一种C‑肽免疫抗原和抗C‑肽多克隆抗体及其制备与应用的制作方法

本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种c-肽免疫抗原和抗c-肽多克隆抗体及其制备与应用。

背景技术：

c肽是含31个氨基酸的多肽，它和胰岛素的a、b链组成胰岛素原，是a、b链的连接链，在胰岛素原分子的折叠，二硫键的正确配对中起重要作用。c肽由胰岛素原裂解产生，一分子胰岛素原合成一分子c肽与一分子的a、b链，后二者合成胰岛素。c肽与胰岛素共同存在于同一颗粒囊内最终以等分子分泌。c肽不通过肝酶代谢，而主要经过肾脏清除，其清除速率慢，半衰期为20min，明显较长，其基础水平平均值为0.4nml/l，当人进食葡萄糖后1h升至1.68nmol/l，反映早期的胰岛素功能，3h降至0.65nmol/l。故检测人血清中的c-肽，能准确测定血循环中c肽水平，能反映β细胞合成与释放胰岛素功能。

糖尿病是一组由胰岛素分泌绝对或相对不足所导致的以慢性高血糖为特征的代谢综合征。最新研究显示，该疾病在中国成年人群中，约有9240万例病例，占总人口数的9.7％，此外，另有1482万成年人具有前驱糖尿病症状，约占总人口数的1.55％。目前临床诊断筛查中，血清c肽水平对糖尿病的分型诊断、治疗方案选择和疗效监测具有重要的临床参考意义，是筛查诊断糖尿病患者主要的常规必检项目，此外，对于胰岛素瘤的诊断亦有重要参考价值。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种c-肽免疫抗原的制备方法，该制备方法以c-肽作为原料偶联载体蛋白多聚赖氨酸(pll)制得c-肽免疫抗原。

本发明的另一目的在于提供上述制备方法制备得到的c-肽免疫抗原。

本发明的再一目的在于提供一种抗c-肽多克隆抗体，该抗c-肽多克隆抗体利用上述c-肽免疫抗原制备。

本发明的第四个目的在于提供上述c-肽免疫抗原和抗c-肽多克隆抗体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种c-肽免疫抗原的制备方法，包含如下步骤：

(1)8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂的合成：将王树脂和赖氨酸混合进行偶联合成，得到8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂；

(2)树脂裂解和去保护：将步骤(1)制得的8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂与裂解试剂混合，然后搅拌反应；反应后将反应液过滤，收集滤液，浓缩，浓缩物用水溶解并用乙醚萃取，得到七聚赖氨酸水溶液；

(3)七聚赖氨酸的分离与纯化：采用高效反相液相色谱仪对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，检测280nm吸收值，收集主峰析出液，浓缩，干燥，得到七聚赖氨酸；

(4)将步骤(3)制得的七聚赖氨酸与mbs(3-马来酰亚胺基苯甲酸琥珀酰亚胺酯)混合，搅拌反应，得到mbs活化的七聚赖氨酸；将c-肽与mbs活化的七聚赖氨酸混合，搅拌反应，得到c-肽免疫抗原粗品；

(5)在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，将甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯依次滴加到fmoc-cys-oh中，反应5～10min；加入乙酸酐，在-15～-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1～1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15～30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取，将fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍fmoc-cys-oh质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的c-肽免疫抗原粗品溶于pbs缓冲液，然后使用中压过柱，采用pbs缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用pbs缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30～60min，得到c-肽免疫抗原；

步骤(1)中所述的王树脂和赖基酸的摩尔比优选为1∶7；

步骤(1)中所述的偶联合成的具体操作优选为：以dcm溶涨树脂，然后按照去保护、活化、偶联步骤，在abi431多肽合成仪上依次连接第1级到第3级赖氨酸；

步骤(2)中所述的裂解试剂优选包含如下组分：tfa900ml/l、苯甲硫醚50ml/l、二巯基乙烷30ml/l、苯甲醚20ml/l；

步骤(2)中所述的搅拌反应的时间优选为2h；

步骤(2)中所述的浓缩优选为低压旋转浓缩；

步骤(2)中所述的乙醚的用量优选为与水等体积；

步骤(3)中所述的分离的具体操作优选为：在watersdelta600高效反相液相色谱仪上，选用c18制备柱(phenomenex，300i，15μm，id4.6mm×250mm)，以梯度洗脱方式进行分离，486检测器检测280nm吸收值，收集主峰析出液；其中，流动相a为1ml/ltfa/h2o，流动相b为1ml/ltfa/乙晴；

步骤(3)中所述的浓缩优选为低压旋转浓缩；

步骤(3)中所述的干燥优选为冷冻干燥；

步骤(4)中所述的c-肽和七聚赖氨酸的摩尔比优选为≥16∶1；

步骤(4)中所述的mbs活化的七聚赖氨酸优选通过如下步骤制备得到：

将0.002mmol步骤(3)制得的七聚赖氨酸与1mlpbs缓冲液混合，得到七聚赖氨酸溶液；将10mgmbs溶于100μldmf中，得到mbs/dmf溶液；搅拌状态下，将mbs/dmf溶液滴加到七聚赖氨酸溶液中，加完后，于室温中搅拌反应2h；

步骤(4)中所述的c-肽免疫抗原粗品优选通过如下步骤制备得到：

将60mgc-肽溶解于2mlpbs缓冲液中，得到c-肽溶液；搅拌状态下，将c-肽溶液滴加到mbs活化的七聚赖氨酸中，加完后于室温中搅拌反应3h；

步骤(5)中所述的fmoc-cys-oh、甲基吗啡啉和氯甲酸异丁酯的体积比优选为1:1:1；

步骤(5)中所述的乙酸酐的用量优选为100mg/100μlfmoc-cys-oh；

步骤(5)中所述的氯甲酸异丁酯加时需慢速滴加，以控制反应体系温度，滴加速度优选为20～30滴/min；

步骤(5)中所述的水和乙酸乙酯萃取的次数优选为2～3次；

步骤(5)中所述的碳酸氢钠溶液萃取的次数优选为2～3次；

步骤(5)中所述的水萃取的次数优选为2～3次；

步骤(6)中所述的中压优选为5～10mpa；

所述的pbs缓冲液浓度优选为0.1mol/l，ph优选为7.0；

一种c-肽免疫抗原，通过上述制备方法制备得到；

一种抗c-肽多克隆抗体，利用上述c-肽免疫抗原制备得到；

所述的抗c-肽多克隆抗体的制备方法，包含如下步骤：

采用步骤(1)合成的c-肽免疫抗原免疫兔子，取血，离心得到抗血清，即为抗c-肽多克隆抗体；

所述的抗c-肽多克隆抗体的制备方法还包括纯化步骤：

将上述抗血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，混匀，然后离心，收集上清液，将滤液用10×pbs缓冲液混合，在2～4℃下缓慢加入硫酸铵，使其终浓度为40～45％w/w；离心，收集沉淀；沉淀用pbs缓冲液溶解，置于pbs缓冲液中透析然后干燥，得到c-肽多克隆抗体；

所述的pbs缓冲液浓度为0.01mol/l，ph为7.4；

所述的离心优选为8000～10000r/min，离心15～30min；

所述的透析的条件优选为透析3～4天，10～14小时换一次液；

所述的干燥优选为冷冻干燥；

所述的抗c-肽多克隆抗体的制备方法，具体包含如下步骤：

选取两只新西兰大白兔，雌性，月龄3～4个月，体重1.5～2公斤；用pbs缓冲液将上述c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂混合进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1～2ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1～2ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫3～5次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于0～10℃静置12～15h，然后以8000～10000r/min的离心速度，离心分离5～10min，分离取上清液，得到抗c-肽多克隆抗体；

所述的pbs缓冲液浓度为0.01mol/l，ph为7.4；

所述的抗c-肽多克隆抗体在制备c-肽快速免疫检测产品中的应用；

本发明的原理：

首先，本发明采用间接偶联法以c-肽作为半抗原与载体蛋白多聚赖氨酸(pll)偶联制得抗原，其中，偶联后所获不同分支的map，其结构的基本组成均为七聚赖氨酸的map核心结构加上不同分支的c肽，相互之间的差别只是不同数目的c肽线性肽，故不同分支的map之间的极性差异不大，用rp-hplc层析很难将它们完全进行分离，已成为多肽合成后纯化的难题；本发明在制得c-肽免疫抗原粗品中引入琉基，然后与光敏化合物反应，与光敏化合物反应的完整肽段(含琉基)就可以通过引入的琉基相互作用而被吸附，其余的不完整肽链及杂质就会被洗掉，将多肽进行紫外光照射消解，光敏基团与多肽的连接处会发生断裂，从而得到纯化后的完整肽(c-肽免疫抗原)。

第二，本发明提供的抗c-肽多克隆抗体的提取及纯化采用了较为安全的方法，即采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体，纯化效果好，得到的抗c-肽多克隆抗体纯净。

与现有的方法相比，本发明具有以下优点及有益效果：

(1)本发明制得的c-肽免疫抗原纯度高，结构稳定。

(2)本发明制得的抗c-肽多克隆抗体具有较强特异性。

(3)本发明采用采用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化抗c-肽多克隆抗体，纯化效果好，得到的抗c-肽多克隆抗体纯净，纯度可达到90％以上。

(4)本发明制得的抗c-肽多克隆抗体可用于检测人体血清中的c-肽，以此判断糖尿病分型；可用于c-肽的快速免疫检测，具有良好的应用价值。

(5)本发明提供的合成方法简便，成本低廉。

附图说明

图1是本发明制得的c-肽免疫抗原结构图。

图2是实施例6制得的抗c-肽多克隆抗体效价图。

图3是不同纯化方法纯化得到的抗c-肽多克隆抗体的电泳图，其中，1：实施例6纯化得到的抗c-肽多克隆抗体，2：对比实施例1纯化得到的抗c-肽多克隆抗体，3：对比实施例2纯化得到的抗c-肽多克隆抗体。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1～3中pbs缓冲液浓度为0.1mol/l，ph为7.0；

实施例4～6以及对比实施例1～2中缓冲液浓度为0.01mol/l，ph为7.4；

实施例1c-肽免疫抗原的合成

(1)8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂的合成

称量0.11g王树脂(约0.1mmol)，再按照树脂∶氨基酸＝1:7的反应比例称量供3次反应的赖氨酸，在abi431多肽合成仪上设置标准程序进行偶联合成：以dcm溶涨树脂，然后按照去保护、活化、偶联步骤，依次连接第1级到第3级赖氨酸，得到8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂。

(2)树脂裂解和去保护

将步骤(1)制得的8分支map核心结构七聚赖氨酸树脂放入10ml圆底烧瓶中，倒入5ml预先配制的裂解试剂(tfa900ml/l、苯甲硫醚50ml/l、二巯基乙烷30ml/l、苯甲醚20ml/l)，密闭，旋转搅拌反应2h；反应后将反应液倒出过滤，收集滤液，将滤液进行低压旋转浓缩，浓缩物以三蒸水溶解，然后加入乙醚(与水体积相同)，震荡混合，萃取水相，得到七聚赖氨酸水溶液；

(3)七聚赖氨酸的分离与纯化

在watersdelta600高效反相液相色谱仪上，选用c18制备柱(phenomenex，300i，15μm，id4.6mm×250mm)，以梯度洗脱方式对步骤(2)制得的七聚赖氨酸水溶液进行分离，其中，流动相a为：1ml/ltfa/h2o，流动相b为：1ml/ltfa/乙晴；486检测器检测280nm吸收值，收集主峰析出液，低压旋转浓缩，直至剩余约5ml时停止，然后冷冻干燥过夜，最后获得的白色冻干粉即为七聚赖氨酸；

(4)mbs连接c-肽与七聚赖氨酸

将0.002mmol七聚赖氨酸与1mlpbs缓冲液混合，得到七聚赖氨酸溶液；称取10mgmbs，溶于100μldmf中，得到mbs溶液；搅拌状态下，将mbs溶液缓慢滴加到七聚赖氨酸溶液中，加完后，于室温中搅拌反应2h，得到mbs活化的七聚赖氨酸；将60mgc-肽(约0.035mmol)溶解于2mlpbs缓冲液(c-肽：七聚赖氨酸≥16：1)中，搅拌状态下，将c-肽溶液滴加到mbs活化的七聚赖氨酸中，加完后于室温中搅拌反应3h，得到c-肽免疫抗原粗品；

(5)在-18℃盐水浴，氮气保护下，将100μl甲基吗啡啉和100μl氯甲酸异丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反应8min，其中，氯甲酸异丁酯的滴加速度为25滴/min；加入100mg乙酸酐，在-18℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1.2h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应25min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取2次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取2次，将fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取2次，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍fmoc-cys-oh质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的c-肽免疫抗原粗品溶于pbs缓冲液，然后使用中压8mpa过柱，采用pbs缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用pbs缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射45min，得到c-肽免疫抗原(图1)。

实施例2c-肽免疫抗原的合成

本实施例步骤(1)、(2)、(3)、(4)具体操作同实施例1；

(5)在-15℃盐水浴，氮气保护下，将100μl甲基吗啡啉和100μl氯甲酸异丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反应5min，其中，氯甲酸异丁酯的滴加速度为30滴/min；加入100mg乙酸酐，在-15℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应15min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取3次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取3次，将fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取3次，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍fmoc-cys-oh质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的c-肽免疫抗原粗品溶于pbs缓冲液，然后使用中压10mpa过柱，采用pbs缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用pbs缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30min，得到c-肽免疫抗原。

实施例3c-肽免疫抗原的合成

本实施例步骤(1)、(2)、(3)、(4)具体操作同实施例1；

(5)在-20℃盐水浴，氮气保护下，将100μl甲基吗啡啉和100μl氯甲酸异丁酯依次滴加到100μlfmoc-cys-oh中，反应10min，其中，氯甲酸异丁酯的滴加速度为20滴/min；加入100mg乙酸酐，在-20℃盐水浴，氮气保护下，继续反应1.5h，得到反应产物1；然后将反应产物1从盐水浴中取出，室温继续反应30min，得到反应产物2；在反应产物2中加入水和乙酸乙酯进行萃取2次，得到乙酸乙酯相；在乙酸乙酯相中加入质量分数为10％的碳酸氢钠溶液进行萃取2次，将fmoc-cys-oh以及乙酸酐洗出；在乙酸乙酯相中加入水进行萃取2次，将残留的碳酸氢钠洗出；加入无水硫酸钠，除去乙酸乙酯相中残留水分；除去无水硫酸钠，乙酸乙酯相浓缩，加入2倍fmoc-cys-oh质量的硅胶，混匀，并干燥；

(6)将步骤(5)制得的产物装柱，步骤(4)制得的c-肽免疫抗原粗品溶于pbs缓冲液，然后使用中压5mpa过柱，采用pbs缓冲液为洗脱剂，收集含目标峰的流份；将得到的流份与等体积的乙醚混合，收集沉淀物；沉淀物与4-甲基-3-硝基苯胺反应，产物用pbs缓冲液洗涤；洗涤后的产物在365nm紫外光下照射30min，得到c-肽免疫抗原。

实施例4多克隆抗体的制备

实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫：

(1)用新鲜配制的pbs缓冲液将实施例1制得的c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射2ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫4次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于4℃冰箱静置14h，然后以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液；

(2)将步骤(1)所获取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然后8000r/min，离心30min，收集上清液，将滤液用10×pbs缓冲液混合，在4℃下缓慢加入硫酸铵粉末，使其终浓度为45％w/w；8000r/min，离心30min，收集沉淀；沉淀用8mlpbs缓冲液溶解，置于pbs溶液中透析3天，12小时换一次液；将透析过的多克隆抗体在冷冻干燥机中冻干，即得抗c-肽多克隆抗体粉末，-20℃保存。

实施例5多克隆抗体的制备

实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄4个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫：

(1)用新鲜配制的pbs缓冲液将实施例1制得的c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫5次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于0℃冰箱静置15h，然后以8000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液；

(2)将步骤(1)所获取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然后10000r/min，离心15min，收集上清液，将滤液用10×pbs缓冲液混合，在2℃下缓慢加入硫酸铵粉末，使其终浓度为40％w/w；10000r/min，离心15min，收集沉淀；沉淀用5mlpbs缓冲液溶解，置于pbs溶液中透析4天，10小时换一次液；将透析过的多克隆抗体在冷冻干燥机中冻干，即得抗c-肽多克隆抗体粉末，-20℃保存。

实施例6多克隆抗体的制备

实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫：

(1)用新鲜配制的pbs缓冲液将实施例1制得的c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射51.ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫3次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于10℃冰箱静置12h，然后以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液；

(2)将步骤(1)所获取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然后9000r/min，离心20min，收集上清液，将滤液用10×pbs缓冲液混合，在3℃下缓慢加入硫酸铵粉末，使其终浓度为42％w/w；9000r/min，离心20min，收集沉淀；沉淀用10mlpbs缓冲液溶解，置于pbs溶液中透析3天，10小时换一次液；将透析过的多克隆抗体在冷冻干燥机中冻干，即得抗c-肽多克隆抗体粉末，-20℃保存。

对比实施例1

实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫：

(1)用新鲜配制的pbs缓冲液将实施例1制得的c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射51.ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫3次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于10℃冰箱静置12h，然后以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液；

(2)将步骤(1)所获取的血清加入25μl/ml的辛酸溶液中，然后9000r/min，离心20min，收集上清液，将滤液用10×pbs缓冲液混合，9000r/min，离心20min，收集沉淀；沉淀用10mlpbs缓冲液溶解，置于pbs溶液中透析3天，10小时换一次液；将透析过的多克隆抗体在冷冻干燥机中冻干，即得抗c-肽多克隆抗体粉末，-20℃保存。

对比实施例2

实验采用2只新西兰大白兔，雌性，月龄3个月，体重1.5～2公斤，饲养在标准动物房内，连续观察一周，确定其状态良好后，开始进行免疫：

(1)用新鲜配制的pbs缓冲液将实施例1制得的c-肽免疫抗原配制成1mg/ml的免疫抗原溶液，各取1ml免疫抗原溶液与等体积的弗氏完全佐剂，用乳化器进行乳化使其完全混为一相，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射1.5ml；首次免疫两周后进行第一次加强免疫，用等体积的弗氏不完全佐剂与免疫抗原溶液混合乳化，采用皮下多点注射的免疫方式对每只兔子注射51.ml，以后每隔两周进行加强免疫一次；加强免疫3次后，于最后一次免疫一周后对兔子耳部静脉取血，将收集到的血液置于10℃冰箱静置12h，然后以10000r/min的离心速度，离心分离10min，分离取上清液；

(2)将步骤(1)所获取的血清用10×pbs缓冲液混合，在3℃下缓慢加入硫酸铵粉末，使其终浓度为42％w/w；9000r/min，离心20min，收集沉淀；沉淀用10mlpbs缓冲液溶解，置于pbs溶液中透析3天，10小时换一次液；将透析过的多克隆抗体在冷冻干燥机中冻干，即得抗c-肽多克隆抗体粉末，-20℃保存。

效果实施例

采用间接elisa方法检测兔子血清中抗体的效价，包括以下步骤：

(1)包被：将包被抗原bsa偶联的c肽用碳酸盐缓冲液稀释至5μl/ml并充分混匀，使用移液枪100μl/孔添加到微孔板中，置于37℃水浴锅温浴1小时后，再放置于4℃冰箱中包被过夜；

(2)清洗：将孔中的液体甩干，用pbst洗涤液清洗3次，再将孔中剩余的液体在吸水纸上拍干；

(3)封闭：用含浓度为30mg/ml的脱脂奶粉磷酸缓冲溶液，270μl/孔加入到微孔板中，37℃温浴1小时，重复步骤(2)；

(4)竞争反应：将实施例6制得的抗c-肽多克隆抗体用磷酸缓冲液倍比稀释，浓度依次为1：2000、1：4000、1：8000、1：16000、1：32000、1：64000、1：128000，以100μl/孔加入到微孔板中，同时增加空白对照，37℃温浴1小时，重复步骤(2)；

(5)加酶标二抗：加入以磷酸缓冲液稀释5000倍数的酶标二抗，按照100μl/孔添加到微孔板中，放置于37℃温浴1小时，重复步骤(2)；

(6)显色：在已配制得10ml底物缓冲液中，加入10μl30％过氧化氢并充分混匀，按照100μl/孔加到微孔板中，置于37℃下避光孵育15分钟。

终止和读数：向酶标版的微孔中加入50μl/孔的2m硫酸终止反应。设定酶标仪测定波长参数为450nm，并测定其光密度值。阳性的判定原则：样品孔od值大于空白处读数的2.1倍即可判定为阳性，结果见图2。

图3是不同提纯方法制得的抗体的电泳图，从图中可以看出，实施例6辛酸-硫酸铵沉淀法提纯的抗体条带很纯，有重链和轻链；而单独的辛酸法(对比实施例1)和硫酸铵法(对比实施例2)杂蛋白是相对较多，不止有重链和轻链。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。