一种获得耐盐转基因大豆材料的方法与流程

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种利用转基因技术获得耐盐大豆新材料的方法。

背景技术：

大豆一直是我国重要的粮食作物和油料作物，但在最近20年，受国外进口大豆冲击及国内比较效益导致的种植结构调整的影响，我国大豆生产种植面积急剧下降，自1996年由大豆净出口国转变成大豆净进口国以来，大豆进口量逐年增长，2015年达到8169万吨，占国内大豆消费总量的87%。随着我国农业供给侧结构性改革的提出与实施，国内大豆种植业迎来了良好机遇。

土壤盐碱化是影响大豆生长发育和产量的重要因素，大豆受到盐胁迫后，其株高、主茎节数、单株荚数、百粒重等关键指标均显著下降。全球有20%耕地受到不同程度的盐害威胁，在我国盐碱地面积达到3300万公顷以上。因此，如何有效降低盐碱非生物逆境对大豆等农作物的影响，增加有效耕地面积，提高粮食总产，保障农业可持续发展是目前我国粮食作物生产中面临的一个重大问题。

转基因技术作为近20年应用速度最快的作物育种技术，在抗病虫、抗除草剂、抗旱作物新品种培育方面均获得了突破性进展，转基因作物的商业化应用给全球农业可持续发展带来了显著的经济、生态和社会效益。随着大豆转基因技术日趋成熟以及耐盐相关基因越来越多地被挖掘出来，利用转基因技术获得耐盐大豆新材料成为大豆新品种培育的有效途径。

agglpf基因是吉林大学张世宏教授课题组从嗜盐曲霉中克隆出的一种水甘油通道蛋白基因，该基因在酵母细胞中过表达后，能显著提高受体细胞的抗盐性、抗旱性和抗金属离子的特性。此外，与野生型拟南芥相比，转agglpf基因拟南芥对高盐和干旱胁迫的耐受性得到显著提升。这些研究表明，agglpf基因是一种性状较为突出的耐盐基因，但未见有将agglpf基因转入大豆中的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是利用转基因技术将agglpf基因转入受体大豆中，进而获得转agglpf基因耐盐大豆材料，提高大豆的耐盐性，促进大豆产业的发展。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

提供一种含有agglpf基因的植物表达载体pyl-agglpf，该表达载体是通过对agglpf基因全序列进行xmai和spei双酶切，并克隆到基础载体pyl的t-dna区多克隆位点而得到。该表达载体含有一个筛选基因bar，一方面有利于转化体的筛选，减小后期检测工作量，另一方面可以通过检测bar基因来进一步证明目的基因已转入受体植株。

提供一种转agglpf基因耐盐大豆的培育方法，该方法先将agglpf基因克隆构建至表达载体pyl中，再利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法将agglpf基因转入大豆受体品种p3的基因组中，最终得到耐盐转基因大豆材料。但是，本实验提供的方法不仅限于此，任何一种转化方法能将本发明提供的重组表达载体导入大豆基因组中都适用。

所述转agglpf基因耐盐大豆的培育方法，包括如下步骤：

（1）农杆菌介导的大豆遗传转化：将含有agglpf基因的植物表达载体pyl-agglpf，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法导入大豆受体品种的基因组中，获得t0代转化植株；

（2）转agglpf基因大豆材料的筛选：应用bar试纸条检测、草胺膦除草剂涂抹、agglpf基因pcr扩增等方法对t0代转化植株进行筛选鉴定，获得阳性植株，进行自交获得t1代种子；对t1代阳性植株进行southernblot分析，获得外源目的基因为单拷贝的转基因材料，进行自交获得t2代种子；

（3）转agglpf基因大豆材料的耐盐性鉴定：用200mmnacl溶液对t2代阳性植株进行耐盐性鉴定，获得转agglpf基因耐盐大豆材料。

所述转agglpf基因耐盐大豆具有下述（1）和（2）中的全部特征：

（1）所述转基因大豆与所述受体大豆相比，耐盐性显著提高；

（2）所述转基因大豆与所述受体大豆相比，抗除草剂效果显著提高。

实验证明，利用本发明提供的方法，可获得同时抗除草剂和耐盐的转基因大豆材料，与受体大豆相比，利用本发明提供的方法培育的耐盐转基因大豆不仅对除草剂草胺膦有明显的抗性，且耐盐性明显提高。利用本方法获得的耐盐转基因大豆材料是未来应对缓解土壤盐渍化的有效途径之一，对农业生产具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为agglpf基因表达载体图谱及载体构建电泳检测结果图，其中a为pyl-agglpf表达载体图谱，b为相应载体酶切电泳检测结果图。

图2为农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化过程图。

图3为t0代转agglpf基因大豆阳性植株的除草剂涂抹检测结果图。

图4为t0代转化植株的pcr分析电泳图。

图5为t1代转agglpf基因大豆植株的southernblot杂交结果图。

图6为t2代转agglpf基因大豆植株的耐盐性鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1植物表达载体构建。

根据ncbi上公开的agglpf基因（genbank登录号kj679500）的核苷酸序列，按照植物密码子偏爱性人工合成agglpf基因。根据植物双元表达载体多克隆位点分子特征，分别在agglpf基因上游引入内切酶xmai酶切位点，下游引入内切酶spei酶切位点。

通过pcr方法扩增得到agglpf基因全长序列（861bp），并通过双切双连的方法进行xmai和spei酶切后，将agglpf基因连接至pyl载体上获得表达载体pyl-agglpf（图1a），构建好的质粒经测序和酶切检测（图1b），将验证正确的植物表达载体转入农杆菌eha101中，用于下一步大豆遗传转化。

实施例2农杆菌介导的大豆遗传转化。

在本研究中，选择带有目的基因agglpf的农杆菌菌株eha101，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法对大豆受体品种p3进行遗传转化。

农杆菌介导大豆子叶节转化法的过程见图2，基本流程如下：

（1）农杆菌28℃培养16h后收集菌体，转入yep液体培养基中，直至od600值0.5～0.7备用；

（2）选取大豆受体品种p3成熟种子，氯气灭菌16h。灭菌后种子放入gm萌发培养基（培养基配方参照olhoft等）弱光萌发16h；

（3）切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切时刀尖蘸工程菌液。将切开后的子叶节放入工程菌液中，轻柔晃动30min，转入共培养基中，避光培养（23℃，3～5d）；

（4）共培养后，将伸长的胚轴切去约2/3，保留约5mm的胚轴，插入加筛选剂的sim伸长培养基中，诱导丛生芽生长，培养条件25℃，光照16h/d，光照强度2000lx；

（5）在sim培养基中培养7d后，转入sem筛选培养基中，间隔15d继代1次，筛选3～4轮，得到分生苗；

（6）将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根；

（7）生根健全的转化苗，经炼苗（3～5d）后移入盆中栽培。

在本实验中我们共制备了1700个大豆外植体，发生诱导的外植体有801个，最终得到t0代转基因再生植株68株，其中经bar试纸条检测呈阳性为49株，转化率接近8.5%。

实施例3转基因植株的草胺膦抗性检测。

由于植物表达载体中以草胺膦作为筛选标记，因此在t0代转基因材料苗期可采用草胺膦涂抹叶片的方法快速检测转基因阳性苗。

具体方法：用棉签蘸取浓度为135mg/l的适量草胺膦溶液，轻柔擦拭半片叶子，同叶以涂抹清水作为对照，在正常光照情况下3～5d后观察叶片生长情况，若涂抹部位出现枯萎，则不抗草胺膦（图3）。

在本研究中，我们将经bar试纸条初检呈阳性的49株再生植株移栽至温室花盆中培养，利用草胺膦抗性检测方法，最终得到36个t0代转基因材料。

实施例4t0代转基因植株的pcr检测。

根据agglpf基因序列设计基因全长检测引物，引物序列如下：

引物1（上游引物）：atgctccataactttgttggtt；

引物2（下游引物）：tcaatccagtcggagagctgtgt。

使用ctab法提取大豆转化植株及受体对照p3的基因组dna。

利用上述引物对36个t0代转化植株基因组dna进行目的基因agglpf的pcr扩增检测。

pcr反应体系（20µl）：dna模板50ng，10×buffer2.0µl，2.5mmdntps2µl，10µm引物各0.5µl，5u/µltaq酶0.2µl，加ddh2o至20µl。pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。

pcr扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析。

agglpf基因的pcr扩增结果如图4所示，在36个t0代转化植株中有29株含有目的基因agglpf。

实施例5t1代转基因植株的southernblot分析。

为了检测agglpf基因整合到大豆基因组中的拷贝数，选取10个t1代转基因材料进行基因组dna的southernblot分析。

southernblot分析使用的是roche的地高辛试剂盒kitⅱ型，实验具体流程参照试剂盒说明书。

以克隆到载体上的agglpf基因全长序列（861bp）作为southern杂交探针，使用ecori内切酶进行基因组dna酶切。

实验结果表明，有4个转基因品系表现为外源目的基因以单拷贝插入到基因组中（图5的泳道2、4、7、10），说明目的基因已经真正的整合到植物基因组中，其中杂交带大小有所不同，说明不同转基因品系中的外源基因整合位点不同。

实施例6转基因大豆材料耐盐性鉴定。

取经southernblot鉴定agglpf为单拷贝的转基因大豆的t2代株系的种子，进行大豆苗期耐盐性鉴定，将受体材料和转基因材料播种在装有ph7.5左右的草炭土营养钵中，每份材料均播种30粒以上，转基因和对照材料分别设定2组（浇灌盐水组及浇清水对照组），每组设定5次重复。在幼苗生长至2片复叶完全展开以后，转基因和对照材料各选一组，用200mm的nacl溶液浇灌，其他转基因材料和对照材料正常浇水。

1周以后观察盐害情况，筛选到耐盐的转基因材料，见图6。其中ck1为非转基因大豆浇灌盐水处理，ck2为非转基因大豆浇灌清水处理，d1为转基因大豆浇灌盐水处理，d2为转基因大豆浇灌清水处理。

实验结果表明，转基因基因大豆植株在盐胁迫处理1周后仍然存活，且与未经盐胁迫处理的植株生长状况无显著性差异，而非转基因植株在盐胁迫处理3天后就开始出现叶片枯萎的症状，1周后完全死亡，表明我们获得了耐盐性较好的转agglpf基因大豆材料。

应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有改进和变更，均应认为是本发明的保护范围。

<110>吉林省农业科学院

<120>一种获得耐盐转基因大豆新材料的方法

<130>

<160>2

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

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<223>agglpf基因的pcr检测引物1

<400>1

atgctccataactttgttggtt22

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>agglpf基因的pcr检测引物2

<400>2

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