核酸制备及分析的制作方法

文档序号:12412931阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于指数扩增双链靶核酸的方法,其特征在于所述方法包括:

(a)使接头连接到单个双链靶核酸分子上使双链靶核酸分子末端相连,其中所述接头包括(i)配对区域和(ii)非配对区域;

(b)提供(i)目标特异性引物,其与靶核酸的结合位点互补;和/或,(ii)接头引物,其与非配对区域互补链上的引物结合位点互补;

(c)在目标特异性引物和/或接头引物存在的条件下进行扩增反应扩增末端相连的双链靶核酸分子,产生第一个扩增分子。

2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中非配对区域是一个环结构,其5’和/或3’突出,或形成泡泡形(bubble)结构;优选的,非配对区域是一个环结构;优选的,所述环结构含有尿嘧啶,且所述方法还包括和在扩增步骤前由尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)切除环结构的方法。

3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,其中目标特异性引物在5'端具有一个标签序列。

4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法,其特征在于,所述扩增反应体系中包括第一阻断物,所述第一阻断物具有第一序列,(i)该序列与靶核酸的野生型等位基因相匹配或互补,且(ii)该序列能够通过DNA聚合酶延伸;优选的,扩增反应体系还包括第二阻断物,此阻断物含有第二序列,该序列与野生型等位基因的互补序列相匹配或互补;

优选的,第一阻断物或第二阻断物包括一个或多个修饰的核酸或键;

优选的,第一阻断物或第二阻断物3’端有一个修饰的核酸或键;

优选的,所述的修饰核苷酸或键包括PNA,LNA,2’-O-甲基核苷酸,2’-O-烷基核酸,2’-O-氟核酸、硫代磷酸酯键,以及它们的任意组合;

优选的,第一阻断物或第二阻断物不与接头引物或目标特异性引物重叠。

5.根据权利要求1-4所述的方法,其特征在于,靶核酸是ctDNA;优选的,靶核酸长度在20bp-20kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-2kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-1kb之间;优选的,靶核酸长度在20bp-200bp之间;优选的,靶核酸包括编码EGFR T790M,EGFR L858R,BRAF V600E,BRAF V600K,BRAF V600D,BRAF V600G,BRAF V600A,或BRAF V600R或KRAS G12V的区域。

6.一种获得一个或多个双链靶核酸序列的方法,包括:

根据权利要求书1的方法得到的第一个扩增分子;

在第二扩增反应中扩增第一扩增分子,包括一对引物,每条引物有一个条形码(barcode)序列,以产生第二次扩增的分子,和测序第二次扩增的分子。

7.用于评估患癌个体的方法,包括:

(1)从该个体中获得生物样品;

(2)和根据权利要求1中的方法进行检测以确定在生物样品中是否有一个或多个靶核酸。

8.根据权利要求7的方法,其特征在于,所述生物样品是血清,血浆,全血,唾液,或痰;优选的,所述方法还包括确定靶核酸存在的情况下,决定或者建议的治疗方案;所述方法还包括在所述一个或多个靶核酸存在时施用所述治疗的步骤;所述方法中,扩增反应是一个多重扩增反应。

9.用于扩增靶核酸的试剂盒,包括:

(a)接头,所述接头包括配对区域和非配对区域;

(b)和非配对区域互补链上的引物结合位点互补的接头引物,以及,

(c)和靶核酸上的结合位点互补的靶向特异性引物。

10.根据权利要求9所述的试剂盒,其特征在于所述试剂盒还包括:

(d)第一阻断物包括第一序列,此序列(i)和靶核酸的野生型等位基因相匹配或者互补,并且(ii)能够通过DNA聚合酶进行延伸,或,

(e)第二阻断物包括第二序列,此序列和野生型等位基因的互补相匹配或互补。

优选的,非配对区域是一个环结构,5’和/或3’突出,或泡泡形(bubble);优选的,非配对区域是一个环结构;优选的,环结构含有尿嘧啶;优选的,至少一条引物和阻断物包含一个或多个修饰的核酸或修饰的键;优选的,修饰的核苷酸或键包括PNA,LNA,2’-O-甲基核苷酸,2‘-O-烷基核酸,2’-氟核酸、硫代磷酸酯键,以及它们的任意组合;优选的,还包括一条或多条Illumina P5barcode引物,Illumina P7barcode引物,Ion Torrent A barcode引物和Ion Torrent P1barcode引物。

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