一种茄尼醇衍生物、制备方法及其应用与流程

本发明属于药用高分子材料和生物医药领域，具体涉及一种茄尼醇衍生物、制备方法及其应用。

背景技术：

辅酶q10(简写为：coq10)为体内细胞中广泛存在的脂溶性、维生素类内源性物质，被称为泛醌或泛醌利酮，其为黄色结晶性粉末，不溶于水和甲醇，微溶于乙醇；易溶于丙酮、正己烷、乙醚等极性较小的溶剂中；且对光照及湿度较为敏感。coq10主要存在于代谢活跃的机体组织，如心脏、肌肉及免疫组织等细胞中，其发挥着诸多的生理生化功能。

科学研究表明coq10在体内可：参与线粒体呼吸链中电子的传递，抑制脂质的过氧化；促进皮肤上皮细胞的生长，降低紫外线损害，延缓皮肤衰老；提高机体免疫力的效果；抗肿瘤作用；增强心肌能力。同时coq10可以减少血液中低密度脂蛋白，而提高高密度脂蛋白的活性，减少血管动脉硬化的产生，而起到保护心脑血管的作用。coq10临床主要用于肌肉神经退行性疾病、他汀类药物引起的横纹肌溶解的症状、头孢类抗生素及部分抗菌药导致的双硫仑样反应及心血管疾病等。其中心血管疾病的预防及辅助治疗是coq10的主要应用方向。临床实验研究表明机体内coq10的含量与高血压、心力衰竭及心绞痛的发生、发展及疾病病程密切相关。部分患者由于年龄及服药等原因导致体内coq10含量较低，可能出现coq10缺乏性高血压。此类高血压在应用高血压药的同时，应当适量补充服用coq10，以维持体内含量的稳定。对于心力衰竭及心绞痛的心肌细胞研究表明心肌细胞内coq10的含量与病程密切相关。治疗心力衰竭及心绞痛时，同服coq10可起到良好减轻病情的作用。

尽管coq10临床应用众多，但多作为辅助用药或保健品使用，一般用药周期较长，因此也多采用口服给药的方式。由于coq10分子量较大(863da)，脂溶性较强，水溶性很差(0.7ng/ml，37℃)等原因，导致其胃肠道粘膜的渗透性较差，吸收不佳。又由于其对光、热及氧化物的不稳定的化学性质，使coq10的临床应用时生物利用度较低，严重限制了其药理活性的的发挥，难以达到所期望的药效。因此，如何有效提高coq10的口服生物利用度是目前临床口服应用coq10面临的最大问题。为提高coq10的口服生物利用度。多年来，研究人员主要通过：增加coq10的水溶性、提高coq10的光和热的稳定性、减慢coq10的代谢及增加其胃肠道屏障的渗透性等方面进行努力。

茄尼醇作为coq10工业合成的原料，其结构与coq10存在相同的异戊二烯侧链，考虑以其作为聚合物胶束的疏水内核可能实现高负载coq10。同时研究发现其与coq10有相似的药理作用，如清除氧自由基、抑制氧化反应、吸收紫外线等，两者有可能实现一定的协同保护作用。

聚合物材料在较高浓度时也有良好的生物相容性，可作为药物载体使用。本文综合考虑结构的相似性及药理活性的一致性，考虑以茄尼醇为原料，得到聚乙二醇化的茄尼醇衍生物用于coq10的包载及传递。可得到高负载量，高稳定性，具有一定协同作用的纳米载药胶束。达到提高coq10的胃肠道吸收及生物利用度的目的。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种茄尼醇衍生物、制备方法及其应用。

基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种茄尼醇衍生物，该衍生物的结构如下：

45≤n≤114，且n取整数。其中，优选n为45或114。

上述茄尼醇衍生物的合成路线如下：

(1)将sol(茄尼醇)和dmap(4-二甲氨基吡啶)溶于二氯甲烷中，n2保护下将丁二酸酐和三乙胺的dmf混合液滴入前述二氯甲烷溶液中，n2保护下室温反应至少48h，反应结束后，经后处理即得mss，茄尼醇、dmap与丁二酸酐的摩尔比为(5～7)︰(3～4)︰(9～10)；(2)称取聚乙二醇单甲醚、mss、dcc(二环己基碳二亚胺)和dmap(4-二甲氨基吡啶)，摩尔比为：1︰2︰2︰1，溶于二氯甲烷中，室温搅拌反应至少48h，反应结束后，常压过滤除去沉淀，加入蒸馏水，取二氯甲烷层，减压旋干，用甲醇：三氯甲烷＝2:1(v/v)的流动相复溶，过0.22μm有机滤膜，而后过凝胶柱，tlc监测产物流出，旋干流动相，真空干燥，得淡黄色产物目标产物spgs。

前述茄尼醇衍生物作为载药胶束的应用。

本发明中的茄尼醇衍生物，其中疏水段结构为茄尼醇

聚乙二醇单甲醚优选n为45或114，即mn＝2000da或5000da。

本发明中茄尼醇衍生物，属于a-b型聚合物。

本发明提供了两种分子量茄尼醇衍生物嵌段聚合物，并以此为材料制备了空白和载coq10的聚合物胶束系统，通过实验对该系统的理化性质、细胞毒性等一系列考察，所得到的聚合物胶束的具有良好的稀释稳定性、储存稳定性及光稳定性。并且考察了聚合物材料的细胞毒性，结果表明，聚合物材料在较高浓度时也有良好的生物相容性，可作为药物的载体使用。

本发明的优点在于：聚合物胶束是由两亲性嵌段聚合物大分子自组装形成的，具有核-壳结构的纳米级粒子，其疏水内核可以作为以coq10为代表的疏水性药物的储存库。其作为coq10的药物载，可有效提高coq10等疏水性药物的水溶性，增加胃肠道的渗透性；减少药物与外界环境的接触，提高其理化稳定性；利用其纳米级的粒径结构，增加胃肠道对辅酶q10的吸收利用，提高其生物利用度及药效等。

本发明的茄尼醇衍生物的载药对象为辅酶q10，但并不局限于coq10，也可是其他脂溶性药物(如阿霉素、紫杉醇、姜黄素等)。本发明以sd大鼠为实验对象的药代动力学实验考察聚合物胶束对coq10生物利用度的影响，结果证明：利用本发明制备的茄尼醇衍生物负载coq10的胶束可增加胃肠道对coq10的吸收，减慢coq10的代谢速度，将coq10的生物利用度提高3倍以上。

附图说明

图1为中间产物(a)mss、实施例1制得的目标产物(b)spgs-2k及实施例2制得的目标产物(c)spgs-5k的¹h-nmr图谱；

图2为嵌段聚合物spgs载药前后的粒径：(a)spgs-2k及coq10-spgs-2k；(b)spgs-5k及coq10-spgs-5k；

图3coq10-水悬浮液及coq10-spgs水溶液的外观：(a)coq10-水悬浮液，(b)coq10-spgs-2k水溶液，(c)coq10-spgs-5k水溶液；

图4为dls检测不同稀释倍数下coq10-spgs-2k和coq10-spgs-5k的胶体稳定性；

图5为载药胶束在25℃及4℃下储存时粒径变化：(a)25℃，(b)4℃；

图6为coq10光降解剩余百分含量；

图7为spgs-2k和spgs-5k的细胞毒性(时间为48h，n＝3)；

图8为coq10各制剂的药物浓度--时间曲线。

具体实施方式

以下结合具体实例对本发明的技术方案作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例1

一种茄尼醇衍生物，该衍生物结构如下：

上述茄尼醇衍生物的合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)称取4.0gsol(茄尼醇)和0.4gdmap(4-二甲氨基吡啶)溶于约25ml无水ch2cl2中，n2保护下将1.0g丁二酸酐和1.0ml三乙胺的15mldmf混合液用恒压滴液漏斗滴入前述ch2cl2溶液中，室温反应48h，反应结束后，反应液转入漏斗中，加入30ml蒸馏水洗涤，静置，取ch2cl2层，重复操作两次，旋蒸除去溶剂。用石油醚:乙酸乙酯＝1:1(v/v)为流动相过硅胶柱，tlc监测产物流出，旋干流动相，真空干燥，得淡黄色目标产物mss(茄琥酯)，产率：60wt％。

(2)称取1.60g聚乙二醇单甲醚(mn＝2000da)、1.15gmss(茄琥酯)、0.33gdcc(二环己基碳二亚胺)、0.05gdmap(4-二甲氨基吡啶)溶于30ml二氯甲烷中，室温搅拌48h，反应结束后，常压过滤除去沉淀，加入30ml蒸馏水，取二氯甲烷层，减压旋干，用甲醇︰三氯甲烷＝2︰1(v/v)的流动相复溶，过0.22μm有机滤膜，而后过凝胶柱，tlc监测产物流出，旋干流动相，真空干燥，得淡黄色产物目标产物spgs-2k，产率：65.6wt％。

实施例2

一种茄尼醇衍生物，该衍生物结构如下：

上述茄尼醇衍生物的合成路线如下：

具体合成步骤如下：

(1)称取4.0gsol(茄尼醇)和0.4gdmap(4-二甲氨基吡啶)溶于约25ml无水ch2cl2中，n2保护下将1.0g丁二酸酐和1.0ml三乙胺的15mldmf混合液用恒压滴液漏斗滴入前述ch2cl2溶液中，室温反应48h，反应结束后，反应液转入漏斗中，加入30ml蒸馏水洗涤，静置，取ch2cl2层，重复操作两次，旋蒸除去溶剂。用石油醚:乙酸乙酯＝1:1(v/v)为流动相过硅胶柱，tlc监测产物流出，旋干流动相，真空干燥，得淡黄色目标产物mss(茄琥酯)，产率：60wt％。

(2)称取4.0g聚乙二醇单甲醚(mn＝5000da)、1.15gmss(茄琥酯)、0.33gdcc(二环己基碳二亚胺)、0.05gdmap溶于30ml二氯甲烷中，室温搅拌48h，反应结束后，常压过滤除去沉淀，加入30ml蒸馏水，取二氯甲烷层，减压旋干，用甲醇:三氯甲烷＝2：1(v/v)的流动相复溶，过0.22μm有机滤膜，而后过凝胶柱，tlc监测产物流出，旋干流动相，真空干燥，得淡黄色产物目标产物spgs-2k，产率：60.6wt％。

图1为茄琥酯mss、聚合物spgs-2k和spgs-5k的核磁图谱，(a)中mss核磁与原料sol相比，δ＝1.60ppm(ch3-c＝c-)、δ＝5.42ppm(-ch2c＝c-h)、δ＝2.10ppm(-c＝cch2ch2c＝c-)、δ＝1.70ppm(ch3ch3c＝c-)、δ＝5.11ppm(c-c-c＝c-h)处的sol结构中质子峰仍然存在。而sol中羟基旁的亚甲基峰，在mss中(-cooch2-)由于酯键的形成由sol中的δ＝4.15ppm向低场高位移移动至δ＝4.62ppm处；同时δ＝2.65ppm处亚甲基质子(-oocch2ch2coo)峰的出现，说明了由sol已成功合成了mss(茄琥酯)。(b)及(c)与mss的核磁图谱比较可以发现有如下特点：①在δ＝4.25ppm处出现了新的酯键旁亚甲基质子峰；②在δ＝3.38-3.82范围内出现了mpeg质子特征峰，综上可以断定两亲性嵌段聚合物spgs-2k或spgs-5k的成功合成与分离。

空白胶束的制备及粒径的表征

采用自乳化溶剂挥发法制备空白胶束，具体为：取40.0mg实施例1制得的spgs-2k(或实施例2制得的spgs-5k)溶于1ml丙酮中，缓慢滴于20ml去离子水中，常温挥发24h或减压挥发，经0.45μm及0.22μm水系滤膜过滤即得空白胶束溶液。取3ml左右采用激光粒度仪测定胶束粒径及粒径分布。

载辅酶q10胶束的制备及粒径的表征

分别称取实施例1制得的40.0mgspgs-2k(或实施例2制得的40mgspgs-5k)和40.0mg辅酶q10分别溶于1ml丙酮，混合均匀，缓慢滴加于20ml去离子水中，常温挥发24h或减压挥发，经0.22μm滤膜过滤即得载药胶束溶液(分别记作coq10-spgs-2k、coq10-spgs-5k)。取3ml左右采用激光粒度仪测定胶束粒径及粒径分布。

由图2可知空白胶束粒径在105nm左右，且pdi较小，胶束粒径分布较窄。spgs-5k空白胶束粒径稍大于spgs-2k，可能是由于其peg段稍长，但peg段在水中并未完全展开，导致其粒径增加并不明显。载药胶束粒径在183nm左右，与空白胶束相比出现明显增加。比较载药前后胶束pdi的变化可以发现载药后的pdi均明显小于载药前，可能是由于药物的负载使胶束内核作用增强，同时由于材料本身亲水段稍大，辅酶q10的加入相当于延长了疏水段，对胶束粒子粒径有一定均一化作用，进而使分布变窄。

载辅酶q10胶束水溶液及辅酶q10-水混悬液的外观

由图3中coq10-水混悬液(辅酶q10浓度为1.0mg/ml)和coq10-spgs制剂的水溶液(辅酶q10浓度均为1.0mg/ml)的外观可以发现，黄色coq10裸药粉末不溶于水，部分漂浮与水上或沉于底部。这是由于coq10分子量较大，具有很强的油脂性，导致其水溶性极低(0.7ng/ml，37℃)。而coq10-spgs制剂可以明显提高coq10的水溶性，制剂水溶液中coq10最高浓度可达4mg/ml。

稀释稳定性考察

载药胶束液(辅酶q10浓度为：1.5mg/ml)用去离子水分别稀释至x0、x10、x50、x200、x1000倍，经激光粒度仪测定粒径及其分布变化，考察比较胶束的稀释稳定性，模拟其在被大量稀释条件下保持胶束结构和粒径稳定的能力。dls法测定了不同稀释倍数下水合粒径的变化。结果如图4所示，对于载药胶束coq10-spgs-2k及coq10-spgs-5k发现即使稀释倍数达到1000倍，材料浓度低于其cac时，胶束水合粒径及其分布仍能保持稳定，基本没有变化。由于coq10结构与茄尼醇的高度相似性，coq10的加入对胶束起到了较好的稳定性作用，与空白胶束相比其耐稀释的能力明显增加。这一点也为其体内应用提供了一定的可能性。

储存稳定性考察

量取2份载药胶束溶液(辅酶q10浓度为1.5mg/ml)各20ml，加入少量叠氮钠溶液后，分别置于4℃和25℃(室温)储存；于第1d、5d、10d、15d、30d进行外观检查、粒径测定及其分布测定，以考察载药胶束的胶体稳定性，结果见图5。由图5可知在室温(25℃)及冷藏条件(4℃)下30d内两种制剂的粒径变化均在10nm以内，且粒径分布也无明显变化。因此可以认为coq10-spgs-2k和coq10-spgs-5k已具有适当的胶体稳定性。

光稳定性考察

载药制剂光稳定性实验在yp-250gsp型稳定性试验箱中进行。在模拟自然光4500±500lx照射条件下，分别取10ml的coq10-spgs-2k(辅酶q10浓度为0.2mg/ml)、coq10-spgs-5k(辅酶q10浓度为0.2mg/ml)、coq10-乙醇液(辅酶q10浓度为0.2mg/ml)及coq10-水液(辅酶q10浓度为0.2mg/ml)于试验箱中，灯管距离25cm，考察温度25℃。随后，分别于0h、2h、4h、6h、12h、24h取样，乙醇稀释溶解处理。用紫外全波长扫描及高效液相色谱(hplc)进样分析，确定coq10含量的变化，并进行一级动力学降解拟合，以确定不同制剂中coq10的降解速度。

因为coq10为光敏感性药物，光照下产生超氧化物(ros)及单线态氧而发生降解。考察制剂中coq10光稳定性结果如图6所示，发现在乙醇溶液和水溶液中coq10降解较快，24h降解剩余分别为54.35％及28.25％。两者降解速度的差别可能由于溶剂作用，在不同溶剂中降解速度是不同的。而coq10-spgs-2k及coq10-spgs-5k中，经24h光照处理后，coq10的含量仍接近起始量的88％以上，体现了良好的光稳定性。产生这一现象的原因可能是由于聚合物材料疏水段茄尼醇的紫外吸收作用，茄尼醇结构中有大量双键结构，能有效的吸收紫外辐射，清除氧自由基，从而减少coq10的光降解速度。同时由于胶束结构的存在可以产生一定的屏障作用减少紫外线及活性氧对药物的影响。

聚合物胶束的体外细胞毒性评价

mtt细胞毒性实验，使用人正常肝细胞(hl-7702)和人肝癌细胞(hepg-2)用于评价聚合物材料的生物相容性。取处于指数生长期的hl-7702细胞或hepg-2细胞接种到96孔板上，每孔细胞数为4×10⁴个。培养24h后(37℃、5％co2)，分别加入含有浓度梯度为：0.0024g/l、0.024g/l、0.12g/l、0.24g/l、0.36g/l的聚合物空白胶束液培养基100μl。每个浓度均设3个复孔，同时用未经空白胶束液处理的细胞作为对照。加入样品以后继续培养48h(37℃、5％co2)，进行mtt检测：每孔加mtt溶液(0.5g/l，基础培养基溶解)100μl。继续孵育4h后，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液,每孔加100μldmso，轻轻振荡5min，使甲臜结晶物充分溶解提取。在酶联免疫监测仪上测定各孔570nm处od值，利用各吸收值及空白对照组吸光度平均值为基础，根据实验组吸光度平均值计算各浓度下细胞存活率，考察聚合物材料的细胞毒性大小。

spgs聚合物材料的细胞毒性实验结果如图7所示，spgs-2k对于hepg-2细胞及hl-7702细胞的ic50分别为0.532g/l及1.0410g/l；spgs-5k对hepg-2细胞及hl-7702细胞的ic50分别为0.6382g/l及1.362g/l。可以证明spgs-2k和spgs-5k为生物相容性较好，可作为安全的聚合物载体材料。

载辅酶q10聚合物胶束的体内药代动力学评价

sd大鼠18只，随机分成三组：coq10原药组、coq10-spgs-2k实验组、coq10-spgs-5k实验组，每组各6只；给药剂量：65mg/kg。实验前一天晚上8点开始禁食不禁水，第二天早上8点按计量给药，分别于20min、40min、70min、120min、240min、360min、480min、600min、720min、1440min眼眶静脉丛取血0.4ml左右，置于肝素化的离心管中，以3500rmp离心5min分离取上层血浆(可-20℃冷冻保存)。精密量取200μl血浆样品于4ml肝素化的离心管中，加入35μl浓度为6.40μg/ml的vk1标准液；涡旋1min，混匀后加入400μl甲醇用于沉蛋白。涡旋1min混匀后，加入1ml正己烷，涡旋3min，超声5min，5000rpm离心10min，取正己烷层于ep管中；再次加入1ml正己烷，重复以上操作。合并正己烷层，于氮气保护下挥发干后，加入100μl乙腈复溶，20μl进样，hplc测定。

图8为两种制剂和coq10-混悬液灌胃给药后，血药浓度c与时间曲线图。2图8可知，coq10的cmc-na混悬液的cmax、tmax及auc0-24h分别为0.212±0.023μg/ml、210±120.564min及110.094±15.822μg/ml·min，与相关文献报道基本一致。coq10-spgs-2k的cmax、tmax及auc0-24h分别为0.735±0.072μg/ml、150.0±60.00min及379.33±45.09μg/ml·min；其中coq10-spgs-2k的cmax及auc0-24h均高于coq10裸药组，而tmax对于两组来说基本没有差别。coq10-spgs-5k表现出了和coq10-spgs-2k相似的结果，说明了胶束制剂可以明显促进coq10的胃肠道吸收，显著提高coq10的生物利用度，可达到coq10裸药的生物利用度的3倍以上，但对吸收速度基本没有影响。胶束制剂组的血药清除率约为0.08l/min/kg，远远小于0.32l/min/kg，且coq10组的mrt为412.085±14.046min，小于coq10-spgs-2k的422.765±53.862min及coq10-spgs-5k的471.118±82.335min，说明了胶束制剂明显延长了coq10的血液循环时间，减小了其被清除的速度。coq10-spgs提高coq10的生物利用度和峰浓度的主要原因可能是由于聚合物胶束的纳米结构增加了coq10的水溶性及胃肠道渗透性，同时纳米粒子具有较强的胃肠道粘附能力，可延长胃肠道随coq10的吸收时间，从而提高coq10的生物利用度。