一种特异性抗人PCSK9的抗体及其应用的制作方法

本发明涉及一种特异性抗人pcsk9的抗体及其应用，属于生物医药领域。
背景技术：
：高胆固醇血症，特别是低密度脂蛋白胆固醇的升高，与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关。流行病学调查发现血脂异常，尤其是低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）持续偏高是诱发和促进动脉粥样硬化发生、发展的重要危险因素，与缺血性心脑血管疾病密切相关，严重威胁着人类健康。目前临床上广泛应用的降脂药物是他汀类药物（statins）。他汀类药物主要通过抑制内源性胆固醇合成限速酶（hmg-coa）还原酶的活性，抑制细胞内羟甲戊酸代谢途径，致使细胞内的总胆固醇合成减少，调节肝细胞表面低密度胆固醇受体的数量和活性，增加血清中胆固醇的清除数量，进而降低总胆固醇的水平。但是，他汀类药物会引起肝脏酶异常，导致横纹肌溶解，且临床上存在着部分他汀类药物不耐受的患者。因此，开发他汀类药物以外的新型的降脂药物具有重要的意义。近年来，前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9，pcsk9）蛋白逐渐成为了治疗高胆固醇血症的重要靶点。pcsk9是2003年发现的一个脂质代谢调节基因，它属于哺乳动物前蛋白转化酶（pc）枯草溶菌素蛋白家族。人类pcsk9基因定位于染色体1p32.3，全长为29kb，由12个外显子构成，编码区约为2kb，编码包含692个氨基酸残基的pcsk9酶原，其结构可分为信号肽、前结构域、催化结构域和羧基末端结构域四个部分。pcsk9在肝脏、肾脏、脑组织以及空回肠等多种组织中有表达。pcsk9的作用靶标是低密度脂蛋白受体（lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr）。pcsk9合成分泌后与细胞膜上的ldlr结合并内吞，再进入溶酶体ldlr被降解，pcsk9正是通过在蛋白水平降解肝细胞表面ldlr，调节血浆低密度脂蛋白胆固醇（low-densitylipoproteincholesterol，ldl-c）水平，致使肝脏血脂清除能力下降，从而导致了高胆固醇血症。研究发现，pcsk9存在两种突变，即功能获得型突变和功能缺失型突变，这两种突变均与脂质代谢异常密切相关。pcsk9功能获得型突变，降解ldlr的功能增强，ldlr减少，血液中ldl被清除的功能减弱，ldl-c水平升高，导致高胆固醇血症。pcsk9部分选择性错义突变属于此类突变。pcsk9功能缺失型突变可导致肝细胞ldlr增多、血液中的ldl摄取、降解增加，导致低胆固醇血症。功能缺失型突变可导致pcsk9蛋白自我裂解和分泌障碍，使得ldl-c降低80％～90％。靶向pcsk9的治疗机理主要是通过pcsk9抗体与血浆中的pcsk9结合后阻止pcsk9与ldl受体特异性结合，进而增加了肝细胞表面ldlr的水平，提升了肝脏血脂清除能力。例如，安进公司的repatha和赛诺菲与再生元联合研发的praluent已于2016年上市，并且显示出良好的治疗效果。然而，本领域技术人员仍然希望能够开发出全人源的高亲和力的靶向pcsk9的抗体。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种特异性抗人pcsk9的抗体，所述抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区具有第一氨基酸序列或与所述第一氨基酸序列有85%以上的序列同源性的序列；其中，所述第一氨基酸序列包含如seqidno.2所示的重链可变区的cdr1序列、如seqidno.3所示的重链可变区的cdr2序列以及如seqidno.4所示的重链可变区的cdr3序列；所述轻链可变区具有第二氨基酸序列或与所述第二氨基酸序列有85%以上的序列同源性的序列；其中，所述第二氨基酸序列包含如seqidno.6所示的轻链可变区的cdr1序列、如seqidno.7所示的轻链可变区的cdr2序列以及如seqidno.8所示的轻链可变区的cdr3序列。在本发明的一个优选实施方案中，所述第一氨基酸序列如seqidno.1所示，并且所述第二氨基酸序列的序列如seqidno.5。在本发明的一个更优选实施方案中，所述重链可变区的序列如seqidno.1所示，并且并且所述轻链可变区的序列如seqidno.5所示。可选的，所述重链可变区的序列如seqidno.9所示，并且并且所述轻链可变区的序列如seqidno.10所示；可选的，所述重链可变区的序列如seqidno.11所示序列，并且所述轻链可变区的序列如seqidno.12；可选的，所述重链可变区的序列如seqidno.13所示序列，并且所述轻链可变区的序列如seqidno.14；可选的，所述重链可变区的序列如seqidno.15所示序列，并且所述轻链可变区的序列如seqidno.16。在本发明的一个优选实施方案中，所述特异性抗人pcsk9的抗体为单克隆抗体。本发明另一方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如上述的特异性抗人pcsk9的抗体和药用载体。本发明还一方面提供了上述的特异性抗人pcsk9的抗体在制备脂类代谢疾病的药物中的用途。在本发明的一个优选实施方案中，所述的特异性抗人pcsk9的抗体在制备用于阻断pcsk9/ldlr相互作用的药物、降低低密度脂蛋白胆固醇浓度的药物中的用途。本发明还一方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如上述的特异性抗人pcsk9的抗体。本发明还一方面提供了上述的特异性抗人pcsk9的抗体在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测人pcsk9在样品中的存在或其水平。关于本发明申请文件中术语的定义：术语“pcsk9”，也称前蛋白转化酶枯草溶菌素9（proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9），是指人pcsk9抗原，其氨基酸序列包括pcsk9蛋白的全长（人源np_777596.21，可以从ncbi网站获取）；还包括其融合短板，例如其与小鼠或人igg的fc蛋白片段（mfc或hfc）进行融合的片段。基于本领域技术人员的理解，在pcsk9蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异（包括但不限于置换、缺失和/或添加），而不影响其生物学功能。关于人pcsk9抗原多肽序列（野生型）；在本申请文件中，人pcsk9抗原是指ncbi网站所示多肽或其片段，以及相关多肽，包括但不限于等位基因变体、剪接变体、衍生变体、取代变体、缺失变体和/或插入变体，包括添加n端蛋氨酸、融合多肽等。在某些实施方案中，人pcsk9抗原多肽包含诸如前导序列残基、靶向残基、氨基酸蛋氨酸残基、赖氨酸残基、标签残基和/或融合蛋白残基。术语“特异性抗人pcsk9的抗体”是指能以非共价的、可逆地，并且以特异的方式结合上述人pcsk9抗原多肽的免疫球蛋白的多肽。示例性的抗体单一包含四聚体，每一个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有通过二硫键连接的一个轻链和一个重链。每一个重链或轻链都包含其cdr（互补决定区或者互补决定域）和构架区。每一个重链或轻链中都存在三个cdr（cdr1、cdr2和cdr3，从n端到c端顺次编码），其构成了抗体链的约15%-20%的可变区。重链和轻链的cdr在结构上与靶多肽（pcsk9抗原）的表位互补，因此重链和轻链的cdr主要负责抗体与pcsk9抗原的结合特异性，剩余的构架区在氨基酸序列方面表现出较少的变化。关于“序列同源性”的百分比，是通过确定两个序列中存在的相同核酸碱基或氨基酸残基的数目来产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中位置总数，将结构乘以100从而产生序列的同一性百分比。关于“脂类代谢疾病”，是指与正常人相比血脂异常，血清中的胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白中的一种或多种升高，和/或血清中的高密度脂蛋白降低。本发明的发明人采用噬菌体抗体库技术筛选到本发明的特异性抗人pcsk9的抗体，可以有效阻断阻断人pcsk9与ldlr蛋白的结合，逆转人pcsk9蛋白对ldl吸收的抑制作用，与现有的抗人pcsk9抗体相比，具有更长的体内药效作用时间。附图说明图1为抗体8f5与人pcsk9抗体的结合能力检测结果图；图2为抗体8f5与猴pcsk9抗体的结合能力检测结果图；图3为抗体8f5与鼠pcsk9抗体的结合能力检测结果图；图4为抗体8f5阻断人pcsk9与ldlr的结合的竞争实验结果图；图5为抗体8f5防止hepg2细胞上ldlr的减量调节的实验结果图；图6为抗体8f5与现有技术原研药对体内ldl-c浓度的影响的对比结果图。具体实施方式以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社）或按照产品说明书进行。在本发明的实施方案中，发明人采用噬菌体抗体库技术筛选到五个特异性抗人pcsk9的单克隆抗体，具体过程如下。1）抗人pcsk9单链抗体的生物淘选首先使用生物素化的hupcsk9单链抗体（np_777569.2）作为全人源抗体库的淘选抗原。用封闭缓冲液（pbst/5%脱脂奶粉）室温预封闭噬菌体抗体2h，噬菌体的投入量为10^12。然后加入10μg的抗原，室温孵育1h。孵育后加入50μl的预封闭的dynabeads®m-280streptavidin磁珠，室温孵育30min。先用pbst洗去未结合在磁珠上的噬菌体，再用0.1m的hcl-glycine洗脱结合在磁珠上的噬菌体，之后用tris-hcl中和洗脱液。取部分洗脱下的噬菌体侵染处于生长对数期的大肠杆菌tg1，然后制备噬菌体用于下一轮淘选。逐渐增加每一轮的筛选强度，富集度达到100倍以上时，终止淘选。2）采用phageelisa筛选抗pcsk9单链抗体的阳性克隆挑选四轮淘选后的噬菌体侵染的tg1单克隆，接种于96孔板中，培养基为2yt/2%glucose/（100μg/mlampicilline）。37℃/250rpm过夜培养后转接至新的培养基中，培养至生长对数期后加入m13ko7辅助噬菌体，37℃静止侵染1h。4000rpm离心15min，使用2yt/（100μg/mlampicilline）/（70μg/mlkanamycin）培养基30℃过夜培养。离心去噬菌体上清液进行elisa鉴定克隆。用0.5μg/ml的pcsk9抗原包被costar-9018酶标板，3%bsa4℃封闭过夜，加入噬菌体上清液4℃孵育2h。洗去未结合的噬菌体后加入m13bacteriophage抗体(hrp)，4℃孵育1h。洗涤后加入tmb显色液显色，用2mhcl终止反应，用酶标仪于45nm读数，选择od450>1.5克隆进行测序，对序列进行germline分析和ptms位点分析，排除有潜在开发风险的分子后共得到了如下5个scfv单链抗体。抗人pcsk9单链抗体1（也标注为抗体8f5）抗体8f5的重链可变区序列如seqidno.1所示，其中重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.2，seqidno.3和seqidno.4。抗体8f5的轻链可变区序列如seqidno.5所示，其中轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.6，seqidno.7和seqidno.8。抗人pcsk9单链抗体2（也标注为抗体3d1）抗体3d1的重链可变区序列如seqidno.9所示，其中重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.27，seqidno.28和seqidno.29。抗体3d1的轻链可变区序列如seqidno.10所示，其中轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.30，seqidno.31和seqidno.32。抗人pcsk9单链抗体3（也标注为抗体7c4）抗体7c4的重链可变区序列如seqidno.11所示，其中重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.33，seqidno.34和seqidno.35。抗体7c4的轻链可变区序列如seqidno.12所示，其中轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.36，seqidno.37和seqidno.38。抗人pcsk9单链抗体4（也标注为抗体5c2）抗体5c2的重链可变区序列如seqidno.13所示，其中重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.39，seqidno.40和seqidno.41。抗体5c2的轻链可变区序列如seqidno.14所示，其中轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.42，seqidno.43和seqidno.44。抗人pcsk9单链抗体5（也标注为抗体4e9）抗体4e9的重链可变区序列如seqidno.15所示，其中重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.45，seqidno.46和seqidno.47。抗体4e9的轻链可变区序列如seqidno.16所示，其中轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别为seqidno.48，seqidno.49和seqidno.50。在本发明的一些实施方案中，提供了抗人pcsk9抗体的构建和表达过程，简单来说，将上述的筛选出的抗人pcsk9单链抗体1-5的轻链可变区和重链可变区基因分别构建到含有人轻链恒定区和重链恒定区（igg1）的载体上，共转染cho-k1细胞，细胞培养一周后高速离心收集上清，上清上样至proteing亲和介质预装柱，用ph2.7甘氨酸-盐酸洗脱液洗脱下蛋白后用ph8.5tris-hcl中和。中和后的样品加入50kda超滤浓缩管换液至pbs。关于上述抗人pcsk9单链抗体1-5的基因序列：上述抗体8f5的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.17所示，上述抗体8f5的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.18所示；上述抗体3d1的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.19所示，上述抗体3d1的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.20所示；上述抗体7c4的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.21所示，上述抗体7c4的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.22所示；上述抗体5c2的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.23所示，上述抗体5c2的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.24所示；上述抗体4e9的重链可变区的核苷酸序列如seqidno.25所示，上述抗体4e9的轻链可变区的核苷酸序列如seqidno.26所示。下面以抗体8f5为例，测定本发明的抗人pcsk9抗体与pcsk9抗原的亲和力。人、猴和鼠pcsk9蛋白的包被浓度依次为0.5μg/ml、0.25μg/ml和0.5μg/ml，100μl每孔，4℃过夜。用3%bsa室温封闭2h后加入不同稀释梯度的抗pcsk9抗体（抗体自30μg/ml开始稀释，3倍梯度稀释，共9个梯度），室温孵育2h。洗去未结合的抗pcsk9抗体，加入goatanti-humaniggfc(hrp)抗体，室温孵育1h。洗涤后加入tmb显色液显色，用2mhcl终止反应，用酶标仪于45nm读数，结果参见图1至图3，从图中结果可以看出，抗体8f5与人、猴、鼠pcsk9蛋白的结合能力良好,并呈现出剂量效应关系。下面以抗体8f5为例，采用elisa实验测定本发明的抗人pcsk9抗体是否能够阻断人pcsk9与ldlr的结合。ldlr蛋白的包被浓度为0.2μg/ml，100μl每孔，4℃过夜。用3%bsa室温封闭2h。将不同稀释梯度的抗pcsk9抗体与0.5μg/ml的pcsk9.biotin室温孵育0.5h，然后加入到包被ldlr的酶标板中，室温孵育1h。pbst洗涤后加入anti-streptavidin(hrp)抗体，室温孵育1h。洗涤后加入tmb显色液显色，用2mhcl终止反应，用酶标仪于45nm读数，结果参见图4，从图4中可以看出，8f5抗体可以有效的阻断人pcsk9蛋白与ldlr的结合。下面以抗体8f5为例，测定本发明的抗人pcsk9抗体与人pcsk9抗原结合的动力学数据。使用表面等离子共振技术（spr）测定抗体8f5对人pcsk9抗原的结合动力学和亲和力。将待测抗体通过氨基偶联法耦合固定于研究级别的cm5生物传感器芯片，人pcsk9抗原的浓度以2倍浓度梯度的变化（200nm，100nm，50nm，25nm，12.5nm，6.25nm）流经固定相表面，测定抗体的亲和力，结果如表1所示：表1抗体名称抗原ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)抗体8f5人pcsk9-his56862.585e-54.546e-9从表1的内容可以看出，抗体8f5与人pcsk9蛋白亲和力的kd值为4.546e-9，达到了nmol级。下面以抗体8f5为例，检测抗体8f5对ldl的摄入的作用。为确定抗体8f5对肝细胞上ldlr对ldl吸收作用的调节，将人肝癌细胞细胞系hepg2按照1×10^5/孔的密度接种到已加入含有dmem培养基的96板中，37℃5%二氧化碳条件下培养24小时。吸出上清，加入含有1%fbs的dmem培养基中继续培养12小时，将10ug/ml人pcsk9蛋白和以浓度范围从100ug/ml3倍稀释，共稀释6个梯度的8f5抗体加入到培养hepg2细胞的96孔板中，37℃孵育2小时。加入100ng荧光标记的ldl后，将细胞37℃孵育4小时，吸出上清，用pbs清洗2遍后，利用流式细胞仪检测96孔板中样品的荧光强度。如图5结果显示，抗体8f5可以有效的阻止人pcsk9与ldlr的结合，进而逆转人pcsk9蛋白对ldl吸收的抑制作用。下面以抗体8f5为例，检测抗体8f5对体内低密度脂蛋白胆固醇（ldl-c）浓度的影响。将8只tc>4.8mmol/l,ldl-c>1.5mmol/l的高血脂恒河猴随机分为两组，a组和e组。其中a组注射抗人pcsk9抗体8f5，e组注射原研药repatha（购自安进公司）。每两周皮下注射给药1次，均为4.0mg/kg。在给药前进行两次采血检测tc、ldl-c，用于筛选血脂较为稳定和一致的动物。于给药后第1、3、5、7、14、21、28天各空腹采血1次，用于血脂水平检测。血脂检测项目包括tc、ldl-c、hdl-c、tg。给药前后各进行1次血液生化和血液学检测。具体结果参见下面表2以及根据表2绘制的图6中，day-2表示用药前2天，即初始状态；day1表示用药后1天，以此类推）。表2从表2和图6可以看出，a组和e组在给药后第1天对ldl-c抑制作用相近，基本在20-27%；第3天时抑制作用均在40%以上；a组在第3天至14天期间抑制率维持在35-50%之间；整个数据比较均匀稳定。e组在第3天至14天期间抑制率很均一，维持在40-50%之间；但仅作用于第14天，14天后即反弹上升；a组则持续到28天仍然保持~30%。因此，可以看出，本发明的抗人pcsk9抗体在对于ldl-c（体内低密度脂蛋白胆固醇）浓度的抑制效果方面要明显优于原研药物repatha。应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。sequencelisting<110>上海海玫生物科技有限公司<120>一种特异性抗人pcsk9的抗体及其应用<130>2017-zwx-1<160>50<170>patentinversion3.3<210>1<211>121<212>prt<213>人<400>1gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglyphethrpheserserthr202530alailehistrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnglyasnthrasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileseralaaspthrserlysasnthralatyr65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyserarggluleutyrilemetasptyrtrpgly100105110glnglythrleuvalthrvalserser115120<210>2<211>8<212>prt<213>人<400>2glyphethrpheserserthrala15<210>3<211>8<212>prt<213>人<400>3ileserproalaasnglyasnthr15<210>4<211>12<212>prt<213>人<400>4trpileglyserarggluleutyrilemetasptyr1510<210>5<211>107<212>prt<213>人<400>5aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly151015aspargvalthrilethrcysargalaserglnaspvalserthrala202530valalatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile354045tyrseralaserpheleutyrserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro65707580gluaspphealathrtyrtyrcysglnglnalatyrproalaleuhis859095thrpheglyglnglythrlysvalgluilelys100105<210>6<211>11<212>prt<213>人<400>6argalaserglnaspvalserthralavalala1510<210>7<211>7<212>prt<213>人<400>7seralaserpheleutyrser15<210>8<211>9<212>prt<213>人<400>8glnglnalatyrproalaleuhisthr15<210>9<211>121<212>prt<213>人<400>9gluvalglnleuvalgluserglyglyglyvalvalglnproglygly151015serleuargleusercysalaalaserglypheleupheserserthr202530alailehistrpvalargglnproproglylysglyleuglutrpval354045alaargileserproalaasnalaglytyrasntyralaaspserval505560lysglyargphethrileserargaspasnserthrasnthrleuphe65707580leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys859095alaargtrpileglyargarggluleutyrileme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