一种新骨架倍半萜化合物及其制备方法与应用与流程
本发明涉及一种新骨架倍半萜化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
广藿香为唇形科(lamiaceae)刺蕊草属(pogostemon)植物广藿香pogostemoncablin(blanco)benth.的干燥地上部分，为广东道地药材，也是著名的“十大南药”之一。国内外已对广藿香进行了大量的研究，发现其具有广泛的生物活性，在抗菌、抗真菌、调节胃肠道、抗炎、镇痛等方面显示出潜在的药用价值，并已成为40余种中成药如“藿香正气丸(水)”、“藿香清胃片”、“藿香祛暑软胶囊”等的重要组成成分。此外，广藿香油还是诸多日常生活用品如化妆品、杀虫剂和定香剂等的生产配料，为重要的出口创汇产品。
迄今为止，国内外研究者已从广藿香中分离得到140余个单体化合物，其主要的结构类型包括黄酮类、苯丙素类、萜类(单萜、倍半萜、二萜等)、甾体类、生物碱类以及脂肪酸类等。其中倍半萜类化合物种类繁多，含量丰富。
因此，从广藿香药材中分离提取出新的化合物并且以此为基础进行衍生，具有重要的现实意义。
技术实现要素：
本发明提供了式(a)所示的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，
其中，r1～r12分别独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、c1～c6的烷基或c1～c6的烷氧基。
进一步地，r12选自羟基或c1～c6的烷氧基。
进一步地，r2～r8均为氢。
进一步地，所述式(a)化合物如式(b)所示：
进一步地，r1、r9、r10、r11分别独立地选自c1～c4的烷基。
进一步地，所述化合物如式ⅱ所示：
本发明还提供了一种制备前述式ⅱ化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：
a、取广藿香药材，水蒸气蒸馏提取，干燥除水，得到广藿香挥发油；
b、取步骤a所得广藿香油，采用硅胶柱色谱，依次以石油醚：乙酸乙酯＝100:0、100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、3:1、0:100为洗脱剂进行梯度洗脱，得到石油醚：乙酸乙酯＝10:1时的洗脱液f28；
c、取步骤b所得洗脱液f28上反相中压柱色谱，依次以甲醇：水＝50：50、65：35、80：20、90：10、100：0为洗脱剂进行梯度洗脱，根据薄层色谱检视，合并相似组分，得到甲醇：水＝65：35时的洗脱液f28-b；
d、取步骤c所得洗脱液f28-b，经正相柱色谱，以石油醚-三氯甲烷-甲醇＝5:5:1为洗脱剂洗脱后，根据薄层色谱法合并相似组分，回收溶剂，得到3个亚组分f28-b-1－f28-b-3；
e、取步骤d所得洗脱液f28-b-2经制备薄层色谱法以及反相半制备液相色谱，以65％甲醇水洗脱，分离得到目标化合物，即得式ⅱ所示化合物。
进一步地，步骤a中，所述水蒸气蒸馏提取的时间为16～20h；；
步骤b中，梯度洗脱的条件如下：
步骤c中，梯度洗脱的条件如下：
步骤d中，所述正相柱色谱为正相sephadexlh-20柱色谱，洗脱剂石油醚-三氯甲烷-甲醇＝5:5:1的体积为0.52l；
步骤e中，制备薄层色谱的展开剂为正己烷-丙酮＝5:1，反相液相制备色谱的洗脱剂为65％甲醇水。
本发明还提供了前述的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物在制备舒张血管药物中的应用；优选的，所述
本发明还提供了一种药物组合物，它是前述的化合物、或其晶型、或其立体异构体、或其药学上可接受的盐、或其溶剂合物、或其前体药物、或其代谢产物，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
试验结果表明，本发明化合物具有较好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
本发明中：
所述c1～c4的烷基是指c1、c2、c3、c4的烷基，即具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基等等。
所述c1～c6的烷基是指c1、c2、c3、c4、c5、c6的烷基，即具有1～6个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、己基等等。
本发明的一种或多种化合物可以彼此联合使用，也可选择将本发明的化合物与任何其它的活性试剂结合使用，。如果使用的是一组化合物，则可将这些化合物同时、分别或有序地对受试对象进行给药。
本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明式ⅱ化合物的hresims图。
图2为本发明式ⅱ化合物的红外光谱图(ir)。
图3为本发明式ⅱ化合物的1h-nmr图。
图4为本发明式ⅱ化合物的13c-nmr图。
图5为本发明式ⅱ化合物的hmbc、cosy和noesy信号图。
图6为本发明式ⅱ化合物的x单晶图。
图7为本发明式ⅱ化合物对大鼠主动脉的舒张作用图：其中，横坐标为浓度的对数，纵坐标为收缩率(％)，广藿香半缩酮c(pocahemiketalc)是指本发明目标化合物。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1本发明化合物的制备
(1)实验材料：
①药材
广藿香药材于2012年11月采自广东省阳春县广藿香种植基地，经成都中医药大学中药鉴定教研室龙飞博士鉴定为唇形科刺蕊草属植物广藿香(pogostemoncablin(blanco)benth.)的全草。
②试剂和填料
柱层析硅胶，200～300目(试剂级)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
薄层层析硅胶g、gf254和h(化学纯)，购于青岛海洋硅胶干燥剂厂；
中压液相色谱仪：búchigradientformerb-687，rpc18，43-60μm；
agilentzorbaxsb-c18(9.4×250mm，5μm)半制备型柱；
sephadexlh-20葡聚糖凝胶，购于瑞典amersham公司；
gf254硅胶制备薄层，购于烟台江友硅胶开发有限公司；
石油醚、正己烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等分析纯试剂，购于成都科龙化工试剂厂。
③实验仪器
agilent1220高效液相色谱仪(美国安捷伦)；
waterssynaptg2hdms高分辨飞行时间质谱(美国waters)；
bruker-aviiihd-600核磁共振仪(瑞士bruker)；
傅里叶变换红外光谱仪：nicolet5700红外光谱仪(美国thermo公司)；
x-单晶衍射仪：brukerapexⅱduo双光源单晶衍射仪；
shimadzuuv-260紫外-可见分光光度仪(日本shimadzu)；
安东帕mcp200旋光测定仪(奥地利安东帕)；
bp211d十万分之一电子天平(瑞士sartorius)；
r-210旋转蒸发器(瑞士buchi)；
dzg-6050型真空干燥箱(上海森信)。
(2)成分的分离纯化：
①、药材的提取：取干燥的广藿香药材地上部分40kg，采用大型的改良水蒸气蒸馏装置进行提取，收集得到挥发油，然后用无水硫酸钠干燥除水，最终得到广藿香挥发油215g；
②、采用硅胶柱色谱(100－200目，5kg，20×150cm)对广藿香挥发油(215g)进行色谱分离，以石油醚－乙酸乙酯(100:0－0:100)为流动相按照表1进行梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并组成相似的流份，回收溶剂得到31个洗脱部分(f1－f31)。
③、f28(10.8g)通过反相中压液相色谱以50－100％甲醇溶液按照表2进行梯度洗脱，得到f28-a－f28-f共6分洗脱部分；f28-b部分经正相sephadexlh-20柱色谱，以石油醚-三氯甲烷-甲醇5:5:1为洗脱剂，根据薄层追踪，分离得到3个亚组分(f28-b-1－f28-b-3)；f28-b-2经制备薄层色谱法(展开剂：正己烷∶丙酮＝5∶1)以及反相半制备液相色谱，以65％甲醇水洗脱，分离得到目标物(8.4mg,tr＝55.4min)。
表1硅胶柱色谱的洗脱条件
表2反相中压液相色谱的洗脱条件
(4)目标化合物的鉴定：
无色晶体(甲醇)；无暗斑，碘显黄色，喷10％硫酸乙醇溶液在105℃下显紫红色；由hresimsm/z259.1317[m+na]+可确定分子式为c14h20o3(见图1)。
红外光谱中(见图2)可以看出具有明显的oh信号(3306.3cm-1)和羰基信号(1717.2cm-1)。
化合物的1hnmr谱(见图3)中可以看出有四个单峰甲基信号(δ0.90,0.97,1.26,1.54)和1个活泼oh质子信号(δ6.06)；化合物的13cnmr谱(见图4)给出14个碳信号，dept谱显示这些碳信号分别为4个甲基、3个亚甲基、1个次甲基和6个季碳(含1个酯羰基δc169.5、2个双键季碳δc135.1,162.0、1个双连氧季碳δc104.0、以及2个脂肪族季碳δc45.2和44.7)。表明该化合物为一个降碳的倍半萜衍生物。在hmbc谱(图5)中，h2-4、h2-7和h3-12与一个双键季碳(δc135.1)相关；h2-4和h-5与另一个双键季碳(δc162.0)相关，表明在双环[3.2.1]辛烷片段中，存在c-2＝c-3四取代双键。此外，结合h3-11与c-3、c-10的hmbc相关信号和c-10的化学位移(δc104.0)，推断c-10为一个半缩酮季碳，连接c-3和甲基c-11。虽然羰基(c-9)没有显示任何相关hmbc信号，但根据分子式和不饱和度可知，化合物c-9为一个酯羰基，与c-2＝c-3四取代双键以及半缩酮季碳c-10共同组成一个半缩酮-α,β-不饱和-γ-内酯。化合物的noesy(图5)显示h3-11和h3-13与h-4a相关，表明h3-11与“c-1–c-8–c-5”桥处于环庚烷的同侧。进一步通过x-射线单晶衍射(图6)确定化合物的绝对构型为1r,5r,10r[flackparameter＝0.17(15)]，命名为广藿香半缩酮c(pocahemiketalc)。因此，本发明新化合物的化学结构，包括绝对构型得到了确定，如式ⅱ所示：
(5)核磁共振氢谱(1h-nmr)：bruker-aviiihd-600spectrometer测定，数据见表3。
(6)核磁共振碳谱(13c-nmr)：bruker-aviiihd-600spectrometer测定，数据见表3。
表3化合物的1hnmr(600mhz)、13cnmr(150mhz)核磁数据(测定溶剂：acetone-d6；δ：ppm；j：hz)
(7)x-单晶：brukerapexⅱduo双光源单晶衍射仪测定，数据如下：
分子式：c14h20o3,m＝236.30,单斜晶系,
为了说明本发明的有益效果，本发明提供以下试验例。
试验例1舒张血管试验
(1)实验材料：
①药物
受试化合物用dmso配置成1×10-2mol/l的贮备液，-10℃保存。阳性药物(甲磺酸酚妥拉明)用生理盐水配置。
②动物
sd大鼠，清洁级，雌雄不拘，体重200～240g，由成都中医药大学实验动物研究中心提供。生产质量合格证号：scxk(川)2008-11。
③试剂
甲磺酸酚妥拉明，中国药品食品检定研究院。
krebs-henselei营养液(k-h液)：组成(mm):nacl,120；kcl,4.6；kh2po4,1.2；mgso4,1.2；nahco3,25；glucose,10；cacl2,2.5，ph4.8。
二甲基亚砜(dmso)，分析纯，500ml/瓶，购于成都科龙化工试剂厂。
④实验仪器
电子天平(esj120-4型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；
肌张力传感器(jh-2型，中国北京航天医学工程研究所)；
生物机能试验系统(bl-420f型，成都泰盟科技有限公司)；
离体组织器官恒温灌流系统(hv-4型，成都泰盟科技有限公司产品)。
(2)实验方法：
①血管环的制备
sd大鼠脱臼处死后迅速开胸，剪下胸主动脉降支，置于盛有4℃充有混合氧气(95％o2和5％co2)的k-h液体中，冲洗血管血迹，剔除周围脂肪和结缔组织，用手术刀切成3～4mm长的血管环。标本的端用不锈钢钩垂直悬吊于血管平滑肌浴槽中，另一端与肌张力换能器连接，使用生物机能实验系统记录血管环张力的变化。浴槽中k-h液保持37℃，持续通以95％o2和5％co2混合气体，给予标本张力1g平衡1.5～2h，每15min换液一次。
②化合物对苯肾上腺素(phe)所致的主动脉环收缩反应的影响
在主动脉血管环稳定后，加入phe(1μm)，待血管稳定收缩后，加入不同剂量的化合物，以甲磺酸酚妥拉明为阳性对照，加入药物达到坪值后的血管张力幅度与phe诱发的血管环的最大收缩之间的比率反应血管张力的变化。
③实验结果和评价：
通过比较发现，实验中主要观察记录了药物浓度分别为1×10-6mol/l,3×10-6mol/l,10-5mol/l,3×10-5mol/l和10-4mol/l时的张力变化，可以观察到化合物对phe诱发的主动脉血管收缩有明显的舒张作用，经过graphpadprism5统计分析，本发明化合物的ec50值分别为16.32μm，其结果见图7，阳性药的ec50值为66.02nm。
ec50，半最大效应浓度(concentrationfor50％ofmaximaleffect，ec50)是指能引起50％最大效应的浓度；ec50是评价药物安全的重要指标，其中ld50/ed50、td50/ed50、tc50/ec50等统称为治疗指数，在评价药物的安全性时，通常其值越大越安全。
试验结果表明，本发明化合物具有较好的舒张血管作用，为临床上筛选和/或制备舒张血管药物提供了一种新的选择。
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