本发明涉及fmoc-arg(pbf)-oh的合成方法，属于精氨酸的保护技术领域。
背景技术：
精氨酸是一种可以在体内自然产生的必需氨基酸。在生命科学研究中，为了避免副产物的产生，必须对精氨酸的氨基和胍基进行保护。
fmoc-arg(pbf)-oh就是利用fmoc(9-芴甲氧羰基)保护氨基，用pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)保护胍基。
洪镛裕等.fmoc-arg(pbf)-oh的合成.[j].化学试剂，2006，28(1)，57～58。公开了一种fmoc-arg(pbf)-oh的合成方法，该方法采用cbz(苄氧羰基)对氨基进行中间保护，在胍基上引入pbf后脱去cbz，再在氨基上引入fmoc，采用上述方法的cbz保护在水相反应，pbf-cl耗量很高，容易分解，而且反应不彻底，pbf很贵因而效益不明显，未工业化应用。
申请号为200810034390.9的中国专利申请公开了一种精氨酸双保护制备工艺，其先用boc(叔丁氧羰基)保护氨基后，再在胍基上引入pbf，再脱去氨基上的boc，引入fmoc对精氨酸进行保护。上述方法避免了氢解，产品纯度≥99.0％，总收率最高可达到63.51％。但是采用上述方法pbf-cl的用量大，还会有大量精氨酸残余，pbf-cl的用量为精氨酸的2倍时，仍然有精氨酸未反应。
此外，现有技术中，引入pbf时，其反应温度必须控制在较低的温度-15℃～+15℃，如果升高反应温度高，反应效果会非常差，pbf耗量会增加，同时副产物会非常严重，产生大量的瓜氨酸衍生物和鸟氨酸衍生物，纯化难，不具有经济效益。现有技术优选的是在5-10℃引入pbf，但pbf耗量仍然很大，效益不好，因此，从2006年开始，申请人就停止使用原有工艺，开始致力于研究开发效益好的新工艺。
技术实现要素：
本发明提供了一种fmoc-arg(pbf)-oh的合成方法，pbf-cl的用量减少，成本低。
为解决上述技术问题，本发明的fmoc-arg(pbf)-oh的合成方法包括如下步骤：
(1)酯化
(2)引入boc基团
(3)引入pbf
(4)脱boc
(5)皂化
(6)fmoc-arg(pbf)-oh合成
其中，所述r为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苄基、二苯甲基或三苯甲基中的至少一种。
优选的，所述r为甲基或乙基。
优选的，所述精氨酸优选精氨酸盐酸盐或者精氨酸碱。
优选的，步骤(1)酯化的工艺包括如下步骤：
a1.向无水乙醇或无水甲醇中滴加二氯亚砜，反应温度-10～0℃；
b1.加入arg.hcl，升温至0℃～50℃反应24～72小时；
c1.反应结束后，减压浓缩得到油状物的arg.oet.2hcl或者arg.ome.2hcl中间体。
优选的，所述无水乙醇或无水甲醇与二氯亚砜的摩尔比为：5～30:1。
优选的，步骤(3)所述的引入pbf的工艺包括如下步骤：
a3.取摩尔比boc-argor.hcl：pbf-cl：溶剂：碳酸钾：水＝1:1～2:15～90：3～8:1～20的物料，混匀；
b3.反应完成后，抽滤，除去固体不溶物，减压蒸馏除去溶剂，得到boc-arg(pbf)or；
其中，所述溶剂为四氢呋喃，二氧六环，丙酮中的至少一种。
优选的，a3步骤温度维持40～45℃。
优选的，a3步骤所述boc-argor.hcl：pbf-cl的摩尔比为1:1.1。
优选的，步骤(5)所述皂化的工艺包括如下步骤：
将步骤(4)得到的h-arg(pbf)or加乙醇溶解，调节ph10～12进行皂化，皂化时间3～4小时，纯化即得h-arg(pbf)oh。
优选的，步骤5采用氢氧化钠溶液控制ph10～12。
有益效果：
采用本发明的方法合成fmoc-arg(pbf)-oh，只需要使用arg摩尔量1.1倍的pbf-cl就可以把arg全部反应，相比现有技术pbf-cl的用量为精氨酸的2倍时仍然有精氨酸未反应，本发明的pbf-cl用量大大降低，并且无arg残余，pbf-cl价格昂贵，因此本发明的成本也大大降低，此外，pbf的引入温度高，效益好，有利于工业化推广应用。
具体实施方式
本发明的fmoc-arg(pbf)-oh的合成方法包括如下步骤：
(1)酯化
(2)引入boc基团
(3)引入pbf
(4)脱boc
(5)皂化
(6)fmoc-arg(pbf)-oh合成
其中，所述r为甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、苄基、二苯甲基或三苯甲基中的至少一种。
优选的，所述r为甲基或乙基.
优选的，所述精氨酸优选精氨酸盐酸盐或者精氨酸碱。
优选的，步骤(1)所述酯化的工艺包括如下步骤：
a1.向无水乙醇或者无水甲醇中滴加二氯亚砜，反应温度-10～0℃；
b1.加入arg.hcl，自然升温，0℃～50℃反应24～72小时；
c1.反应结束后，减压浓缩得到油状物的arg.oet.2hcl或者arg.ome.2hcl中间体。
优选的，所述无水乙醇或者无水甲醇与二氯亚砜的摩尔比为:5～30:1。
优选的，步骤(3)所述的引入pbf的工艺包括如下步骤：
a3.取摩尔比boc-argor.hcl：pbf-cl：溶剂：碳酸钾：水＝1:1～2:15～90：3～8:1～20的物料，混匀；
b3.反应完成后，抽滤，除去固体不溶物，减压蒸馏除去溶剂，得到boc-arg(pbf)or；
其中，所述溶剂为四氢呋喃，二氧六环，丙酮中的至少一种。
优选的，a3步骤温度维持40～45℃。
优选的，a3步骤所述boc-argor.hcl：pbf-cl的摩尔比为1:1.1。
优选的，步骤(5)所述皂化的工艺包括如下步骤：
将步骤(4)得到的h-arg(pbf)or加乙醇溶解，调节ph10～12进行皂化，皂化时间3～4小时，纯化即得h-arg(pbf)oh。
优选的，步骤5采用氢氧化钠溶液控制ph10～12。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
实施例1
(1)酯化
a1.将100l无水乙醇加入预先干燥的300l反应釜内，通冰盐水降温至-5～-10℃，滴加二氯亚砜13l。
b1.加入d型的arg.hcl21.5kg，关闭冰盐水，自然升温至室温反应24小时。
c1.升温至35℃反应，tlc点板跟踪反应情况，反应大约48h结束。
d1.浓缩：反应结束后，减压浓缩得到油状物的arg·oet·2hcl中间体。
(2)引入boc基团
a2.在300l反应釜内加入150l水，再加入碳酸氢钠25.2kg，搅拌；
逐渐加入arg·oet·2hcl油状物；加入四氢呋喃30l；分批加入(boc)2o，26.2kg搅拌，室温反应；
tlc法点板跟踪反应情况，当arg·oet·2hcl反应完即开始处理。
b2.酸化：反应完成后调节ph3-4，用石油醚/乙酸乙酯(50l:25l)，萃取；
c2.加盐饱和，回调ph6-7，用乙酸乙酯提产品，用饱和食盐水洗涤有机相。
d2.干燥：向有机相(带产品的乙酸乙酯溶液中)中加入60kg的无水硫酸钠，干燥8小时。
e2.提纯浓缩：抽滤掉硫酸钠固体，减压蒸馏乙酸乙酯相。浓缩后得到的boc-argoet.hcl油状物。
(3)引入pbf
a3.在300l反应釜中加入步骤2得到的boc-argoet.hcl，pbf-cl31.9kg，丙酮200l，碳酸钾41.7kg，搅拌，加少量水，维持温度40-45℃，用tlc监测反应，待boc-argoet.hcl完全反应进行抽滤，
b3.抽滤，除去固体不溶物，减压蒸馏丙酮，浓缩后的得到boc-arg(pbf)oet油状物待用。
(4)脱boc
a4.在干燥的300l反应釜中，加入3nhcl/乙酸乙酯溶液120l，搅拌下加入boc-arg(pbf)oet油状物，维持温度10-15℃，室温搅拌。
b4.脱boc完成后，加水洗涤，将产品洗至水相，加适量碳酸钠调节水相ph7。
(5)皂化
a5.将步骤(4)所得水相加95％乙醇100l，搅拌，滴加10nnaoh水溶液调节ph11-12进行皂化。
b5.皂化反应结束后，用6nhcl调节反应液的ph值至7，降温至-10-0℃冷冻结晶；离心，固体用乙酸乙酯搅洗一次，离心甩干收集固体；重结晶得到h-arg(pbf)oh固体。
(6)fmoc-arg(pbf)-oh合成
a6.在反应釜中加入h-arg(pbf)-oh，水120l、thf，用na2co3调节ph＝8.5。
b6.逐渐加入fmoc-osu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)，控制温度15-20℃，ph＝8-9以把arg(pbf)反应完，尽量避免fmoc-osu过量。
tlc点板跟踪反应情况，从加完fmoc-osu开始计算，反应时间6小时。
c6.纯化：用石油醚/乙酸乙酯(2:1)萃取；水相用hcl酸化至ph＝3，搅拌2小时。酸化温度0-10℃；加乙酸乙酯萃取产品；用饱和食盐水洗至ph达到6；无水硫酸钠干燥，真空抽滤除去固体，滤液浓缩，减压浓缩得到固体，真空干燥得到产品。
产品纯度99.6％，最大单杂0.09％，l型异构体0.15％。
实施例2
(1)酯化
a1.将100l无水甲醇加入预先干燥的300l反应釜内，通冰盐水降温至-5～-10℃，滴加二氯亚砜13l。
b1.加入l型的arg.hcl21.5kg，关闭冰盐水，自然升温至室温反应24小时。
c1.升温至35℃反应，tlc点板跟踪反应情况，反应大约48小时结束。
d1.浓缩：反应结束后，减压浓缩得到油状物的arg·ome·2hcl中间体。
(2)引入boc基团
a2.在300l反应釜内加入150l水，再加入碳酸氢钠25.2kg，搅拌；
逐渐加入arg·ome·2hcl油状物；加入四氢呋喃30l；分批加入(boc)2o，26.16kg搅拌，室温反应；
tlc法点板跟踪反应情况，当arg·ome·2hcl反应完即开始处理。
b2.酸化：反应完成后调节ph3-4，用石油醚/乙酸乙酯(50l:25l)萃取，
c2.加盐饱和，回调ph6-7，用乙酸乙酯提产品，用饱和食盐水洗涤有机相。
d2.干燥：向有机相(带产品的乙酸乙酯溶液中)中加入70kg的无水硫酸钠，干燥8小时。
e2.提纯浓缩：抽滤掉硫酸钠固体，减压蒸馏乙酸乙酯相。浓缩后得到的boc-argome.hcl油状物。
(3)引入pbf
a3.在300l反应釜中加入步骤2得到的boc-argome.hcl，pbf-cl31.9kg，丙酮200l，碳酸钾41.7kg，搅拌，加少量水；维持温度40-45℃，用tlc监测反应，待boc-argoet.hcl完全反应进行抽滤，
b3.抽滤，除去固体不溶物，减压蒸馏丙酮，浓缩后的得到boc-arg(pbf)ome油状物待用。
(4)脱boc
a4.在干燥的300l反应釜中，加入3nhcl/乙酸乙酯溶液120l，搅拌下加入boc-arg(pbf)ome.hcl油状物，维持温度10-15℃。室温搅拌。
b4.脱boc完成后，加水洗涤，将产品洗至水相，加适量碳酸钠调节水相ph7。
(5)皂化
a5.将上所得水相加95％乙醇100l，搅拌，滴加10nnaoh水溶液调节ph11-12进行皂化。
b5.皂化反应结束后，用6nhcl调节反应液的ph值至7，降温至-10-0℃冷冻结晶；离心，固体用乙酸乙酯搅洗一次，离心甩干收集固体。重结晶得到h-arg(pbf)oh固体。
(6)fmoc-arg(pbf)-oh合成
a6.在反应釜中加入h-arg(pbf)-oh，水120l、thf，用na2co3调节ph＝8.5。
b6.逐渐加入fmoc-osu(芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺)，控制温度15-20℃，ph＝8-9以把arg(pbf)反应完，尽量避免fmoc-osu过量。
tlc点板跟踪反应情况，从加完fmoc-osu开始计算，反应时间6小时。
c6.纯化：用石油醚/乙酸乙酯(2:1)萃取；水相用hcl酸化至ph＝3，搅拌2小时。酸化温度0-10℃；加乙酸乙酯萃取产品；用饱和食盐水洗至ph达到6；
加无水硫酸钠干燥，8小时；真空抽滤除去固体硫酸钠，滤液浓缩，减压浓缩得到固体，真空干燥得到产品。
产品纯度99.5％，最大单杂0.11％，d型异构体0.17％
对比例
设计a、b和c三组平行的对比例，对比例a和b采用现有技术中的优选方法合成boc-arg(pbf)，现有技术中，提高反应温度，反应效果会非常差，pbf耗量会增加，同时副产物会非常严重，优选的反应温度是5-10℃。对比例c采用本发明的方法合成boc-arg(pbf)。
对比例a：在300ml丙酮中加入boc-arg.hcl.h2o32.88g(含水量6.1％，0.1mol)，搅拌，维持温度5-10℃，维持ph10-12，逐渐加入pbf-cl，31.77g(0.11mol)取样，反应3-4小时取样，hplc测定剩余boc-arg.hcl.h2o量m1。
对比例b：在300ml丙酮中加入boc-arg.hcl.h2o32.88g(含水量6.1％，0.1mol)，搅拌，维持温度5-10℃，维持ph10-12，加入pbf-cl，57.76(0.2mol)反应3-4小时取样，hplc测定剩余boc-arg.hcl.h2o量m2。
对比例c：在300ml丙酮中加入boc-arg-oet.hcl.33.9g(0.1mol)，搅拌，维持ph10-12，维持温度40-45℃加入pbf-cl，31.77g(0.11mol)，反应3-4小时，tlc检测，茚三酮显色，boc-arg-oet.hcl没有剩余。
结果：
测得a的m1boc-arg.hcl.h2o剩余24.4％，b的m2boc-arg.hcl.h2o剩余4.6％。c的boc-arg-oet.hcl完全反应。
由对比例可以看，采用本发明的技术方案pbf-cl用量少的情况下，精氨酸也能完全反应，pbf-cl价格昂贵，因此本发明的成本也大大降低，有利于工业化推广应用。