硫醇被广泛地用在非常多的领域中，例如作为调味剂，用于气体的添味剂，聚合中的链转移剂，用于药物或化妆品工业的原料，用于合成抗氧化剂，用于润滑的极压或抗磨添加剂。这些实例并不以任何方式限制目前已知的硫醇的用途并且硫醇可以通过本发明的方法进行制备。
特别地，硫醇中的第一种，甲硫醇(CH3SH)具有巨大的工业益处，特别是作为合成甲硫氨酸的原材料，甲硫氨酸是非常广泛用于动物饲料中的必需氨基酸。甲硫醇也是非常广泛用于合成许多其它分子的原材料。
硫醇可以通过许多方法合成，例如醇的氢硫化，硫化氢在不饱和有机化合物上的催化或光化学加成，卤化物、环氧化物或有机碳酸酯用硫化氢的取代等。
特别地，目前甲硫醇根据反应(1)使用甲醇和硫化氢的在工业上大量吨级地进行生产：
CH3OH + H2S → CH3SH + H2O (1)
这些方法具有需要甲醇(CH3OH)、合成硫化氢(H2S，例如使用氢和硫，由此需要合成氢)的缺点，并且产生二甲醚(CH3OCH3)，二甲基硫醚(CH3SCH3)类型的副产物和裂解产物和水，这意味着许多甲硫醇的纯化步骤。
作为实例，基于这些反应的方法的描述将在以下专利申请中找到，如WO2013092129，WO2008118925，WO2007028708，WO2006015668和WO2004096760。
希望根据以下合成方案(2)从一氧化碳，氢气和硫化氢生产甲硫醇可以显示在经济上是有利的(为了避免合成甲醇)：
CO + 2 H2 + H2S → CH3SH + H2O (2)
然而，这些方法具有以下缺点：需要合成气(CO/H2)并且因此进行烃来源的蒸汽重整，具有在CO和H2之间的正确比例，并因此能够使用被称为“水煤气变换反应”(CO+H2O→CO2+H2)调整CO/H2比，并合成H2S。
这些方法通常还产生大比例的CO2作为副产物，并且还产生甲烷，二甲基硫醚和水。作为例子，这些方法的描述将在以下专利申请中找到：US2010286448，US2010094059，US2008293974，US2007213564。
还已经描述了其它方法，并且结合了不同的反应，如：
•由甲烷和硫形成CS2和H2S(3)：
CH4+4S→CS2+2H2S (3)
•CS2的氢化(4)：
CS2+3H2→CH3SH+H2S (4)
还可以在与甲醇的反应(反应1)或与合成气的反应(反应2)中使用来自反应(3)和(4)的过量H2S以进一步得到甲硫醇。
这些方法明显地兼具了对于反应(1)和(2)所描述的缺点与需要过量氢以进行反应(4)的额外困难。这些方法的描述可以在专利申请US2011015443中找到，或者更具体地在申请WO2010046607中关于反应(4)的描述。
申请WO200196290提出了一种直接从甲烷和H2S合成甲硫醇同时共生成氢的方法。在甲烷和H2S之间的这种直接反应借助于使用电晕放电的脉冲等离子体来进行。由于该申请没有描述合成的任何实例，因此可能看起来难以想象使用该技术的大规模工业合成甲硫醇的方法。而且，如果H2S不可获得的话，该方法需要合成H2S。
专利申请EP0649837其本身提出了通过二甲基二硫醚与氢的催化氢解(使用过渡金属硫化物)合成甲硫醇的方法。虽然这种方法是高效的，但它需要约200℃的相对较高的温度以获得工业上有利的生产率。
本领域技术人员也知道可以通过甲基硫醇钠(CH3SNa)的水溶液的酸化来制备甲硫醇。根据使用盐酸或硫酸，这种方法具有产生大量盐例如氯化钠或硫酸钠的主要缺点。这些盐水溶液通常非常难以处理，并存在微量的恶臭产物使得该方法在工业规模上是难以设想的。
合成比甲硫醇的更高级的硫醇的方法也具有许多缺点。因此，用硫化氢取代醇需要高温并通常地需要高压，并且产生烯烃，醚和硫化物类型的不希望的副产物。
硫化氢在不饱和化合物上的催化或光化学加成通常在比上述稍微更温和的条件下发生，但也产生许多由于原料异构化(通过非区域选择性加成或通过形成硫化物的二次加成)所形成的副产物。最后，卤代衍生物的替代反应导致了产生大量流出物和盐水废物的过程，这些过程难以与工业方法相容。
本发明的主题是提出制备硫醇特别是甲硫醇的新型方法，其不具有上述现有技术中已知的方法中所述的缺点。
更特别地，本发明的第一主题是用于制备式R-SH的硫醇的方法，其至少包括以下步骤：
a)制备混合物，其包含：
1)式R-S-S-R'的二硫化物，
2)催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
3)催化量的用于催化在两当量的所述带有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽之间产生的二硫键的还原反应的酶，
4)催化量的用于催化在步骤b)中使用的有机还原化合物的脱氢反应的酶，
5)催化量的两种用于催化还原反应和脱氢反应的酶的共同辅因子，
b)以相对于式R-S-S-R'的二硫化物化学计量的量加入有机还原化合物，
c)进行酶促反应，
d)回收式R-SH的硫醇和式R'-SH的硫醇，
e)任选地分离和纯化式R-SH的硫醇和式R'-SH的硫醇。
一般而言，用于催化在两当量所述带有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽之间产生的二硫键的还原反应的酶是还原酶。在说明书的其余部分中使用术语“还原酶”来解释本发明。类似地，用于催化在步骤b)中使用的有机还原化合物的脱氢反应的酶通常称为脱氢酶，在说明书的其余部分中选择术语“脱氢酶”用于解释本发明。
在催化还原反应和脱氢反应的两种酶(还原酶和脱氢酶)的共同的辅因子中，作为非限制性实例，可以提及黄素辅因子和烟碱辅因子。优选使用烟碱辅因子，更特别地烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，更好地烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)。上面列出的辅因子有利地以其还原形式(例如NADPH，H+)和/或它们的氧化形式(例如NADP+)使用，也就是说，它们可以以这些还原和/或氧化形式加入到反应介质中。
在本发明的一个实施方案中，带有巯基的氨基酸和/或含巯基的肽可以分别为所述氨基酸和/或所述肽的二硫化物形式，例如呈谷胱甘肽二硫化物的形式的谷胱甘肽。
上面定义的方法的步骤a)和b)的不同组分的添加的组织和顺序可以以不同的方式实施。在任何情况下，步骤c)的酶促反应都是通过添加催化体系的组分中的一种引发的：或者是酶，或者是按化学计算量添加的化合物之一(二硫化物或有机还原化合物)，或者是以催化量加入的化合物中的一种(带有巯基的氨基酸或含巯基的肽或对应于所述分子的二硫化物或辅因子)。
更特别地，本发明的主题是制备式R-SH硫醇的方法，其至少包括以下步骤：
a')制备混合物，所述混合物包含：
·式R-S-S-R'的二硫化物，
·催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
·催化量的对应于所述带有巯基的氨基酸或含有所述含巯基的肽的还原酶，
•催化量的NADPH，
b')与催化量的相应的脱氢酶一起加入相对于二硫化物和DMDS化学计量的量的有机还原化合物，
c')进行酶促反应，
d')回收式R-SH的硫醇和式R'-SH的硫醇，
e')任选地分离和纯化式R-SH的硫醇和式R'-SH的硫醇。
在本发明的上下文中，对应于通式R-S-S-R'的任何二硫化物可以参与生产硫醇的方法中。在通式R-S-S-R'中，R和R'是相同或不同的，彼此独立地表示包含1至20个碳原子的线性，支化或环状的烃基团，所述链是饱和的或带有一个或多个呈双键或三键形式的不饱和。R和R'也可以一起并且与携带它们的硫原子一起形成包含4至22个原子，优选5至10个原子的环状分子。
根据一个优选的方面，基团R和R'，是相同或不同的，彼此独立地选自线性或支化，饱和或不饱和的烃基，环烃基，芳基，烃芳基，芳烃基，其包含1至20个碳原子，优选1至12个碳原子，还更优选1至6个碳原子，并且任选通过一个或多个非限制性和举例性选自醇，醛，酮，酸，酰胺，腈，酯官能团或带有硫，磷，硅或卤素的官能团进行官能化。
根据本发明的方法，式R-S-S-R'的二硫化物能够被还原成式R-SH的硫醇和式R'SH的硫醇。当R不同于R'时，称为不对称二硫化物，并且当R和R'相同时，称为对称二硫化物。在对称二硫化物R-S-S-R的情况下，本发明的方法产生式R-SH的硫醇。根据本发明的一个特别优选的方面，使用二甲基二硫醚(DMDS)以生产甲硫醇CH3SH。
在不对称二硫化物R-S-S-R'的情况下，本发明的方法产生式R-SH和R'-SH的硫醇混合物，其可以原样进行使用或经受一种或多种本领域技术人员熟知的分离操作，例如蒸馏。
在本发明的方法中还可以使用一种或多种对称和/或不对称二硫化物的混合物。可能的二硫化物混合物可以包含DSO(二硫醚油)，因此所述DSO找到非常有利的增值可能性。
根据本发明的方法，所生产的一种或多种硫醇通常以固体，液体和/或气体的形式进行回收。
根据本发明的生产方法基于二硫化物，特别是二甲基二硫醚用有机还原化合物(其为氢供体，以及将在下面进行定义)根据以下反应的酶促还原反应，该反应用二甲基二硫醚(产生甲硫醇)进行说明，通过使用葡萄糖作为有机还原化合物(氢供体)：
。
现在已经发现，该反应容易通过采用含巯基的氨基酸或含巯基的肽(例如谷胱甘肽)的酶体系进行催化，该酶体系呈(氨基酸或肽)/相应的还原酶的复合物形式，通过供氢有机化合物进行再生，如附图1中所述。
因此，根据图1中的说明，肽(用“谷胱甘肽”代表)，通过转化成具有二硫键的肽(用“谷胱甘肽二硫化物”代表)，将二硫化物(用“DMDS”代表)还原成硫醇(用“甲硫醇”代表)。还原酶(用“谷胱甘肽还原酶”代表，酶分类号EC1.8.1.7或EC1.6.4.2)使该肽(谷胱甘肽)再生，并且该相同的酶通过本领域技术人员熟知的氧化还原酶复合物，例如NADPH/NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(还原形式和氧化形式))复合物进行再生。借助于通过所述转化成其氧化形式(用葡糖酸内酯代表)而提供氢(氢供体)的有机还原化合物(用葡萄糖表示)使用对应于所用的有机还原化合物的“脱氢酶”(这里，葡萄糖-脱氢酶，EC1.1.1.47)，NADP+又被再生成NADPH。
换句话说，催化还原反应的酶(用“谷胱甘肽还原酶”代表，例如酶分类号EC1.8.1.7或EC1.6.4.2)在氧化该辅因子(用“NADPH，H+”代表)的同时使肽(“谷胱甘肽”)再生。该氧化形式(用“NADP+”代表)然后通过本领域技术人员公知的称为“再循环”的氧化还原酶复合物进行还原，该复合物包含所使用的脱氢酶(用“氢脱氢酶”代表，具有例如酶分类号EC1.1.1.47)和有机还原分子(用“葡萄糖”代表)。这时获得该有机还原化合物的氧化形式(用“葡萄糖酸内酯”代表)。
根据一种最特别适合的实施方案，与谷胱甘肽-还原酶结合的谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫化物体系根据本发明允许将DMDS还原成甲硫醇。
谷胱甘肽是广泛用于生物学的三肽。这种呈还原形式(谷胱甘肽)或氧化形式(谷胱甘肽二硫化物)的物质在细胞中形成重要的氧化还原对。因此，谷胱甘肽对消除生物体中的重金属至关重要。因此，例如，申请WO05107723描述了其中使用谷胱甘肽来形成螯合制品的制剂，并且专利US4657856教导了谷胱甘肽还允许通过谷胱甘肽过氧化物酶将过氧化物例如H2O2分解成H2O。最后，谷胱甘肽还可以还原在蛋白质中存在的二硫键(Rona Chandrawati, "Triggered Cargo Release by Encapsulated Enzymatic Catalysis in Capsosomes", Nano Lett., (2011), vol. 11, 4958-4963)。
根据本发明的方法，催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽用于从二硫化物生产硫醇。
在可用于本发明方法中的带有巯基的氨基酸中，作为非限制性实例，可以提及半胱氨酸和高半胱氨酸。用于可以以相同方式使该催化循环物再生的所使用的氧化还原酶体系在这些情况下是半胱氨酸/胱氨酸-还原酶体系EC1.8.1.6和高半胱氨酸/高半胱氨酸-还原酶。
在可用于本发明方法中的带有巯基的肽中，作为非限制性实例，可以提及谷胱甘肽和硫氧还蛋白。上述谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶体系因此可以被硫氧还蛋白(CAS No.52500-60-4)/硫氧还蛋白还原酶(EC1.8.1.9或EC1.6.4.5)体系代替。
谷胱甘肽和谷胱甘肽/谷胱甘肽还原酶体系对于本发明是最特别优选的，这是由于这些化合物的成本和它们易于获得的缘故。
在可用于本发明范围内的有机还原化合物中，供氢化合物是最特别优选的，并且在其中完全合适的化合物是带有羟基官能团的供氢有机还原化合物，如醇，多元醇，糖等。
所使用的酶是能够使含氢化合物脱氢的酶，例如醇-脱氢酶。葡萄糖是最特别适合用于本发明方法中的糖，同时使用葡萄糖-脱氢酶，以产生葡糖酸内酯。
在根据本发明的方法中，仅仅二硫化物和葡萄糖是以化学计量的量进行使用，所有其它组分(氨基酸或肽，辅因子(例如NADPH)和2种酶)以催化量进行使用。
由本发明的方法带来的优点很多。在这些优点中，可以提到在非常温和的温度和压力条件下和在接近中性的pH条件下在水性或水性-有机溶液中工作的可能性。所有这些条件都是典型的“绿色”或“可持续”生物催化方法。
当该方法使用二甲基二硫醚时的另一个优点是产生的甲硫醇，其在反应条件下处于气态，在随着它形成期间而离开反应介质。因此，甲基硫醇在离开反应器时可直接用于更下游的应用中。例如，如果需要将其分离，它也可以容易地通过低温进行液化。任选地可以通过鼓泡引入低流速的氮气来加速其与反应介质的分离。
二甲基二硫醚(DMDS)可以在其它地方从甲硫醇和氧化剂例如氧气，硫或过氧化氢水溶液，或者从硫酸二甲酯和二硫化钠进行制备。如上所述，DMDS也可源自“二硫醚油”源(DSO)，然后例如通过如在申请WO2014033399中所述的反应蒸馏来纯化。应该注意的是，DSO也可以按原样使用，而不需要在组成它们的不同二硫化物之间的纯化。然后通过应用本发明的方法获得硫醇的混合物。
当DMDS用作二硫化物时，根据本发明的方法这时可以被认为是允许避免将甲硫醇从其生产地点通过现有工业路线运输到其使用地点(如果它们是不同的话)的方法。事实上，甲硫醇在室温下是一种有毒且极臭的气体，这极大地使运输复杂，与DMDS不同，它已经受到严格管理。因此，本发明中描述的方法可以用于直接在后者的使用地点上生产甲硫醇。
由于DMDS在反应中被消耗，并且甲硫醇随着它形成而离开反应介质，因此假设连续地进料葡萄糖和DMDS，则只有有机还原化合物例如葡糖酸内酯的脱氢产物在反应介质中积累。当葡糖酸内酯浓度在反应条件下超过饱和点时，它将沉淀出来，然后可以通过本领域技术人员已知的任何方式从反应介质中分离出来。
葡糖酸内酯可以具有多种用途。它例如用作为食品添加剂，以缩写E575已知。葡糖酸内酯在酸性水介质中水解以形成葡萄糖酸，其也用作为食品添加剂(E574)。葡糖酸内酯也用于食品工业的豆腐生产(参见CN103053703)。
特别地且有利地，葡糖酸内酯，在其中它代表来自根据本发明的方法的“废物”的意义上来说，可以在任选的发酵反应中替代葡萄糖以生产生物乙醇或来自糖或淀粉发酵的任何其它分子。
实际上，某些细菌可以在发酵中使用葡糖酸内酯作为碳源，如由J. P. van Dijken在"Novel pathway for alcoholic fermentation of gluconolactone in the yeast Saccharomyces bulderi", J. Bacteriol., (2002), Vol. 184(3), 672-678中所描述。
在本发明的方法中还可以使用其它糖，例如可以用以下体系代替葡萄糖/葡糖酸内酯/葡萄糖-脱氢酶体系：葡萄糖-6-磷酸酯/6-磷酸葡糖酸-δ-内酯/葡萄糖-6-磷酸酯脱氢酶(EC 1.1.1.49)。
在本发明的方法中，还可以使用醇代替糖，并因此使用以下通用体系代替葡萄糖/葡糖酸内酯/葡萄糖-脱氢酶体系：醇/酮或醛/醇-脱氢酶(EC 1.1.1)，更特别是异丙醇/丙酮/异丙醇-脱氢酶体系(EC 1.1.1.80)。
实际上，当使用DMDS作为二硫化物时，该体系允许获得由甲硫醇(MeSH)和离开反应介质的丙酮组成的混合物(因此不累积任何产物)。如果需要，MeSH和丙酮可以通过简单的蒸馏容易地进行分离。在其它二硫化物的情况下，根据形成的硫醇的沸点和其在反应介质中的溶解度，丙酮可以容易地从介质中被取出，并且硫醇可以任选地从反应介质中沉降出，以便容易进行分离。
通常，反应温度在10℃至50℃，优选15℃至45℃，更优选20℃至40℃的范围内。
反应的pH可以在6-8之间，优选在6.5-7.5之间。反应介质的pH值可以通过缓冲液来调节。完全优选地，磷酸盐缓冲液的pH将被选择在7.3。
根据所使用的试剂和材料，用于反应的压力可以是从相对于大气压的减压至几巴(几百kPa)。在使用DMDS作为二硫化物的情况下，降低的压力实际上能够使所形成的甲硫醇更快地脱气，但是具有增大水和DMDS的饱和蒸汽压的缺点，它们稍稍更多地污染所形成的甲硫醇。优选地，将使用从大气压至20巴(2MPa)的压力，甚至更优选地，将在从大气压至3巴(300kPa)的压力下进行操作。
根据所选的操作条件和使用的试剂，本发明的方法可以在玻璃或金属反应器中间歇或连续地进行。
理想的有机还原化合物/二硫化物的摩尔比为化学计量(摩尔比=1)，但是可以为0.01至100，如果本领域技术人员在其中找到任何益处的话，如连续添加二硫化物，而还原化合物从开始时被引入反应器中。优选地，在整个反应中，该摩尔比在0.5-5之间选择。
在上述步骤a)中制备的混合物中以催化量存在的元素(具有巯基的氨基酸或含巯基的肽，还原酶，辅因子(如，例如NADPH))容易商购获得或可以根据本领域技术人员熟知的技术来制备。这些不同的元素可以是固体或液体形式存在，并且可以非常有利地溶解在水中以用于本发明的方法中。所用的酶也可以被接枝到载体上(在负载的酶的情况下)。
包含氨基酸或肽的酶复合物的水溶液还可以通过本领域技术人员已知的方法进行重构，例如通过含有这些元素的细胞的透化。这种水溶液，其组成在下面的实施例1中给出，可以以相对于反应介质总重量的0.01％至20％的重量含量进行使用。优选地，将使用0.5％和10％之间的含量。
根据另一方面，本发明涉及包含如上定义的具有巯基官能团的氨基酸或如上定义的具有巯基官能团的肽的酶复合物的水溶液的用途，用于从二硫化物合成硫醇。
可以用于上述方法的步骤a)并且包含以下组分的混合物：
1)式R-S-S-R'的二硫化物，
2)催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
3)催化量的用于催化在两当量所述携带巯基的氨基酸或所述含巯基的肽之间产生的二硫键的还原反应的酶，
4)任选的催化量的用于催化有机还原化合物的脱氢反应的酶
5)催化量的用于催化还原反应和脱氢反应的两种酶的共同辅因子，
其中R和R'如上所定义，
是新颖的并且因此构成本发明的一部分。
在本发明的一个实施方案中，带有巯基的氨基酸和/或带有巯基的肽可以分别为所述氨基酸和/或所述肽的二硫化物的形式。
更特别地，所述混合物包含：
·式R-S-S-R'的二硫化物，
·催化量的带有巯基的氨基酸或含巯基的肽，
·催化量的对应于所述带有巯基的氨基酸或所述含巯基的肽的还原酶，和
•催化量的NADPH，
其中R和R'如上所定义。
通过以下相对于本发明范围非限制性的实施例将更好地理解本发明。
实施例1：
将10ml谷胱甘肽酶复合物(Aldrich)和19.2g(0.1mol)葡萄糖引入到含有150ml的pH 7.30的0.1mol/l磷酸盐缓冲液的反应器中。该酶复合物的溶液含有：185mg(0.6mmol)谷胱甘肽，200U谷胱甘肽-还原酶，50mg(0.06mmol)NADPH，200U葡萄糖-脱氢酶。在机械搅拌下使反应介质达到25℃。在t=0时进行第一次取样。随后，将二甲基二硫醚(9.4g，0.1mol)置于滴定管中并滴加到反应器中，反应开始。同时，将氮气流置于反应器中。离开反应器的气体的气相色谱分析显示几乎基本上存在氮气和甲硫醇(一些痕量的水)。这些出口气体被捕集在20％的氢氧化钠水溶液中。在6小时内引入DMDS，该反应通过在反应器出口处的捕集器中对甲硫醇钠盐进行银量电位滴定进行监测。最终分析显示，DMDS已经定量地被转化为甲基甲硫醇。另外，反应介质的最终气相色谱分析证实不存在DMDS，并且通过UPLC /质谱分析发现微量葡萄糖和几乎排他性地存在葡萄糖酸内酯。
实施例2：
在实施例1的反应介质中，在6小时内一次性再引入19.2g(0.1mol)葡萄糖，和逐滴再引入9.4克(0.1摩尔)DMDS。在替换了在反应器出口处的20％氢氧化钠溶液后，以与实施例1相同的方式监测该反应。反应结束时的分析证实DMDS完全消失，其完全转化为在氢氧化钠溶液中以钠盐形式存在的甲硫醇。在反应结束时，仅分析出葡萄糖酸内酯并存在于反应介质中。该实施例通过其重现性表明了催化体系的稳健性。