况中，本节的这些定义优先。在参考URL或其它该类标识或地址时，应当清楚的是该类标识可发生变化并且因特网上的特定信息也可能会变化，但是通过在因特网上进行搜索可以找到等同的信息。对其进行参考表明该类信息是可以获得和公开传播的。除非在本文的其它地方有明确规定，在抗体
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：中所理解的术语每个都具有在本领域中获取的含义。应理解，一般描述及随后的详细描述仅为示例性和说明性的且不限制要求保护的任何主题。除非另有特别说明，在本申请中，单数的使用包括了复数。除非另外指出，在本说明书中，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都应理解为包括所引用的范围内的任一整数，并且当合适时，其分数(如整数的十分之一和百分之一，等等)。除非另外指出，如本文所用的“约”意指指示范围、值、序列或结构的±10％。应理解，除非另外指出或在上下文中指示，如本文所用的术语“一个(a)”和“一个(an)”是指所列举成分的“一个或多个”。替代物(例如，“或”)的使用应被理解为表示替代物的任一、两个或其任何组合。如本文所用，术语“包括”与“包含”可同义使用。另外，应理解来源于本文所述的结构和取代基的不同组合的个别单链多肽或免疫球蛋白构建体被本申请公开的程度与每个单链多肽或异二聚体被单独阐明一样。因此，对形成个别单链多肽或异二聚体的具体成分的选择在本公开的范围内。文中使用的章节标题只是为了使结构清晰，而不是要限制其描述的主题。应当理解，本文所述的方法和组合物不限于本文所述的具体方法、方案、细胞系、构建体及试剂等，因为这些可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制本文所述的方法和组合物的范围，其范围只受所附权利要求书的限制。不论出于何目的，本申请所引用的所有文献或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、手册和论文)都据此明确地以引用的方式整体并入。将本文中提及的所有出版物和专利以引用的方式整体并入本文，目的在于描述和公开例如可与本文所述的方法、组合物及化合物结合使用的出版物中所述的构建体和方法。本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。在本文中不应该将这一点视为本发明人承认由于先前发明或任何其他原因，本发明人无权承认本公开内容先于这些出版物。实施例以下具体的且非限制性实施例仅被视为说明性的，且在任何情况下不应理解为限制本公开。不需进一步阐述，任何熟悉本
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：之人士可依本说明书公开的内容即可最充分地利用本发明。本文所引用的所有出版物据此以引用的方式整体并入。在参考URL或其它该类标识或地址时，应当清楚的是该类标识可发生变化并且因特网上的特定信息也可能会变化，但是通过在因特网上进行搜索可以找到等同的信息。对其进行参考表明该类信息是可以获得和公开传播的。示例性双特异性抗CD3-CD19、抗CD3-CDH3、抗CD3-HER2、抗CD3-HER3及抗CD3-EGFR抗原结合构建体如下所述来制造。这些类型的构建体的示例性示意图示于图1A-D中。所有形式都是基于通过CH3结构域中的已知突变构建的异二聚Fc(VonKreudenstein等人，MAbs.20135(5)：646-54)。使用示例性药物DM1、DM4及MMAE将示例性构建体缀合至药物以制备ADC。实施例1.适用于呈双重scFv形式的ADC的双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的说明、表达及纯化如PCT/US2015/011664中所述来设计、表达及表征针对CD3和CD19的双特异性抗体。简言之，使用为人/哺乳动物表达而优化的密码子，经由基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。scFv-Fc序列是由已知的抗CD3和CD19scFvBiTETM抗体(Kipriyanov等人，1998，Int.JCancer：77,763-772)、抗CD3单克隆抗体OKT3(DrugBankreference：DB00075)生成。制备的双重scFv变体描述于表1中。表1双重scFv变体-HetFc1＝链A：L351Y_F405A_Y407V；链B：T366L_K392M_T394W(对于IgG1Fc的EU编号系统)-HetFc2＝链A：T350V_L351Y_F405A_Y407V；链B：T350V_T366L_K392L_T394W-FcγRKO1＝链A：L234A_L235A；链B：L234A_L235A-FcγRKO2＝链A：D265S_L234A_L235A；链B：D265S_L234A_L235A-αCD19_HD37scFv-除非另外指出，可变区的N末端至C末端顺序是VL/VH-αCD3_OKT3scFv-除非另外指出，可变区的N末端至C末端顺序是VL/VH。VLVH是由(GGGGS)3接头相连。-αCD3_BiTEscFv-可变区的N末端至C末端顺序是VH/VL且接头和组成与博纳吐单抗相同。-(VLVHSS)或(VHVLSS)表示利用根据Kabat编号系统的公开位置VH44和VL100的二硫化物稳定的scFv，以便将二硫键引入scFv的VH与VL之间[Reiter等人，Nat.Biotechnol.14：1239-1245(1996)]。-(CDRC-＞S)-表示如下文所参照的OKT3的H3CDR中的突变-(VHVL接头)-表示由接头SSTGGGGSGGGGSGGGGSDI连接的VH与VL。Fc编号是根据如Kabat中的EU索引，EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，ProcNatlAcadSciUSA63：78-85)；Fab或可变结构域编号是根据Kabat(Kabat和Wu，1991；Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版-USDepartmentofHealthandHumanServices，NIHpublication第91-3242期，第647页(1991))。表1中所述的变体包括变体875，一种初步设计，其用作生成具有改进的产率及生物物理性质的抗原结合构建体的起点。修饰包括通过VLVH二硫化物工程化和/或添加稳定的CDR突变来使scFv稳定。所有变体包括异二聚Fc(HetFc1或HetFc2)且可在CH2结构域中有或没有突变(FcγRKO1或FcγRKO2)的情况下表达以消除Fc效应物活性。包括对Fc的这种修饰的变体被称为具有Fc敲除或FcKO。变体875、1661、1653、1662、1660、1666、1801及1380是所开发的CD3-CD19抗原结合构建体的初始设计，而变体6747、10149及12043例示了包括被设计以进一步改进CD3-CD19抗原结合构建体的产率和生物物理性质的修饰的设计(关于额外细节参见实施例3-4)。还已经设计了变体N1、N3及N10并且这些变体的生物物理和功能特征可由本文所提供的数据预测。用于CD3和CD19scFv的VHVL二硫化物工程化策略利用根据Kabat编号系统的公开位置VH44和VL100，以便将二硫键引入scFv的VH与VL之间[Reiter等人，Nat.Biotechnol.14：1239-1245(1996)]。如Kipryanov等人，ProteinEngineering10：445-453(1997)中所述生成αCD3OKT3scFv的H3CDR中的C向S的突变。将最终的基因产物亚克隆到哺乳动物表达载体pTT5(NRC-BRI，Canada)中并在CHO细胞中表达(Durocher，Y.，Perret，S.&Kamen，A.High-levelandhigh-throughputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growingCHOcells.Nucleicacidsresearch30，E9(2002))。将CHO细胞用含水1mg/mL25kDa聚乙烯亚胺(PEI，Polysciences)在2.5：1的EI：DNA比率下在指数生长期(1.5至2百万个细胞/mL)转染(RaymondC.等人Asimplifiedpolyethylenimine-mediatedtransfectionprocessforlarge-scaleandhigh-throughputapplications.Methods.55(1)：44-51(2011))。为了确定用于形成异二聚体的最佳浓度范围，将DNA在允许异二聚体形成(例如，HC-A/HC-B/比率＝50∶50％)的重链A(HC-A)和重链B(HC-B)的最佳DNA比率下转染。在4000rpm下离心之后收集培养基的5-6天后收获转染的细胞，并且使用0.45μm滤纸澄清。将澄清的培养基加载到MabSelectSuRe(GEHealthcare)蛋白质-A柱上并用10柱体积的PBS缓冲液(pH7.2)洗涤。将抗体用10柱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH3.6)洗脱，其中汇集的级分含有用TRISpH11中和的抗体。使用Econo-Pac10DG柱(Bio-Rad)为蛋白质脱盐。在一些情况下，通过凝胶过滤进一步纯化蛋白质，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL并经由AKTAExpressFPLC以1mL/min的流速加载到Superdex200HiLoad16/600200pg柱(GEHealthcare)上。PBS缓冲液(pH7.4)是在1mL/min的流速下使用。收集对应于纯化的抗体的级分，浓缩至～1mg/mL并在-80℃下储存。在蛋白质a纯化之后使用蛋白质L色谱法的另外的纯化步骤可通过如下方法进行。用PBS平衡CaptoL树脂并且将变体添加到树脂中并在室温下孵育30min。将树脂用PBS洗涤，并且用0.5ml0.1M甘氨酸(pH3)洗脱结合蛋白质。最终产物的纯度和产率通过LC/MS和UPLC-SEC来估算，如PCT/US2015/011664中所详述。使所有变体表达并且纯化至＞95％异二聚体纯度，而没有污染同二聚体。将对应于每个双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体的克隆示于表XX(在实施例的结尾处)中，并且将每个克隆的相应序列组成示于表YY中。变体中使用的CDR序列示于表S1中。表S1：CD3和CD19抗原结合构建体的CDR序列实施例2：呈杂合异二聚体Fc形式或全尺寸抗体形式的示例性双特异性抗原结合抗CD3-CD19构建体的说明、表达和纯化另外的双特异性抗CD3-CD19抗原结合构建体1853、6754、10151、6750、6751、6475、6749、10152、10153及6518如实施例1中所述来制备。这些构建体是基于与变体875相同的抗原结合结构域，但为了改进产率及生物物理性质已被工程化。这些修饰包括将一个或两个scFv改变为等效Fab形式和/或通过VL-VH二硫化物工程化及使CDR突变稳定来使scFv稳定。变体组成的详述示于表2中。表2：变体及组成的概述*所有变体都具有以下CH3突变：链1：T350V_L351Y_F405A_Y407V；链2：T350V_T366L_K392L_T394W变体(在括号中)是指在两条重链上包含另外的突变D265S_L234A_L235A的等效Fc敲除变体。这消除了Fc与FcγR的结合。如上所述生成抗CD19scFv和抗CD3scFv序列。抗CD19Fab(HD37Fab)是使用分别融合至人IgG1CH和CL序列的HD37VH和VL序列的嵌合Fab。将scFv或VH-CH结构域融合至异二聚Fc的一条链。由人源化OKT3抗体替利珠单抗(EliLilly)的已知序列生成抗CD3Fab(tepizumabFab)。将VH-CH结构域融合至异二聚Fc的一条链。用于抗CD3和抗CD19scFv两者的scFv二硫化物工程化策略(VHVLSS)利用根据Kabat编号系统的公开位置VH44和VL100，以便将二硫键引入scFv的VH与VL之间[Reiter等人，Nat.Biotechnol.14：1239-1245(1996)]。以下变体含有针对抗CD3scFv的突变以改进稳定性和产率，如先前所报道[Kipriyanov等人，Prot.Eng.10(4)：445-453(1997)]。v1653、v6475及v10153具有抗CD3(OKT3)，其在VHCDR3的位置100A处具有半胱氨酸向丝氨酸的突变。杂合及全尺寸抗CD3-CD19抗原结合构建体的克隆、表达及表征的详述提供于PCT/US2014/046436中。将对应于每个双特异性抗CD3-CD19及抗原结合构建体的克隆示于表XX中，且将每个克隆的相应序列组成示于表YY中。对照v891具有与博纳吐单抗(BiTETM)相同的多肽序列且包括抗CD3scFv和抗CD19scFv(50kDa)。变体4371为二价单特异性抗CD19抗体(用于被称为SGN-19Adenintuzumabmafodotin的SeattleGenetics的抗CD19抗体-药物缀合物中)。在一些实验中，多克隆的人IgG被用作对照且被称为v6249。实施例3.抗CD3和抗CD19抗体的人源化及稳定化已知的鼠科和人源化抗CD3和CD19抗体BiTETM抗体(Kipriyanov等人，1998，Int.JCancer：77,763-772)、抗CD3单克隆抗体OKT3(DrugBankreference：DB00075)、抗CD3单克隆抗体替利珠单抗(DrugBankreference：DB00075)及抗CD19单克隆抗体HD37(Kipriyanov等人，1998，Int.JCancer：77,763-772；Pezzutto，A.等人，1986，LeukocyteTypingII.第2卷.Springer-Verlag.HeidelberglNewYork.P..391.)展现低产率及生物物理稳定性。为了改进基于HD37和OKT3的抗体的产率及生物物理性质，使用一种用于人源化及稳定化的结构导向方法。此方法是基于如由Ewert等人(Ewert等人，Methods34(2004)184-199)所述的人源化及稳定化方法且另外包括VH/VL三维结构的详细分析以鉴别造成低稳定性的潜在VH/VL框架位置。此外，就翻译后修饰的潜在位点对框架和CDR序列进行分析，这些修饰包括去酰胺化、天冬氨酸异构化及蛋白酶裂解。工程化的人源化抗CD3和抗CD19VL和VH序列及与已知亲代鼠科抗体HD37和OKT3及人源化替利珠单抗的序列比对分别示于图2和4中。通过结构导向的人源化和稳定化方法鉴别的关键位置在图2和4中以下划线标注且以粗体突出显示。以hVH/hVL表示的工程化的人源化序列被用于构建如实施例4中所述的双特异性变体。实施例4.具有改进的产率及生物物理性质的双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的表达和纯化为改进产率及生物物理稳定性而设计的双特异性抗CD3-CD19抗体如表3和实施例3中所述来构建。变体v10149和v6751为CD3-CD19抗原结合构建体的初始鼠科双重scFv异二聚体Fc和杂合异二聚体Fc设计(关于进一步的说明参见实施例1和实施例2)。变体v12043和v15192-v15195例示了人源化设计，其包含可变结构域框架及被设计来进一步改进CD3和CD19抗原结合构建体的产率及生物物理性质的CDR修饰。抗CD19鼠科HD37scFv已在实施例1中描述并且Fab抗CD19鼠科HD37是使用分别融合至人IgG1CH和CL序列中的HD37VH和VL序列的嵌合Fab。人源化HD37Fab是包含分别融合至人IgG1CH和CL序列中的人源化HD37VH和VL序列hVH2和hVL2(D-E)(图2)的Fab。人源化HD37scFv包含人源化HD37VH和VL序列hVH2和hVL2(D-E)(图2)且具有与如上针对v10149所述相同的VH/VL取向和接头。鼠科抗CD3scFv与亲代变体v875中的scFv相同(表1)且人源化抗CD3scFv是由如图4和表3中所述的工程化VH和VL序列生成。-(VLVHSS)表示利用根据Kabat编号系统的公开位置VH44和VL100的二硫化物稳定的scFv，以便将二硫键引入scFv的VH与VL之间[Reiter等人，Nat.Biotechnol.14：1239-1245(1996)]。表3：变体及组成的概述将人源化Fab和scFv序列融合至针对实施例1和2中的亲代鼠科变体所述的异二聚体Fc链中。所有变体具有以下CH3突变：重链A：T350V_L351Y_F405A_Y407V；重链B：T350V_T366L_K392L_T394W。相应的重链CH3突变可在抗CD19链或抗CD3链上。所有变体进一步在两条重链上包含另外的突变D265S_L234A_L235A以消除Fc与FcγR的结合。Fc编号是根据如Kabat中的EU索引，EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，ProcNatlAcadSciUSA63：78-85)；Fab或可变结构域编号是根据Kabat(Kabat和Wu，1991；Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版-USDepartmentofHealthandHumanServices，NIHpublication第91-3242期，第647页(1991))。将鼠科HD37和OKT3序列人源化且为了改进产率及稳定性进一步通过以下改变来修饰：i)人源化抗CD3scFv可利用VHCDR3的位置100A处的公开的半胱氨酸向丝氨酸的突变[Kipriyanov等人，Prot.Eng.10(4)：445-453(1997)]且变体v15192-v15195和v17119(表3)含有丝氨酸突变以用于改进稳定性，ii)人源化抗CD19CDR的序列在位置28处被修饰以消除可能影响抗原结合的潜在的天冬氨酸异构化位点，iii)鉴别特定的VHVL框架位置以便潜在地影响稳定性和产率(实施例3)；这些位置在图2和4中以下划线标注且以粗体突出显示。将对应于每个双特异性抗CD3-CD19及抗原结合构建体的克隆示于表XX中，且将每个克隆的相应序列组成示于表YY中。包括表(INCLUDETABLE)如在PCT/US2015/011664及实施例1和2中所述设计、表达及表征针对CD3和CD19的双特异性抗体。双特异性抗体通过蛋白质A亲和色谱法及后续的凝胶过滤来纯化，如实施例1中所述。图6和表4示出了初始亲代鼠科变体v6751和工程化的人源化变体的制备型SEC纯化及最终纯化后产率的结果。初始鼠科变体v6751显示在蛋白质A纯化之后接近50％的高分子聚集物及低总产率，而工程化的变体显示极少的聚集物和2-3倍增加的产率。最终的纯化后产率与阳性对照商用抗体相当。表4：人源化变体的产率实施例5.工程化的双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)评价稳定性工程化的双特异性抗CD19-CD3构建体与鼠科亲代变体相比的热稳定性。使用GEVP-Capillary仪器进行所有DSC实验。将蛋白质缓冲液交换为PBS(pH7.4)并稀释至0.3至0.7mg/mL，将0.137mL加载到样品细胞中并从20至100℃以1℃/min的扫描速率来测量。使用Origin软件(GEHealthcare)分析数据，其中减除PBS缓冲液背景。表5示出了亲代鼠科对比稳定性工程化的人源化构建体的个别抗CD3和抗CD19Fab及scFv的估算的解链温度(Tm)的列表。表5A：工程化的抗CD19结合结构域的热稳定性表5B：工程化的抗CD3结合结构域的热稳定性(*)对IgG形式的变体测量DSC；由于具有类似解链温度的CH2、Fab及scFv转变的重叠，只能估算具体的Tm(参见图7)抗CD19和抗CD3Fab和scFv如上所述(实施例1和4)来构建，表示为双特异性或单特异性Fc构建体且通过如所述的DSC来测量纯化的构建体。图7示出了选出的工程化变体对比亲代鼠科对照的代表性DSC热分析图。通过比较工程化的与亲代的鼠科DSC热分析图估算如表5中所概述的个别结构域的解链转变。表5和图7中的结果显示具有工程化的可变结构域的人源化构建体与其鼠科亲代构建体相比具有提高的稳定性。最终的稳定杂合变体v15192-v15195具有超过72℃的热解链温度，与商用IgG抗体的Fab相当。如表4和5中所示，结构导向的稳定性工程化在表达和热稳定性上产生显著改进。此外，与人源化替利珠单抗的比较表明在产率和稳定性上的改进与序列人源化无关，而大多数是由于向VH/VL位置的特定改变，已经通过对Fab/scFv稳定性很关键的结构导向方法对此进行鉴别。总之，结构导向人源化及稳定化方法已经鉴别了具有显著改进的产率和稳定性的新型人源化OKT3和HD37VH/VL序列。不同于展现低表达及稳定性的已知的鼠科和人源化HD37和OKT3scFv，我们的工程化变体显示与商用IgG相当的产率和稳定性且因此允许开发作为治疗性抗体。实施例6.工程化的双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的抗原结合为了确定工程化的双特异性构建体v15192-v15195是否与亲代鼠科构建体v6751等同结合至CD19和CD3抗原，通过如下所述的SPR和全细胞FACS测量与CD19和CD3的结合亲和力。在25℃下使用BioRadProteOnXPR36仪器用10mMHEPES、150mMNaCl、3.4mMEDTA及0.05％Tween20(pH7.4)进行所有SPR结合实验。在抗Fc捕获传感器芯片上捕获重组CD3ε/δFc融合蛋白(SinoBiological；ht中://www.sinobiological.com/CD3D-CD3-Delta-Protein-g-10182.html)。当按照建立稳定基线的缓冲液注射以25μL/min注射持续240s(得到近似500RUs)时，通过结合重组CD3融合蛋白在传感器芯片上间接捕获纯化的抗体。使用平衡拟合(EquilibriumFit)模型从结合等温线测定所生成的KD值，其中报告值作为三个独立操作的平均值。表6概括了工程化的人源化双特异性构建体v15192-v15195的SPR结合的结果。所有工程化构建体与亲代鼠科构建体v6751等同结合至CD19和CD3抗原。稳定性工程化的人源化构建体与亲代v6751相比等同结合至CD3抗原。表6：工程化抗CD19-CD3变体与重组CD3的SPR结合样品捕获(RU)KD(M)Rmax(RU)v6751959.931.41E-07178.72v15193988.483.70E-07174.01v15194975.923.49E-07179.12v151951032.894.27E-07192.69实施例7：与CD19+Raii肿瘤细胞和CD3+JurkatT细胞的全细胞结合及人PBMC人源化双特异性抗CD19-CD3构建体结合至表达CD3和CD19的细胞的能力经由先前所述的全细胞FACS结合分析(PCT/US2015/011664)来评价。与CD19+RajiB细胞(ATCC：CCL-86；Pulvertaft，Lancet1964)和CD3+Jurkat细胞(Weiss，JImmunol1984)的结合及变体v15195的表观结合亲和力示于图8A和B中。双特异性抗CD19-CD3构建体(在图8中由v15195例示)以高亲和力(2.4nM的表观亲和力)结合人RajiCD19+NHLB细胞且以低亲和力(44.7nM的表观亲和力)结合人CD3+JurkatT细胞。双特异性T细胞接合物交联T细胞且靶向B细胞的能力是活性的必要条件。因此，除评价如图8A和B所示与分离的B和T细胞系的结合之外，还测试了双特异性抗CD19-CD3构建体交联人PBMC中的自体B和T细胞的能力。将新鲜分离的人PBMC在冰上与v15195一起孵育并且通过FACS分析B细胞：T细胞双联体的百分比以确定交联B和T细胞能力的浓度依赖性。T∶B双联体百分比被定义为CD20+SSC低群内的FSC-W-高细胞。超过75％的所鉴别的双联体是CD4+或CD8+，提示它们已与T细胞形成双联体。如图8C中所示，B∶T细胞双联体在人PBMC中的分析证明v15195以浓度依赖性方式且在低于1nM的浓度下交联人PBMC中的B和T细胞。总之，这些数据显示，双特异性抗CD19-CD3构建体在低于2nM的浓度下优先结合B细胞且交联B和T细胞，而在高于40nM的显著较低浓度下结合至分离的T细胞。这种在低浓度下优先结合B细胞并交联B和T细胞，而在低浓度下仅结合分离的T细胞的实情允许开发双特异性药物缀合物，其将在不影响分离的T细胞的情况下优先结合B细胞并活化T细胞。实施例8：双特异性抗CD19-CD3抗原结合构建体的药物缀合示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体药物缀合物的示意图示于图1中。将抗CD3-CD19抗原结合构建体使用不可裂解的接头SMCC缀合至DM1或者使用如下所述的可裂解的接头SPBD缀合至DM4。使用一步工序将变体缀合至DM1或DM4。首先使用PD-10柱将起始蛋白质样品交换为包含50mM磷酸钾(pH6.5)、50mMNaCl及2mMEDTA的缓冲液，并且调节至2-10mg/ml的蛋白质浓度。然后将SMCC-DM1(LevenaBiopharmaUS，SanDiego，CA)或SPBD-DM4(LevenaBiopharmaUS，SanDiego，CA)溶于二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM溶液添加到7.5摩尔当量的蛋白质样品中。进一步添加DMA至10％v/v的最终浓度并且短暂地混合样品。将反应混合物在25℃下孵育过夜，伴随混合。然后使用PD-10柱将产物交换为包含20mM丁二酸钠(pH5.0)的缓冲液，并且基于在252和280nm下的吸光度计算蛋白质浓度和药物与抗体比率(DAR)。将缓冲液调节至20mM丁二酸钠、6％w/v海藻糖及0.02％w/v聚山梨醇酯20pH5.0的最终组成。使用TosohG3000-SWXL柱(7.8mmx30cm)在100mM磷酸钠、300mM氯化钠pH7.0中以1ml/min流速进行高效液相色谱法-尺寸排阻色谱法(HPLC-SEC)以测定ADC的纯度。v12043、v6754、6751、15195及4372的SMCC-DM1缀合物具有超过70％的产率、＞85％的纯度及2.2-3.5的药物/抗体比率(DAR)，如表7中所总结。v12043的SPBD-DM4缀合物具有70％的产率和82％的纯度。表7双特异性抗CD3-CD19变体的缀合变体缀合物DAR纯度％产率12043SMCC-DM12.2917112043SPBD-DM42.882706754SMCC-DM12.585756751SMCC-DM13.597724372SMCC-DM13.5907815195SMCC-DM13.59772图9示出了在缀合之后v12043-SMCC-DM1的示例性UPLC-SEC分布图。其它变体表现类似。实施例9.双特异性形式对抗CD3-CD19抗原结合药物-缀合物对B和T肿瘤细胞系的体外活性的影响为了测试抗CD3-CD19缀合物对靶B细胞和T细胞的细胞毒性和效力，使用B和T肿瘤细胞系在生长抑制测定中测试具有相同CDR但不同抗原结合形式的scFv或Fab的选出的双特异性抗CD3-CD19缀合物。图10和表8中选出的变体先前已显示对CD19和CD3具有相似的结合亲和力。所有选出的变体对CD19的亲和力是～2nM，而对CD3ε的亲和力是～40nM。细胞毒性的程度是在CD19+Raji或Ramos(ATCC：CRL-1596；Klein，Intervirology1975)非何杰金氏淋巴瘤(NHL)靶B细胞系和CD3+JurkatT细胞系的细胞培养物中与非特异性IgGSMCC-DM1缀合物(v6249)相比且将缀合至SMCC-DM1的单特异性抗CD19抗体huBU12作为阳性对照(v4371)进行测量。目前将单特异性抗CD19抗体huBU12评价为NHL和B-ALL的I期和II期临床试验中的MC-MMAF药物缀合物(denintuzumabmafodotin)(Gerber，Blood2009；AlbertsonTM，Proceeding：AACRAnnualMeeting2014)。SMCC-DM1缀合物的潜在脱靶细胞毒性是针对不表达CD19或CD3的靶细胞系K562(ATCC：CCL-243)来测量。将选出的抗体在培养基中稀释并一式三份添加到靶标Raji、Ramos、Jurkat或K562细胞中并且孵育24小时。将细胞洗涤，更换培养基并且在37℃孵育3天之后评估细胞存活。使用磺酰罗丹明B测量细胞活力，按照标准工序在510和540nm下读取吸光度。将数据针对未治疗的对照归一化并且在GraphPadprism中进行分析。所有抗CD3-CD19缀合物都显示针对不表达CD19或CD3的细胞系K562无脱靶活性，类似于非特异性IgG-SMCC-DM1对照v6249(数据未示出)。表8：选出的抗CD3-CD19变体对B和T细胞的细胞毒性如图10和表8中所示的生长抑制结果出人意料地显示，所有单价抗CD19双特异性抗体对靶B细胞的细胞毒活性与二价单特异性抗CD19-SMCC-DM1对照v4371相当或更优。缀合变体6751对RamosB细胞具有0.45nM的效力且二价单特异性阳性对照v4371缀合物具有～6nM的效力。生长抑制结果还提示在不同的杂合与双重scFv抗CD3-CD19-MCC-DM1缀合物之间出人意料的差异。变体6751-MCC-DM1(其中抗CD3呈scFv形式且抗CD19呈Fab形式)以0.45nM的EC50对B细胞有高活性，而对JurkatT细胞有极低活性，类似于非特异性对照v4371和v6249。相比之下，变体v6754(其中抗CD3呈Fab形式且抗CD19呈scFv形式)对靶B细胞和T细胞具有相似的效力。杀伤靶B细胞而不影响T细胞的潜在治疗窗如表8中所示进行计算。数据提示变体6751和12043而非6754具有杀伤靶B细胞而不影响T细胞的治疗窗。这些结果出人意料地显示，双特异性T细胞接合物药物缀合物可被开发以优先结合并杀伤靶B细胞，而不影响T细胞。作为优先结合及活性的结果，双特异性T细胞接合物药物缀合物具有以下双重作用机制的潜力：i)T细胞重定向的B细胞杀伤，及ii)经由缀合毒素有效负载的内化的B细胞杀伤。此外，数据表明优先行为依赖于以下双特异性的特征中的一个或所有：i)CD3抗原的单特异性靶向，ii)与CD3抗原的低亲和力结合，iii)双特异性的形式和几何结构。总之，结果允许鉴别双特异性形式(包括Fab对scFv及杂合对双重scFv或全尺寸Ig双特异性和Ig同种型和铰链)及CD3e亲和力作为关键参数，为了开发双特异性CD3T细胞接合物药物缀合物必须对这些参数进行优化。此结论及具有不同形式的变体的分级如实施例10中所述在用原代T细胞的活性测定中被证实且还在用肿瘤和T细胞系的内化测定中被证实(实施例21)。实施例10.示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体药物-缀合物在原代人血液样品中的体外功效为了进一步测试在不影响T细胞及T细胞活性下靶B细胞的优先杀伤，在用同种异体Ramos和Raji淋巴瘤细胞系的原代血培养物中测试选出的变体。此测定反映了抗CD3-CD19缀合物对由双特异性的T细胞重定向活性介导的同种异体靶B细胞的细胞毒活性，而且缀合药物是通过靶B细胞对抗原结合构建体的内化来递送。为了测量缀合物对T细胞群的作用，分析T细胞活性、活化及增殖。作为总T细胞计数的相关标记，已对CD4和CD8进行测量，而通过分别建立早期和晚期T细胞活化标记CD69和CD25来测量CD8和CD4T细胞的T细胞活化。另外，测量T细胞耗竭标记PD-1以评估对T细胞抑制和耗竭的潜在作用。PD-1(程序化细胞死亡蛋白1)用作免疫检查点且在下调免疫系统中起重要作用，通过防止T细胞活化并促进T细胞细胞凋亡，同时减少调节性T细胞(抑制性T细胞)中的细胞凋亡实现(FranciscoLM，SagePT，SharpeAH(Jul2010)ImmunologicalReviews236：219-42)。从供体中收集个别研究的人血(120-140mL)并且新鲜分离PBMC。进一步加工PBMC以衍生出无自体B细胞的亚群(PBMC-B)。静息PBMC被用作效应细胞且Raji或Ramos人B细胞用作靶细胞且T细胞与同种异体Raji或RamosB细胞的比率被调节为5∶1的E∶T比率。在第0天通过FACS测定B细胞和T细胞群。排他的B细胞标记包括CD19和CD20。通过CD3、CD4和CD8测量T细胞群并且如上所述分别通过CD69、CD25和PD1测量T细胞活化和潜在耗竭。将一式四份孔针对每个对照和实验条件铺板并且将共培养物在5％CO2、37℃下孵育且在72小时时终止。通过FACS评价T和B细胞在培养物中的相应比例。出于CD45、CD20和7-AADFACS检测对收集的培养细胞进行染色。如下通过InCyte/FlowJo进行FACS分析：将Guava8HT流式细胞仪用于细胞亚群的分析。通过血细胞计数分析FSC/SSC和补偿孔的5,000个事件及实验孔的30,000个事件。阈值被设定为跳过碎片(skipdebris)和RBC。证实所有B细胞在第0天对CD19和CD20呈双阳性，这允许对作为适当的B细胞标记的CD20的监测。在对照实验中，将无PBMC的Raji和Ramos细胞培养物与变体一起孵育，在72小时之后就B细胞细胞毒性进行分析。图11和12示出了两个个别PBMC供体及同种异体RajiB细胞的n＝2重复的结果。非缀合变体v12043对两个供体的Raji靶B细胞具有＜0.05nM的效力且以相似的效力诱导T细胞增殖和活化。非缀合的变体v12043能够通过T细胞重定向机制耗竭～50％的靶B细胞。相比之下，药物缀合物显示在低于0.5nM的浓度下同等物T细胞介导的B细胞耗竭，但另外能够在高于0.5nM的浓度下进一步耗竭靶RajiB细胞。出人意料地，缀合物仅在50nM的最高浓度下显示对T细胞增殖的影响，而在较低浓度下无影响。这同图10和表8中所呈现的数据一致。图13和14示出了使用来自与图12中相同供体的新鲜PBMC，用Raji和Ramos靶B细胞进行的杂合变体v6751和v6754的独立重复实验的结果。将抗CD3-CD19变体的活性与阳性对照博纳吐单抗和抗CD19单特异性缀合物相比较。图13和14中的结果显示与非缀合的v6751和v6754相比在更高浓度下缀合物对靶B细胞耗竭的相似的额外活性。如由图10中的生长抑制测定所提示，该测定证实v6751和v6754缀合物对T细胞的意外差异，其中v6754缀合物对T细胞无影响，而介导靶B细胞的有力杀伤。除在先前实验(图11和12)中测量的B细胞耗竭和T细胞计数之外，还测量了PD-1的上调。PD-1在通过防止T细胞活化和促进T细胞细胞凋亡对免疫系统进行下调中起重要作用(FranciscoLM，SagePT，SharpeAH(Jul2010)ImmunologicalReviews236：219-42)。已推测PD-1上调是一种抵抗T细胞重定向疗法的机制[Junttila等人，CancerRes(2014)5561-71；2015]。如用PBMC和同种异体Raji细胞的图14中所示，所有变体(包括阳性对照博纳吐单抗)都在>80％的T细胞中诱导PD-1的上调且非缀合变体无显著的B细胞耗竭。缀合变体能够在更高浓度下耗竭RajiB细胞，而非缀合变体不能。另外，抗CD3-CD19缀合物与非缀合比较物相比显示在更高的浓度下较低的表达PD-1的T细胞％。博纳吐单抗的临床和临床前经验表明T细胞重定向反应具有高度的供体依赖性并且可受到T细胞免疫抑制机制的限制(2015)。如上所示，所有测试的双特异性物(包括博纳吐单抗)都诱导PD1的上调且在一些供体中，非缀合双特异性物对耗竭靶B细胞无效。相比之下，缀合的双特异性T细胞接合物在这些培养物中显示出活性，提示双重作用机制可潜在地克服具有高T细胞免疫抑制的患者中的受限功效。实施例11.双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物针对在无效应T细胞的培养基中生长的ALL、NHL肿瘤细胞系的细胞毒性为了测试具有改进的生物物理性质的人源化双特异性抗CD3-CD19变体的细胞毒性和效力(参见实施例3-5)，将选出的变体如实施例8中所述缀合至SMCC-DM1。v6751、v15192、v15193、v15194、v15195的所有SMCC-DM1缀合物具有超过70％的相当的产率、＞90％的纯度及3.1-3.5的药物/抗体比率(DAR)。细胞毒性程度是在不同CD19+非何杰金氏淋巴瘤(NHL)和急性淋巴细胞性白血病(ALL)肿瘤B细胞系的细胞培养物中与非特异性IgGSMCC-DM1缀合物(同种型DM1)相比且将缀合至奥瑞斯他汀的单特异性抗CD19抗体huBU12作为阳性对照进行测量。目前将单特异性抗CD19抗体huBU12评价为NHL和B-ALL的I期和II期临床试验中的MC-MMAF药物缀合物(denintuzumabmafodotin)(Gerber，Blood2009；AlbertsonTM，Proceeding：AACRAnnualMeeting2014)。对T细胞的影响是针对CD3+JurkatT细胞来测试。SMCC-DM1缀合物的潜在脱靶细胞毒性是针对不表达CD19或CD3的靶细胞系K562来测量。实验如实施例9中所详述进行。图15示出了靶细胞系的所选子集的结果且表9概括了与抗CD19抗体阳性对照比较的结果。表9：MCC-DM1药物缀合物针对在无T细胞的培养基中生长的ALL、NHL肿瘤细胞系的细胞毒性对于用*标注的结果，仅测量5分浓度曲线且Kd不以置信度来拟合。例如，＜5的结果表示在5nM的浓度下，超过50％的细胞被耗竭。用**标注的结果是指为针对鼠科v6751-SMCC-DM1缀合物收集的数据。如表9所示，双特异性抗CD3-CD19药物缀合物显示出对NHL和ALL肿瘤B细胞系的有力杀伤，而不显著影响JurkatT细胞的生长。所有抗CD3-CD19缀合物都显示针对不表达CD19或CD3的细胞系K562无脱靶活性，类似于非特异性IgG-SMCC-DM1对照(数据未示出)。另外，效力与阳性对照huBU12-MCC-DM1相当或更强且v15195-MCC-DM1在人癌细胞系中展现广泛的靶细胞细胞毒性杀伤。实施例12.双特异性非缀合的抗CD19-CD3和双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物针对在有T细胞的培养基中生长的肿瘤细胞系的细胞毒性SMCC-DM1缀合的和非缀合的变体v15195的靶B细胞细胞毒活性进一步与批准的治疗性抗体博纳吐单抗相比进行评估。双特异性变体v15195被特别选出，因为与博纳吐单抗相比有超过100倍较低的T细胞重定向效力。此较低的T细胞介导的效力足以在体外和体内介导靶B细胞杀伤，而与博纳吐单抗相比在1000倍较低浓度下造成较低的T细胞活化和增殖(参见实施例14)。重要的是，较低效力对T细胞重定向和DM1介导的细胞毒性产生相容效力且实现了双重作用机制。将双特异性抗CD3-CD19缀合物的细胞毒活性与非缀合的抗CD3-CD19变体和阳性对照BlinatumomabTM(博纳吐单抗，BiTETM)相比来测量。为了测量缀合物对T细胞群的作用，如实施例13中所述进一步分析T细胞活性、活化及增殖。用n＝4原代血液供体进行测定并且如上实施例11-14中所述进行实验设置。如图16中所示，非缀合的v15195与DM1缀合的v15195的活性的比较证实抗CD3-CD19缀合物对同种异体靶B细胞的细胞毒活性可由双特异性物的T细胞重定向活性介导，而且也可通过经由靶B细胞对抗原结合构建体的内化所递送的缀合药物来介导。此外，结果显示双重机制的有益之处在于非缀合的v15195与阳性对照博纳吐单抗两者在有效浓度下的T细胞介导活性是高度供体依赖性的且在此测定中不足以杀伤＞90％的靶B细胞。实施例13.双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物针对在有T细胞的培养基中生长的肿瘤细胞系的细胞毒性为了进一步测试双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物的活性，在不同的CD19+非何杰金氏淋巴瘤(NHL)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)肿瘤B细胞系与原代T细胞的共培养物中测量细胞毒性程度。在具有同种异体NHL或ALL细胞系的原代血培养物中测试变体v15195-MCC-DM1。实验设置如上实施例12中所述进行。图17示出了双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物对不同NHL及ALL靶B细胞系的有力杀伤且证实靶B细胞的优先杀伤，而不影响T细胞。T细胞计数不受影响直至50nM的最高测试浓度(数据未示出)。实施例14.双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物与博纳吐单抗和OKT3抗体相比的T细胞活化及增殖作用商用的治疗性抗体博纳吐单抗的临床给药受到毒性的限制，该毒性被认为是T细胞介导的且与T细胞增殖及活化的程度有关(Chatenoud，1986；Abramowicz，1989；Goebeler，2011；Bargou，2008；Topp，2011；Klinger，2010；国际专利公布号WO2011051307A1；GoebelerMEJClinOncol2016；Topp，LancetOncol2015)为了评估v15195的潜在治疗指数，在Raji癌B细胞与人PBMC的共培养物中评价v15195诱导T细胞活化及增殖的能力且在等同于临床容许暴露的浓度下与博纳吐单抗的体外活性相比较。(在1期r/r-NHL试验中博纳吐单抗的最大耐受剂量(MTD)为60μg/m2/天(GoebelerMEJClinOncol2016)；用于与博纳吐单抗的安全剂量及暴露比较，选择0.05nM博纳吐单抗或相当于在40μg/m2/天的剂量下暴露的浓度)。共培养实验如下进行：在第0天，从4个供体的每个中收集血液并新鲜分离PBMC。进一步加工PBMC以衍生出无B细胞的PBMC亚群(PBMC-B)。静息PBMC-B被用作效应细胞且Raji人B细胞用作靶细胞且T细胞与同种异体Raji细胞的比率被调节为5∶1的E∶T比率。将混合物与抗体构建体一起孵育3天，之后出于CD4、CD8、CD69、CD25FACS检测对收集的原代细胞进行染色。不同群的FACS分析通过InCyte/FlowJo如下进行：通过血细胞计数分析FSC/SSC和补偿孔的5,000个事件及实验孔的30,000个事件。阈值被设定为跳过碎片和RBC。图18A示出了针对CD8+T细胞群在72h孵育之后来自n＝4供体的结果。分析示出了总CD8+T细胞计数，其为诱导的T细胞增殖以及T细胞活化程度的间接量度，分别通过早期和晚期T细胞活化标记CD69和CD25(参见实施例10)来测量。结果显示在比体外EC50(参见图16和实施例12)高100-1000倍的有效浓度下，v15195与临床耐受浓度的博纳吐单抗相比诱导较低的T细胞增殖及活化。除诱导的T细胞增殖及活化的基于FACS的分析之外，还在PBMC培养物中在胸苷细胞增殖测定中评估v15195诱导的T细胞增殖，如图18B中所描绘。基于胸苷的测定提供T细胞增殖及活化的不同量度，因为它是PBMC培养物中的总诱导增殖潜力的量度。基于胸苷的分析对如上所述的基于FACS的方法提供补充措施。在图18B中所示的测定中，使用v15195的原始亲代鼠科变体，即v6751(参见表3)。在PBMC培养物中的胸苷细胞增殖测定如下进行：在第1天，从3个供体的每个中收集血液并新鲜分离PBMC。为0.3和100nM的最终浓度准备测试项目并与PBMC合并，以250,000个细胞/孔来铺板。将混合物孵育3天，之后将氚化胸腺嘧啶添加到含有细胞的孔中，达到0.5μCi胸苷/孔的最终浓度；再孵育这些板18小时，之后冷冻这些板。总孵育时间为4天。将板过滤并使用β-计数器进行计数(CPM)。如下由平均值计算刺激指数(SI)并将数据列表显示；仅测试项目的平均CPM/培养基的平均CPM。从健康供体中收集的人PBMC中的平均E∶T比率为～10∶1CD3+T细胞比CD19+B细胞。如图18B中所示，与博纳吐单抗和OKT3的比较证明甚至在1000倍更高浓度下在v6751培养物中的较低总细胞增殖。这表明双特异性CD19-CD3药物缀合物在直至最高评估浓度下不影响T细胞且进一步表明治疗指数与博纳吐单抗相比潜在地更高。实施例15：在人PBMC中双特异性异二聚体变体所致的T细胞活化的靶B细胞依赖性在人PBMC中测定示例性抗CD19-CD3-SMCC-DM1双特异性变体v15195所致的T细胞活化对靶B细胞的依赖性。实验如下所述进行。从供体中收集人血(120-140mL)并从供体中新鲜分离PBMC。进一步加工PBMC以衍生出无B细胞的PBMC亚群(PBMC-B)。将一式四份孔对于每个对照和实验条件铺板并且将PBMC培养物在5％CO2、37℃下孵育并在72小时时终止。通过FACS评价T细胞群。将细胞沉淀再悬浮于各种抗体混合物中用于流式细胞术分析。将Guava8HT流式细胞仪用于分析细胞亚群。使用抗CD19二价单特异性抗体(huB12；参见实施例11)和未处理的培养物作为阴性对照。结果示于图19中。结果表明v15195不活化缺乏B细胞的PBMC培养物中的T细胞，但在靶B细胞存在下活化T细胞。变体v15195显示出严格的靶标依赖性T细胞活化。实施例16.双特异性抗CD19-CD3-SMCC-DM1药物缀合物v15195与非缀合的v15195相比的T细胞活化、增殖及细胞因子释放双特异性SMCC-DM1缀合的与非缀合的构建体诱导T细胞增殖及活化的能力如下所述在两个不同测定中评价。用n＝4原代血液供体进行测定并且与实施例12和14一样进行实验设置。Raji/PBMC-B培养物中T细胞增殖/活化的FACS分析：在第0天，从4个供体的每个中收集血液并新鲜分离PBMC。进一步加工PBMC以衍生出无B细胞的PBMC亚群(PBMC-B)。静息PBMC-B被用作效应细胞且Raji人B细胞用作靶细胞且T细胞与同种异体Raji细胞的比率被调节为5∶1的E∶T比率。将混合物与抗体构建体一起孵育3天，之后出于CD4、CD8、CD69、CD25FACS检测对收集的原代细胞进行染色。Raji/PBMC-B共培养上清液的细胞因子分析：如上所述设置Raji共培养实验并且在孵育3天之后通过luminex评价IFN-γ、IL-6及IL-10的水平。在PBMC-B/Raii共培养物中T细胞增殖及活化的基于FACS的分析的结果示于图20A中。细胞因子产生呈现于图20B中。图20A和20B中的结果说明v15195与SMCC-DM1的缀合与非缀合的v15195相比在低浓度下增强T细胞增殖及活化。另外，SMCC-DM1缀合的v15195与非缀合的v15195相比增加促炎性细胞因子、IFN-γ及IL-6的产生。SMCC-DM1缀合的v15195仅诱导抗炎性细胞因子IL-10的适度增加，而非缀合的形式引起剂量依赖性增加。T细胞活化且尤其是细胞因子分布的差异是意外且相关的结果，由于例如IL10释放与T细胞抑制性机制(例如调节性T细胞扩增)有关，这限制了T细胞接合物的功效。双特异性T细胞接合物药物缀合物可因此潜在地较不易经历T细胞抑制性机制。另外，促炎性细胞因子INFγ(其为T细胞和巨噬细胞活化的关键调节剂)的释放增加具有协同并提高T细胞重定向活性的潜能。T细胞活化与细胞因子释放的这种差异是剂量依赖性的且与DM1介导的靶细胞耗竭的剂量反应有关，这提示该作用是由药物缀合物的活性所介导。如先前所报告，DM1和DM1-ADC可介导免疫原性细胞死亡且与像抗PD1和抗CTLA4的免疫调节因子高度协同(Mueller等人，ScienceTranslMed2015)。结果表明毒素像DM1的添加具有改进抗CD19-CD3双特异性的潜力，通过诱导免疫源性/促炎性细胞死亡实现(Mueller等人，ScienceTranslMed2015)。实施例17.缀合至MMAE的双特异性抗CD19-CD3针对在有T细胞的培养基中生长的肿瘤细胞系的细胞毒性为了进一步测试在不影响T细胞下靶B细胞的优先杀伤，使用可裂解的接头(马来酰亚氨基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基羰基(mc-vc-PABC))将v15193缀合至毒素MMAE。将双特异性抗CD3-CD19缀合物的细胞毒活性与非缀合的抗CD3-CD19变体相比在同种异体Ramos淋巴瘤细胞系的原代血培养物中进行测量。还评价了作为使用可裂解接头的药物缀合的结果对T细胞的可能的细胞毒性。为了制备抗体药物缀合物，首先将抗体以1mg/100μL树脂负载结合至“Lock-Release”树脂(ADCR01，ADCBiotechnologyLtd.)，即一种用于固定抗体以便缀合的专用树脂。然后通过将三(羧乙基)磷化氢(TCEP)在具有2mMEDTA的PBS(pH7.4)中的溶液以6摩尔当量TCEP与结合抗体添加至结合抗体中并在20℃下伴随连续混合孵育混合物120分钟来减少抗体二硫化物结合。通过用PBS(pH7.4)洗涤(x3)除去过量的TCEP。关于缀合，首先在含有5％(v/v)DMA的PBS中制备等于6摩尔当量接头毒素与结合抗体的mc-vc-PABC-MMAE(ADCBiotechnologyLtd.，参见以下结构)(在二甲基乙酰胺(DMA)中的10mM贮备液)的溶液。将此接头-毒素溶液添加到结合抗体中并且在20℃下伴随连续振荡孵育混合物60分钟。mc-vc-PABC-MMAE：缀合之后，通过在14800rpm下离心树脂2分钟除去过量的接头-毒素溶液。然后用含有5％(v/v)DMA的PBS洗涤树脂三次以除去任何残余接头-毒素，接着用PBS(pH7.4)洗涤三次以除去任何剩余的DMA助溶剂。通过在释放缓冲液(ADCBiotechnologyLtd.)中孵育树脂15分钟然后在14800rpm下离心2分钟使抗体-药物缀合物从树脂上释放。接着通过G25凝胶渗透色谱(GEHealthcareIllustraTMNAPTM-5柱)到含有10mM乙酸钠、9％蔗糖(pH5.0)的缓冲液中然后经由无菌0.22μmPES膜过滤来为滤液脱盐。通过在TSKgelG3000SWXL7.8mmx30cm，5μm柱(TOSOHBioscienceLLC)上在10％IPA、0.2M磷酸钾、0.25M氯化钾(pH6.95)中以0.5mL/min的流速进行高效液相色谱-尺寸排阻色谱(HPLC-SEC)来评价最终的抗体-药物缀合物的纯度。在Butyl-NPR4.6mmx3.5cm，2.5μm柱(TOSOHBioscienceLLC)上使用在0.8mL/min下以A-1.5M(NH4)2SO4、25mMNaPi(pH6.95)及B-25mMNaPi(pH6.95)、25％IPA的12分钟线性梯度运行的疏水性相互作用色谱(HIC)HPLC测定抗体-药物缀合物的药物与抗体比率(DAR)。v15193-mc-vc-PABC-MMAE缀合物的最终产率为39％，其中纯度>98％且平均DAR为3.7。为了测量缀合物对T细胞群的作用，如实施例14中所述进一步分析T细胞活性、活化及增殖。用n＝1原代血液供体进行测定并且如上实施例12中所述进行实验设置。如图21中所示，非缀合与MMAE缀合的双特异性变体(v15193对比v15193-mc-vc-PABC-MMAE(“v15193-vc-MMAE”))的活性比较证实抗CD3-CD19缀合物对同种异体靶B细胞的细胞毒活性可通过双特异性物的T细胞重定向活性介导，而且还可由经由靶B细胞对抗原结合构建体的内化所递送的缀合药物来介导。此外，结果出人意料地显示v15193-mc-vc-PABC-MMAE对T细胞计数几乎没有作用或无作用，提示双特异性T细胞接合物药物缀合物可用不可裂解的接头(如上所述)且用可裂解的接头如mc-Val-Cit-PABC来开发。实施例18.在人源化hu(CD34+)NSG小鼠中对示例性抗CD3-CD19抗原结合构建体药物缀合物的体内反应为了进一步评估抗CD3-CD19缀合物对T细胞群及活性的影响，在人源化小鼠中于体内研究中分析选出的变体。在v12043SMCC-DM1和SPDB-DM4缀合物的单剂量IV注射之后在人源化(CD34+)NSG小鼠(E∶T～1∶5)中与非缀合的v12043相比测量体内B细胞耗竭及自体T细胞的活化和重新分布。对于小鼠的人源化，用来自人胎肝脏(JacksonLaboratory的人(CD34+)HSC注射2周龄NSG(NODscidgamma，NOD.Cg-PrkdcscidI12rgtm1Wjl/SzJ)小鼠。人源化(CD34+)NSG小鼠在12周内发育了人T细胞和B细胞谱系。在人源化(CD34+)NSG中的平均T细胞与B细胞比率为～1∶5至1∶1。在第0天向人源化(hCD34+)NSG给予1次静脉内(IV)弹丸注射(以0.3和0.1mg/kg剂量)且在注射后48h及终止后第5天类似于先前所述(PCT/US2015/011664)分析自体循环B和T细胞群。通过FACS分析T细胞和B细胞群。所分析的特异性B和T细胞标记为人CD45、CD20、CD4、CD8及CD69，如上实施例10中所述。由NSG小鼠的先前数据估计如表5所示变体的体内血清暴露(参见PCT/US2015/011664)。表10：对于v12043所估计的血清暴露图22示出了在单剂量注射v12043和v12043SMCC-DM1及SPBD-DM4缀合物之后对循环中的B和T细胞计数的影响。如通过在CD4和CD8阳性T细胞上的CD69表达所测量，所有变体和剂量水平有效耗竭循环B细胞(CD20+B细胞)且在组之间观察到对T细胞计数和T细胞活化无显著差异。表10中血清暴露的预测提示Cmax接近50nM，这是原代血培养物的体外测定中所用的最大浓度。体内单剂量研究证实在甚至是0.3mg/kg的最高剂量和接近50nM的Cmax下，抗CD3-CD19缀合物对T细胞也没有负面影响。而且，缀合物不减少T细胞活化和对B细胞的T细胞重定向活性。实施例19.在hu(CD34+)NSG小鼠中抗CD3-CD19抗原结合构建体药物缀合物的体内反应为了进一步评估在更高剂量和超过300nM的最大暴露下抗CD3-CD19缀合物对T细胞及T细胞活化的影响，在人源化小鼠中于体内研究中分析v15195-MCC-DM1。在以9mg/kg、3mg/kg、1mg/kg及0.3mg/kg单剂量IV注射之后在人源化(CD34+)NSG-SGM3(NSG品系：NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtmlWjlTg(CMV-IL3，CSF2，KTTLG)1Eav/MloySzJ；Jacksonlaboratory)小鼠(E∶T＜1∶5)中测量自体T细胞的体内活化和重新分布。作为对照，使用其中仅抗CD19Fab连接到异二聚Fc但缺乏抗CD3scFv(v15760)的变体。如实施例8中所述将单特异性抗CD19对照变体v15760缀合至SMCC-DM1，其中纯度＞90％且DAR为3.5。人源化(CD34+)小鼠提供了一种良好的模型系统，以便在小鼠模型中评估人T细胞活化、重新分布及扩增，而人B细胞的增殖和成熟在这些模型中是部分缺乏的(Ito等人，Cellular&MolecularImmunology2012；9：208-214；Brehm等人，CurrOpinEndocrinolDiabetesObes.2010；17(2)：120-125)。因此，不期望看到缀合药物DM1对人B细胞的显著作用，而在这些模型中充分建立人T细胞活化和增殖且此项研究的主要目的是评价抗CD3-CD19双特异性药物缀合物对T细胞活化和扩增的影响。研究如先前在实施例18和PCT/US2015/011664中所述来进行。简言之，人源化的(hCD34+)NSG-SGM3小鼠是购自Jackson实验室。在第0天(以0.3、1、3及9mg/kg剂量)将双特异性抗CD3-CD19ADC，v15195-MCC-DM1以1次静脉内(IV)弹丸注射来给予且在终止后第8天类似于先前所述(PCT/US2015/011664)分析外周血液和分离的脾脏中的自体循环B和T细胞群。通过FACS分析T细胞和B细胞群。所分析的特异性B和T细胞标记为人CD45、CD20、CD4、CD8及CD69，如上实施例10和18中所述。图23示出了在单剂量注射后第8天时在外周血液和分离的脾脏中的总CD3+T细胞计数。结果表明仅在选出的最高剂量9mg/kg下观察到循环中和脾脏中对T细胞的显著作用。在3mg/kg及较低剂量下未观察到对T细胞计数和活化的影响。由NSG小鼠中非缀合变体的先前数据(PCT/US2015/011664)估计如表11所示v15195的体内血清暴露。表11中估计的血清暴露提示双特异性T细胞接合物-MCC-DM1缀合物可给药直到至少3mg/kg及＞300nM的相关Cmax，而不对自体T细胞有长期影响。这是类似于临床开发中的其它SMCC-DM1抗体药物缀合物的暴露和Cmax且因此允许开发在作为开发中其它-MCC-DM1ADC的标准的剂量水平下的T细胞接合物药物缀合物(Jumbe等人，JPharmacokinetPharmacodyn(2010)37：221-242；Lu等人，CancerChemotherPharmacol(2014)74：399-410)。表11：估计的血清暴露实施例20.用于实体肿瘤适应症的双特异性抗肿瘤CD3抗原结合构建体的表达和纯化如PCT/US2015/011664中所述设计、表达及表征针对CD3及CDH3、HER2、HER3或EGFR的双特异性抗体。简言之，使用为人/哺乳动物表达而优化的密码子，经由基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。scFv-Fc序列是由已知的抗CD3scFvBiTETM抗体(Kipriyanov等人，1998，Int.JCancer：77，763-772)和抗CD3单克隆抗体OKT3(DrugBankreference：DB00075)生成。CDH3Fab序列是由已知的抗CDH3单克隆抗体生成(PCT/JP2009/007333)。HER2Fab序列是由曲妥单抗(PCT/US1998/026266，BaselgaJ等人，1998，CancerRes：58，2825-31)生成且HER3Fab序列是由已知的抗HER3单克隆抗体(PCT/EP2010/070062，MirschbergerC等人，2013，CancerRes：73，5183-94)生成。EGFR序列是由西妥昔单抗(PCT/US1996/009847，PrewettM等人，1996，JImmunotherEmphasisTumorImmunol：19，419-27)生成。制得的Fab-scFv变体描述于表12中。如上所述，与鼠科OKT3变体v875或人源化OKT3变体v15195的抗CD3scFv相同，生成人源化抗CD3OKT3scFv。如(US20110275787A1)中所述，抗CD3BiTEx-IC2scFv是由VH和VH序列生成，其与非黑猩猩灵长类动物CD3有交叉反应性。将人源化OTK3scFv或BiTEx-IC2scFv融合至异二聚Fc的一条链中。抗CDH3单克隆、克隆#6Fab是使用分别融合至人IgG1CH和CL序列的鼠科克隆#6VH和VL序列的嵌合Fab。抗HER2单克隆Fab是由分别融合至人IgG1CH和CL序列的曲妥单抗的人源化VH和VL序列组成。抗HER3单克隆的Fab为lumretuzumab的人源化VH和VL序列(PCT/EP2010/070062；MirschbergerC.等人，2013，CancerRes.，73：5183-94)分别与人IgG1CH和CL序列的融合物。抗EGFR单克隆、西妥昔单抗Fab是使用分别融合至人IgG1CH和CL序列的鼠科西妥昔单抗VH和VL序列的嵌合Fab。在所有情形下，将抗体的VH-CH结构域融合至异二聚Fc的第二链中。表12：变体及组成的概述所有变体具有以下CH3突变：重链A：T350V_L351Y_F405A_Y407V；重链B：T350V_T366L_K392L_T394W。链A或B可在抗CD3或抗肿瘤抗原链上。Fc编号是根据如Kabat中的EU索引，EU索引是指EU抗体的编号(Edelman等人，1969，ProcNatlAcadSciUSA63：78-85)；Fab或可变结构域编号是根据Kabat(Kabat和Wu，1991；Kabat等人，Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.第5版-USDepartmentofHealthandHumanServices，NIHpublication第91-3242期，第647页(1991))。将对应于每个双特异性抗肿瘤CD3及抗原结合构建体的克隆示于表XX中，且将每个克隆的相应序列组成示于表YY中。如PCT/US2015/011664及实施例1和2中所述设计、表达及表征针对CD3及CDH3、HER2、HER3或EGFR的双特异性抗体。双特异性抗体通过蛋白质A亲和色谱法及后续的凝胶过滤来纯化，如实施例1中所述。实施例21.双特异性抗肿瘤CD3DHAb缀合物在实体肿瘤细胞系及JurkatT细胞系上的体外内化pHAb染料与抗体的缀合是一种用于评价细胞对给定抗体的内化的方法。染料仅在低pH条件下发荧光，如核内体/溶酶体中所见的那些，表明抗体的内化。示例性双特异性抗肿瘤-CD3抗原结合构建体pHAb缀合物如下制造。根据溶液中抗体缀合的制造商方案(Promega)将变体缀合至pHAb胺活性染料。首先使用脱盐柱在10mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)中交换起始蛋白质样品。然后将pHAb胺活性染料溶于1∶1DMSO-水混合物中的10mg/ml溶液以20摩尔过量添加到抗体样品中。将反应混合物伴随混合孵育60分钟。使用脱盐柱除去未反应的染料。在280nm和532nm下测量吸光度之后计算抗体浓度及DAR。使用Superdex200柱(8.6μm，5x150mm)在D-PBS+0.01％聚山梨醇酯20中以0.25ml/min的流速进行高效液相色谱-尺寸排阻色谱(HPLC-SEC)以测定缀合物的纯度。v13831、v16371的pHAb缀合物具有超过60％的产率、＞90％的通过HPLC-SEC测得的纯度及1.5-3.3的药物/抗体比率(DAR)。在若干肿瘤细胞系SKOV3(ATCC：HTB77)、A431(ATCC：CRL-1555)、HCT-116(ATCC：CCL-247)及JIMT1(AddexBio#C0006005)中与非特异性IgGpHAb缀合物(v15195)和抗CD3pHAb缀合的mAb，v2171(UCHT1，BeverleyPC和CallardRE.，1981，EurJImmunol.，11：329-34；PCT/US1993/007832)相比测量内化程度。抗RSV抗体Synagis(PCT/US1991/002668)被用作阴性对照。对T细胞的影响是针对CD3+JurkatT细胞来测试。将选出的抗体在培养基中稀释并且一式三份添加到靶细胞中并孵育1小时。洗涤细胞，更换培养基并遵循标准工序，使用ImageExpress评估抗体内化。将数据针对未治疗的对照来归一化并且在GraphPadprism中进行分析。如图24和表13中所示的内化结果表明，pHAb缀合的v13831和v16371被SKOV3、A431、HCT-116及JIMT1细胞快速地内化，其中Kd值在nM范围内且变体的内化取决于靶抗原的表达。出人意料地，这些变体被JurkatT细胞系不良内化。此外，二价抗CD3pHAb缀合的mAb(v2171，UCHT1)被Jurkat细胞在接近2nM下内化，而靶向稍微不同的CD3e表位(OKT3和xBiTE)的基于两个不同抗CD3scFv的双特异性物显示在JurkatT细胞中的低内化(分别是72nM和＞100nM)。因此，数据表明双特异性肿瘤CD3抗体与CD3+细胞相比被肿瘤细胞优先内化，使得ADC形式的这些双特异性物不太可能展现对由CD3臂接合的T细胞的毒性。表13：通过肿瘤细胞系的pHAb缀合的双特异性肿瘤-CD3变体的差异内化*估计的EC50；参数的精确拟合之所以不可能是由于在超过100nM的抗体浓度下提高的背景水平(参见图24用于比较)。结果进一步说明，具有双重功能性的双特异性T细胞接合物的概念(如实施例1-14中针对CD19-CD3双特异性物所建立)可扩展至不同的实体肿瘤抗原及实体肿瘤靶向的双特异性T细胞接合物。在不影响T细胞下优先的肿瘤靶向对CD19抗原无特异性，且如实施例9中所述用于设计双特异性T细胞接合物ADC的概念可转移到不同的肿瘤靶标。另外，对T细胞的低影响对CD3e上的具体表位无特异性，但可能更取决于如实施例9中所述的双特异性物的形式和几何结构。实施例22.双特异性抗肿瘤CD3-SMCC-DM1药物缀合物针对在无T细胞的培养基中生长的乳腺、卵巢肿瘤细胞系的细胞毒性为了测试双特异性抗肿瘤CD3变体的细胞毒性和效力，如实施例8中所述将选出的变体缀合至SMCC-DM1。v13831、v13792及v13790的所有SMCC-DM1缀合物具有超过70％的相当的产率、>90％的纯度及3.1-3.5的药物/抗体比率(DAR)。细胞毒性的程度是在不同乳腺(MCF7(ATCC：HTB-22)和JIMT1)和卵巢(SKOV3)肿瘤细胞系的细胞培养物中与非特异性IgGSMCC-DM1缀合物(同种型DM1)相比进行测量。对T细胞的影响是针对CD3+JurkatT细胞来测试。实验如实施例9中所详述进行。图25示出了靶细胞系的所选子集的结果且表14概括了与IgG-DM1对照比较的结果。如图25和表14中所示的细胞毒性研究结果显示，DM1缀合的变体、v13831、v13792加v13790展现有力的乳腺和卵巢肿瘤细胞系杀伤，但不显著地影响JurkatT细胞的生长。肿瘤细胞系的此优先杀伤类似于实施例22中所示的通过肿瘤细胞系的变体的优先内化。非特异性变体v6249-SMCC-DM1直到使用大于100nM的浓度才展现肿瘤细胞系或JurkatT细胞的显著杀伤。这突出了靶标特异性在抗肿瘤CD3双特异性抗体的活性中发挥的作用。表14：SMCC-DM1药物缀合物针对在无T细胞的培养基中生长的乳腺、卵巢肿瘤细胞系的细胞毒性因此，数据表明，像CD19-CD3双特异性物一样，双特异性抗肿瘤-CD3药物缀合物与CD3+细胞相比优先杀伤肿瘤细胞。由此进一步支持以下结论：双特异性ADC具有有力的抗肿瘤活性，同时对由CD3臂接合的T细胞几乎不或不展现毒性。实施例23.非缀合的和SMCC-DM1缀合的抗肿瘤CD3双特异性物针对在有T细胞的培养基中生长的肿瘤细胞系的细胞毒性为了进一步测试在不影响T细胞及T细胞活性下靶肿瘤细胞的优先杀伤，在用同种异体JIMT1细胞系的原代血培养物中测试选出的变体。将双特异性抗CD3肿瘤缀合物的细胞毒活性与非缀合的抗CD3肿瘤变体相比进行测量。为了测量缀合物对T细胞群的作用，如实施例23中所述进一步分析T细胞活性、活化及增殖。用n＝1原代血液供体进行测定并且如上实施例5中所述且稍作改动进行实验设置。具体来说，在第0天，首先用CellTracer紫(活/死染色)标记JIMT1细胞。JIMT1靶细胞的标记之后，分离PBMC用作效应细胞。将静息PBMC与标记的JIMT1细胞混合以便将T细胞与同种异体JIMT1细胞的比率调节至2∶1的E∶T比率。将混合物与抗体构建体一起孵育4天，之后收集JIMT1细胞并且经由CTV水平的FACS分析评价活力。通过InCyte/FlowJo如下来进行：通过血细胞计数分析FSC/SSC和补偿孔的5,000个事件及实验孔的30,000个事件。阈值被设定为跳过碎片和RBC。如图26中所示，非缀合的和SMCC-DM1缀合形式的变体，即v13831和v13792对JIMT1细胞展现有力的细胞毒活性。结果显示，对同种异体靶肿瘤细胞的此细胞毒活性可通过双特异性物的T细胞重定向活性来介导。有趣的是，变体v13831和v13792的SMCC-DMl缀合与非缀合形式的这些变体相比在大于0.05nM的浓度下增强肿瘤细胞杀伤。这可能是经由抗原结合构建体的内化向靶肿瘤细胞的药物递送的结果。此外，结果显示，双重机制的有益之处在于非缀合变体的T细胞介导的活性是高度供体依赖性的且在此测定中不足以杀伤＞90％的靶肿瘤细胞。实施例24.双特异性抗肿瘤CD3-SMCC-DM1药物缀合物与非缀合的抗肿瘤CD3双特异性物相比的T细胞增殖及活化SMCC-DM1缀合的双特异性物、抗CDH3-CD3和抗HER2-CD3、及它们的亲本非缀合构建体诱导T细胞活化和增殖的能力如下所述进行评价。在第0天，从4个供体的每个中收集血液并新鲜分离PBMC。静息PBMC被用作效应细胞且JIMT1细胞用作靶细胞且T细胞与同种异体JIMT1细胞的比率被调节至2∶1的E∶T比率。将混合物与抗体构建体一起孵育4天，之后出于CD4、CD8、CD69及CD25对收集的原代细胞进行染色。不同群的FACS分析通过InCyte/FlowJo如下进行：通过血细胞计数分析FSC/SSC和补偿孔的5,000个事件及实验孔的30,000个事件。阈值被设定为跳过碎片和RBC。在PBMC/JIMT1共培养物中T细胞增殖及活化的基于FACS的分析的结果示于图27中。结果说明在有效浓度下，SMCC-DM1缀合的变体与非缀合的亲本变体相比诱导总CD8+和CD4+T细胞群的适度增加。总CD8+和CD4+T细胞计数是诱导的T细胞增殖的间接量度，提示毒素与抗肿瘤CD3双特异性物的缀合可增强由非缀合双特异性物诱导的T细胞增殖。类似地，与非缀合变体相比，当用SMCC-DM1缀合变体刺激共培养物时还观察到CD25+和CD69+(分别是早期和晚期T细胞活化标记)T细胞的适度增加，提示增强的T细胞活化。实施例25.双特异性抗肿瘤CD3-SMCC-DM1药物缀合物与非缀合的抗肿瘤CD3双特异性物相比的T细胞增殖和活化-高、中和低效应物与靶标比率的范围为了进一步描述双特异性抗肿瘤CD3-SMCC-DM1药物缀合物的每个作用机制(即T细胞重定向的杀伤和经由缀合毒素有效负载的内化的杀伤、抗CD3-CDH3缀合物的细胞毒活性)的作用，与其非缀合的亲本v13831相比来测量v13831-SMCC-DM1。在用同种异体JIMT1细胞系的原代血培养物中以三个不同的E∶T比率测试变体。用n＝1原代血液供体进行测定。在第0天，首先用CellTracer紫(活/死染色)标记JIMT1细胞。JIMT1靶细胞的标记之后，分离PBMC用作效应细胞。将静息PBMC与标记的JIMT1细胞混合以便将T细胞与同种异体JIMT1细胞的比率调节至5∶1、1∶5和1∶50的E∶T比率。将混合物与抗体构建体一起孵育4天，之后收集JIMT1细胞并且经由CTV水平的FACS分析评价活力。通过InCyte/FlowJo如下来进行：通过血细胞计数分析FSC/SSC和补偿孔的5,000个事件及实验孔的30,000个事件。阈值被设定为跳过碎片和RBC。图28中所示的结果提示在更高的E∶T比率(例如5∶1)下，双特异性抗CDH3-CD3抗体v13831对同种异体靶肿瘤细胞的细胞毒活性可通过双特异性物的T细胞重定向活性介导。因此，由于效应T细胞数量的减少，正如在1∶5和1∶50E∶T比率下的情况那样，肿瘤细胞杀伤几乎丧失。与非缀合变体不同，v13831-SMCC-DM1甚至在较低的E∶T比率(1∶5和1∶50)下也是有效的，这是第二作用模式的结果，即经由抗原结合构建体的内化向靶肿瘤细胞的药物递送。因此，数据进一步支持双重作用机制的有益之处是在于非缀合变体的T细胞介导的活性是高度供体依赖性的且在此测定中不足以杀伤＞90％的靶肿瘤细胞，特别是当效应T细胞浓度较低时。在其中肿瘤的T细胞浸润较低的适应症中这可能特别重要。表XX当前第1页1 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