一种过表达ZEB2基因质粒及其构建方法和应用与流程

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用。

背景技术：

急性肾损伤(acutekidneyinjury，aki)是临床各科室最常见的急危重症之一，可由多种原因引起，有关aki的发生机制一直是肾脏病领域关注的重要科学问题。目前认为，aki也是一种炎症反应介导的疾病，但缺血再灌注启动肾组织炎症反应的机制尚不完全清楚。从轻微血肌酐升高到严重无尿性aki，aki程度和临床表现不一而足，aki与患者病死率、慢性肾脏病(ckd)的发生以及维持性透析率密切相关。流行病调查数据显示，aki发病率逐年增高，已由1988年的610例(每百万人)增加至2009年的2888例(每百万人)，在普通住院患者中aki发病率为3％-5％，而在icu中更高达30％-50％；同时对于aki的预后及转归较以往有了更加深入的认识。因此，如何防治aki的发生、发展以及寻找有效的治疗aki的手段和药物显得尤为重要。

基因工程，又称为基因重组技术，是二十世纪七十年代发展起来的在体外对dna进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分别为：酶、目的基因、载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。

zeb2又叫zfhx1b、sip1等，属于锌指结构转录因子中的e盒结合锌指蛋白(zincfingere-boxbindinghomeobox)家族的成员，是胚胎发育中必需的转录因子，首次关于zeb2的报道是在非洲爪蟾的胚胎中发现了zeb2的mrna。zeb2基因定位于染色体2q22.3上，由zfhx1b基因所编码，包含9个外显子和8个内含子，cds区为3645bp。zeb2由1215个氨基酸残基组成，其分子量大约为136kd，包含2个锌指簇(zincfingercluster)和连接这两个锌指簇的可变序列。n端和c端中的每一个锌指结构都能够独立结合目的基因的受调节区域中的5’-cacct序列。zeb2属于转录因子，最初的研究认为定位于核内，最近的研究表明，在胞浆及胞核中均有表达。它参与细胞生长、分化、凋亡、胚胎发育及炎症反应等多种生命活动的调控。

人源zeb2基因已在genbank注册，注册号bc-127102.1，定位于2q22.3，全长3912bp，其中cds序列3645bp，编码1215个氨基酸。人源zeb2基因的组织表达谱分析显示：该基因在人的许多肿瘤(胃癌、乳腺癌、鼻咽癌等)细胞以及肥大细胞中均有表达，研究发现，zeb2基因在大鼠腹腔巨噬细胞，人单核细胞thp-1中也有表达。

因此，为了进一步研究zeb2基因功能，目前急需一种有助于zeb2基因功能研究，并且为其对炎症在aki病程中的作用提供研究基础的有用分子生物学工具。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种有助于zeb2基因功能研究，并且为其对炎症在aki病程中的作用提供研究基础的过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种过表达zeb2基因质粒，由zeb2基因cds序列与pegfp-c2真核表达载体的重组构建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位于zeb2基因的第134-3778位；氨基酸序列如序列表seqidno:2所示。

一种构建上述过表达zeb2基因质粒的方法，包括如下步骤：

(1)裂解hk-2细胞，提取rna进行逆转录得到zeb2cdna；

(2)pcr扩增出人工zeb2基因的cds序列片段；

(3)zeb2基因的cds序列片段的纯化；

(4)对所获得的基因片段和pegfp-c2真核表达载体进行bamhi和xbai双酶切，并进行连接；

(5)将连接产物转化至大肠杆菌tg1中，并挑去阳性克隆进行培养，然后抽提质粒。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中提取rna后，对其进行变性处理，具体步骤为：将rna在65℃中放置5-10min后，转移至冰水中放置。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中逆转录反应依照rtmastermix逆转录试剂盒的产品说明书进行，逆转录的反应体系包括：5×rtmastermix、rna、nuclease-freewater；具体步骤如下：

(1)配制反应体系：5×rtmastermix2μl+rna2μl+nuclease-freewater6μl；

(2)将上述反应体系放置37℃，并作用15min；

(3)将上述反应体系转移至50℃，并作用5min；

(4)将上述反应体系转移至98℃，并作用5min；

(5)将上述反应体系转移至4℃，冷却后冻存，即得到cdna。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中pcr扩增cds序列片段时所需的上、下游引物序列如下：

上游引物：zeb2-f:5’-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3’

下游引物：zeb2-r:5’-gctctagagctcacatgccatcttcc-3’。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中pcr扩增反应根据primestarmax扩增酶产品说明书进行，pcr的反应体系包括：2×primestarmax、cdna样品、上下游引物、高纯水；具体步骤如下：

(1)配制反应体系：2×primestarmax25μl+cdna1μl+引物各1μl+高纯水22μl；

(2)将上述反应体系轻轻混匀后放入pcr仪器，设置如下程序运行；

(3)将上述pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳；

(4)观察结果并回收目的dna片段。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中zeb2的pcr产物和pegfp-c2载体进行bamhi和xbai的双酶切反应依照限制性内切酶产品说明书进行，酶切体系如下：bamhi限制性内切酶、xbai限制性内切酶、10×buffertango、zeb2的pcr产物或pegfp-c2载体；具体步骤如下：

(1)配制反应体系：10×buffertango2μl+bamhi和xbai各0.5μl+zeb2的pcr产物或和pegfp-c2载体各7μl；

(2)将上述反应体系放置37℃水浴锅中，并作用4-6h；

(3)将上述酶切产物进行1-1.2％琼脂糖凝胶电泳；

(4)观察结果并回收目的dna片段。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中连接方法具体如下：

(1)配制去磷酸化体系10μl：ciap1μl、10×ciap缓冲液1μl、pegfp-c2载体8μl，对载体进行去磷酸化处理；

(2)配制连接体系10μl：ciap去磷酸化后pegfp-c2载体0.5μl、10×t4dna连接酶缓冲液1μl、t4dna连接酶1μl、pcr酶切纯化产物7.5μl；

(3)将上述反应体系置于0.5ml的离心管中混匀，16℃水浴过夜。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(5)中连接产物转化至大肠杆菌tg1中的具体步骤如下：

(1)取出储存于﹣80℃的tg1感受态细胞，冰浴解冻后加入10μl连接产物，混匀，冰上静置30min；

(2)42℃热休克90s，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培养液，37℃、250rpm振荡培养45min；

(4)取出约100μl转化液涂于带有相应抗性的lb固体培养基上，37℃倒置培养8-12h。

一种使用上述过表达zeb2基因质粒的应用，将所述过表达zeb2基因质粒转染入人hk-2细胞系中，抑制人hk-2细胞中炎症因子的分泌。

本发明相比现有技术的优点在于：

(1)有助于研究zeb2基因功能，并且为研究其对炎症在aki病程中的作用提供了有用分子生物学工具；

(2)运用基因重组技术，针对zeb2基因，构建重组真核表达载体pegfp-c2-zeb2，并将其转染至人hk-2细胞株中，研究zeb2过表达对hk-2细胞中炎症因子表达的影响，为进一步研究zeb2的功能，以及aki的基因治疗奠定了基础。

附图说明

图1是实施例1中的一种过表达zeb2基因质粒的真核表达载体pegfp-c2的结构示意图；

图2是实施例2中的一种过表达zeb2基因质粒的构建方法的真核重组载体pegfp-c2-zeb2的结构示意图；

图3是实施例2中的一种过表达zeb2基因质粒的构建方法的真核重组载体pegfp-c2-zeb2的酶切鉴定图谱；

图4是实施例3中的一种过表达zeb2基因质粒的表达过程中真核重组载体pegfp-c2-zeb2在hek293t细胞中的表达情况图；

图5是实施例4中的一种过表达zeb2基因质粒的应用的转染组的hk-2细胞炎症因子(il-6、tnf-α)mrna表达水平的情况图；

图6是实施例4中的一种过表达zeb2基因质粒的应用的转染组的hk-2细胞炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白表达水平的情况图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种过表达zeb2基因质粒，由zeb2基因cds序列与pegfp-c2真核表达载体的重组构建而成；其核苷酸如序列表seqidno:1，位于zeb2基因的第134-3778位；氨基酸序列如序列表seqidno:2所示；此外，pegfp-c2真核表达载体的结构如图1所示。

实施例2

本实施例的一种过表达zeb2基因质粒的构建方法，包括如下步骤：

1、zeb2cdna的提取

(1)取出细胞培养皿弃净培养基，用1ml的pbs缓冲液清洗培养的hk-2细胞的细胞面(2-3次)；

(2)加入1ml的trizol裂解细胞10min，用移液器轻轻混匀细胞后将细胞裂解液转移至离心管中，颠倒混匀后室温静置5min；

(3)加入trizol的1/5量的三氯甲烷(4℃预冷)，剧烈混匀后室温静置5min，高速低温离心15min(4℃，12000r/min)；

(4)将0.4ml上层液体转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀后静置60min(-20℃)，高速低温离心15min(4℃，12000r/min)后弃上清；

(5)加入1ml75％的乙醇溶液后振荡混匀，高速低温离心5min(4℃，12000r/min)后弃上清，并干燥5min；

(6)加入20μl无酶水溶解沉淀后，用于逆转录，也可冻存于-80度；

(7)rna的变性

将抽提好的rna进行变性，变性步骤如下：将rna在65℃中放置5min后，迅速转移至冰水中放置2min。

逆转录反应体系(10μl)如下：

工艺步骤包括：

①将上述反应体系放置37℃，并作用15min；

②将上述反应体系转移至50℃，并作用5min；

③将上述反应体系转移至98℃，并作用5min；

④将上述反应体系转移至4℃，冷却后冻存，即得到cdna。

2、zeb2基因的克隆

(1)根据zeb2的cds序列，设计上下游引物，引物序列分别如下：

zeb2-f:5’-ggggtaccccatgaagcagccgatcat-3’(含bamhi酶切位点)

zeb2-r:5’-gctctagagctcacatgccatcttcc-3’(含xbai酶切位点)

(2)pcr过程中所用的酶优选为takara公司的primestarmax高保真酶，其反应体系和反应程序如下：

反应体系(50μl)：

将上述反应体系混匀后放入pcr仪器，设置如下程序运行：

(3)将上述pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳；

(4)观察结果并回收目的dna片段；

将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过与dnamarker的对比，结果发现在3645bp出得到一条带，大小与zeb2目的片段(包括酶切位点)的大小基本一致，表明成功扩增出人zeb2基因的cds序列。

3、zeb2目的片段的纯化

纯化所用的试剂盒优选为爱思进公司的胶回收试剂盒，纯化步骤如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的dna的琼脂糖凝胶，用滤纸吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量，每100mg等于100μl体积；

(2)加入3个凝胶体积的bufferde-a，混合均匀后于75℃加热(低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热)，间断混合(每2～3min)，直至凝胶块完全熔化；

(3)加0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，混合均匀。当分离的dna片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇；

(4)吸取步骤3中的混合液，转移到dna制备管(置于2ml离心管)中，12,000rpm离心1min。弃滤液；

(5)将制备管置回2ml离心管，加500μlbufferw1，12,000rpm离心30s，弃滤液；

(6)将制备管置回2ml离心管，加700μlbufferw2，12,000rpm离心30s，弃滤液；以同样的方法再用700μlbufferw2洗涤一次12,000rpm离心1min；

(7)将制备管置回2ml离心管中，12,000rpm离心1min；

(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加30μleluent或去离子水，室温静置1min。12000rpm离心1min洗脱dna。

4、pcr产物和真核表达载体的双酶切

对zeb2的pcr产物和pegfp-c2载体进行bamhi和xbai的双酶切，酶切体系和方法如下：

酶切体系(10μl)：

酶切方法：将以上反应体系置于0.5ml的离心管中混匀，37℃水浴6h(温度和时间的选择依据内切酶的说明书而定)，1.2％琼脂糖凝胶电泳后迅速观察结果并回收目的dna片段，避免紫外长期照射。

5、酶切产物的连接

对zeb2和pegfp-c2的双酶切产物进行连接，连接所用的酶优选为t4连接酶；在连接之前，为避免载体的自身环化，故对载体进行去磷酸化处理；

去磷酸化体系(10μl)：ciap1μl、10×ciap缓冲液1μl、pegfp-c2载体8μl；

连接体系(10μl)：ciap去磷酸化后的pegfp-c2载体0.5μl、10×t4dna连接酶缓冲液1μl、t4dna连接酶1μl、pcr酶切纯化产物7.5μl；

连接方法：将上述反应体系置于0.5ml的离心管中混匀，16℃水浴过夜。

6、连接产物的转化

转化所用的大肠杆菌感受态为：tg1，转化步骤如下：

(1)取出储存于﹣80℃的tg1感受态细胞，冰浴解冻后加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上静置30min；

(2)42℃热休克90s(不要摇晃)，迅速取出置冰上3min；

(3)加入500μllb培养液，37℃、250rpm振荡培养45min；

(4)取出约100μl转化液涂于带有相应抗性的lb固体培养基上，37℃倒置培养12h。

7、质粒的小量抽提

挑去8个阳性克隆加入含有2mllb培养基(氨苄抗性)的离心管中，37℃、250rpm振荡培养12h，然后对菌液进行质粒抽提，所用的试剂盒为爱思进公司的质粒小量抽提试剂盒，抽提步骤如下：

(1)用灭菌牙签挑取细菌的单克隆，放入盛2ml含有相应抗生素的lb培养液的15ml离心管中，37℃、250rpm振荡培养12h；

(2)将约1ml菌液转入1.5ml离心管中，4℃、12,000rpm离心1min，上清；

(3)加250μlbuffers1悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块；

(4)加250μlbuffers2，温和并充分地上下翻转6次使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液；

(5)加350μlbuffers3，温和并充分地上下翻转混合8次，12,000rpm离心10min；

(6)吸取步骤5中的离心上清并转移到制备管(置于2ml离心管中)，12000rpm离心1min，弃滤液；

(7)将制备管置回离心管，加500μlbufferw1，12,000rpm离心1min，弃滤液；

(8)将制备管置回离心管，加700μlbufferw2，12,000rpm离心1min，弃滤液；以同样的方法再用700μlbufferw2洗涤一次。弃滤液；

(9)将制备管置回2ml离心管中，12,000rpm离心1min；

(10)将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加80μl无菌水，室温静置1min，12,000rpm离心1min，弃制备管；

(11)样品置-20℃备用，图2为真核重组载体pegfp-c2-zeb2的结构示意图。

8、对质粒进行酶切鉴定和送测序

对抽提好的质粒进行bamhi和xbai的双酶切鉴定，酶切体系和方法如下：

酶切体系(10μl)：

酶切方法：将上述反应体系置于0.5ml的离心管中混匀，37℃酶切6h后，琼脂糖凝胶电泳、紫外分光仪观察、凝胶成像仪拍照保存，并将酶切鉴定正确的质粒送生工生物公司测序；其中，真核重组载体pegfp-c2-zeb2的酶切鉴定图谱见图3，其中标示1为pegfp-c2双酶切，标示2为zeb2的pcr产物，标示3为pegfp-c2-zeb2双酶切；

将测序结果通过blast比对，发现与gencbank中公布的序列一致，目的基因片段长度实为3645bp。

实施例3

一种过表达zeb2基因质粒的表达，根据实施例2得到过表达zeb2基因质粒后，对其进行表达，具体步骤如下：

1、细胞培养

本发明所需培养的细胞为：hek、293t、thp-1、大鼠腹腔巨噬细胞、hk-2细胞，首先复苏细胞，并用含有体积比为10％胎牛血清的dmem高糖培养基于37℃、5％co2的细胞培养箱中进行培养，并及时换液和传代。

(1)细胞复苏：将液氮内冻存的细胞取出，迅速浸入37℃的温水中并轻轻摇晃至完全融化(复温时间应控制在两分钟以内)，迅速转移细胞悬液至离心管中并加入5ml培养基，低速离心(1000r/min，2min)后弃尽上清，加入5ml培养基轻轻悬浮细胞后接种至培养皿中开始培养；

(2)细胞换液：轻轻弃去旧的细胞培养基，pbs温和清洗后加入新鲜的完全培养基(含有10％胎牛血清的高糖dmem)继续培养(注：pbs和新鲜的培养基需要37℃预热)；

(3)细胞传代：在细胞中加入1ml的胰酶后置于培养箱中进行消化，在显微镜下观察细胞形态变化，及时加入完全培养基终止消化，转移细胞悬液至离心管中低速离心(1000r/min，2min)后弃上清，用pbs洗涤一次后加入0.2ml培养基悬浮细胞并重新接种至培养皿中继续培养；

(4)细胞冻存：将传代过程中的细胞悬液低速离心(1000r/min，2min)后弃上清，加入1ml细胞冻存液(配方见)轻轻悬浮细胞后分装至细胞冻存管中进行分级冻存，即4℃0.5-1h、-20℃1-2h、-80℃约24h、液氮冻存。

2、质粒瞬时转染(脂质体法)

(1)用250μl的opti-mem稀释5μl的脂质体和总量约为2μg的dna，温和混匀，室温静置5min；

(2)将上述步骤中的两种溶液温和混匀，室温静置20min，以形成dna-脂质体复合物；

(3)弃去培养皿中的培养液，加入1mlopti-mem转染液，将(2)中的dna-脂质体复合物缓慢滴加到培养皿中，轻轻摇晃培养皿混匀；

(4)37℃、5％co2培养6h后，用预温的pbs清洗一次，换新鲜的完全培养液后继续培养约24h。

3、免疫印记

(1)总蛋白提取：离心收集细胞，用pbs清洗2-3次后，加入0.5ml细胞裂解液，冰上裂解10min，然后高速冷冻离心10min，收集0.4ml上清液，加入上样缓冲液，沸水浴5min，放置冰上待电泳；

(2)安装制胶板并检漏，首先配制10％分离胶，用1ml异丙醇压线，待充分凝固后(约1h)，配制浓缩胶，插入所需梳子，待充分凝固后使用；

(3)安装电泳系统，在电泳槽中加入500ml电泳缓冲液，将10μl样品加入上样孔后开始电泳(80v电泳0.5h+100v电泳1.5h)；

(4)电泳结束后，切下sds-page胶，应用三明治方式(从下往上依次是滤纸+胶+pvdf膜+滤纸)进行湿转；

(5)安装电转系统，在电转槽中加入500ml预冷的电转缓冲液，并将整个电转槽放入冰水中，开始电转(100v电转2h)；

(6)电转结束后，轻轻取下pvdf膜，用丽春红染色鉴定转膜是否成功，转膜成功后，用tbst洗去丽春红，室温封闭至少1h；

(7)封闭完之后，用tbst洗膜(3次，5min)后，加入一抗溶液4℃孵育过夜；

(8)次日，用tbst洗膜(3次，10min)后，加入二抗溶液室温孵育2h。然后用tbst洗膜(3次，20min)；

(9)用ecl发光剂检测pvdf上的条带，并用x射线胶片暗室显影。

实验结果显示，真核重组表达载体pegfp-c2-zeb2在真核细胞内能够正常表达，为后续的研究奠定了基础；图4为真核重组载体pegfp-c2-zeb2在hek293t细胞中的表达情况图，图中，标示1为未转染的293t细胞裂解液，标示2为转染pegfp-c2-zeb2的293t细胞裂解液。

实施例4

一种过表达zeb2基因质粒的应用，将所述过表达zeb2基因质粒转染入人hk-2细胞系中，研究过表达zeb2基因对人hk-2细胞株炎症因子(il-6、tnf-α)分泌的影响；具体步骤如下：

1、将对数生长期的细胞进行传代，得到细胞悬液，并以适当密度(约1×108·l-1)将细胞接种到6孔板中，培养约24h，待到细胞密度为80％左右，进行pegfp-c2-zeb2的瞬时转染，转染一段时间后收集细胞悬液；

2、根据制造商的说明书，使用trizol试剂的将总rna从培养hk-2细胞中分离，总rna用无rnase的水洗脱，并储存在-80℃；

3、使用转录子第一链cdna合成试剂盒合成cdna，并使用具有sybr-greenmastermix的检测系统进行实时pcr，从invitrogen获得q-pcr引物，样品一式两份，每次测量重复至少三次，q-pcr结果如图5所示；

图5a的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的转染上调了zeb2的表达；图5b的qrt-pcr的分析表明：pegfp-c2-zeb2的转染下调了tnf-α和il-6的表达(*p<0.05和**，p<0.01vs正常组；#p<0.05和##p<0.01vs空白质粒组)；

综合以上结果发现：与未转染组细胞的炎症因子(il-6、tnf-α)mrna水平相比，转染了pegfp-c2-zeb2组的hk-2细胞中炎症因子il-6和tnf-αmrna的表达均有明显降低，且差异存在统计学意义(p＜0.05)；说明过表达zeb2基因能够明显降低炎症因子(il-6、tnf-α)mrna水平，从而抑制炎症反应。

另外，提取总蛋白并检测浓度，进行凝胶电泳，湿转硝酸纤维膜后，用5％脱脂牛奶封闭60min，加入1：200稀释的zeb2兔抗、1：1000稀释的il-6、tnf-α和1∶1000稀释的beta-actin内参一抗后，4℃孵育过夜，用tbst漂洗3次，加入相应浓度的二抗，室温下放置60min，tbst漂洗3次，加入eclplus，暗视条件下显影，用quantityone软件对蛋白条带分析，westernblot结果如图6所示；

图6a的westernblot的分析表明：pegfp-c2-zeb2的转染上调了zeb2的表达；图6b的westernblot的分析表明，pegfp-c2-zeb2的转染下调了tnf-α和il-6的表达(*p<0.05和**p<0.01与正常组相比；#p<0.05和##p<0.01与vector组相比)；

综合以上结果发现：与未转染组细胞的炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白水平相比，转染了pegfp-c2-zeb2组的细胞的炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白均有明显降低，且差异存在统计学意义(p＜0.05)；说明过表达zeb2基因能够明显降低炎症因子(il-6、tnf-α)蛋白水平，从而抑制炎症反应。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>安徽医科大学

<120>一种过表达zeb2基因质粒及其构建方法和应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

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