本发明属于化学药物领域，涉及环二肽及其制备方法。
背景技术：
环二肽(cyclicdipeptides)又叫2,5-二酮哌嗪的衍生物，该类化合物在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、细菌和真菌中均有发现。由于环二肽形成一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用，有两个氢键给体和两个氢键受体，氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因此环二肽在药物化学中是一个重要的药效团。目前发现很多环二肽具有强的生理活性，例如具有植物生长调节剂作用、抗肿瘤活性、抗菌及提高免疫功能。
美洲大蠊(periplanetaamericana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称“蟑螂”，是世界上生命力最强、最古老，至今繁衍最成功的昆虫类群之一。美洲大蠊是传统的中药材，入药始载于《神农本草经》，被列为中品，谓“味咸、寒”。以往众多研究表明，美洲大蠊中的化学成分主要分为两大类。第一类为信息素是大蠊向体外释放的具有挥发性的信息素成分，主要包括性信息素和聚集信息素。第二类为氨基酸和各种昆虫神经肽，是存在于其机体内的化学成分。本发明人对美洲大蠊乙醇提取物的水部分的化学成分进行了研究，分离并鉴定了一系列环二肽，其中有4个环二肽是首次从美洲大蠊中分离得到。经研究发现这4个环二肽具有显著促进huvec细胞血管生成的功效。
技术实现要素：
本发明所述环二肽为环(丙氨酸-缬氨酸)、环(甘氨酸-异亮氨酸)、环(甘氨酸-亮氨酸)及环(酪氨酸-天冬氨酸)中的任意一种。
本发明提供了环二肽的药物组合物，所述药物组合物包括环(丙氨酸-缬氨酸)、环(甘氨酸-异亮氨酸)、环(甘氨酸-亮氨酸)或环(酪氨酸-天冬氨酸)中的任意一种，或其药学上可接受的衍生物及其盐类。
进一步地，所述的药物组合物为药物制剂，其是由环(丙氨酸-缬氨酸)、环(甘氨酸-异亮氨酸)、环(甘氨酸-亮氨酸)或环(酪氨酸-天冬氨酸)的任意一种，或其药学上可接受的衍生物及其盐类作为活性成分和药学上可接受的赋形剂组成。
其中固体制剂包括：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂等；半固体制剂包括软膏剂、栓剂等；液体制剂包括：溶液剂、注射剂、喷雾剂等；眼用制剂包括：滴眼剂、眼用凝胶剂等。
本发明还公布了所述的环二肽的制备方法为：
取美洲大蠊干燥虫体，粉碎后用热水提取2～3次，每次1～2h，提取液减压回收溶剂得总提物。总提取液经mcigelchp20p柱梯度洗脱(甲醇/水，0％～100％)得11个组分，分别为f1～f11。其中f4经rp-18柱(甲醇/水，0％～100％)得6个组分(f4.1～f4.6)。f4.2经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行半制备hplc(甲醇/水，12％)得化合物环(酪氨酸-天冬氨酸)。f6行mcigelchp20p柱(甲醇/水，0％～100％)得10个组分(f6.1～f6.10)。f6.3经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行制备薄层色谱(氯仿/甲醇/氨水，4:1:1％)和半制备hplc(甲醇/水，8％)得化合物环(丙氨酸-缬氨酸)；f6.4经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行制备薄层色谱(氯仿/甲醇/氨水，4:1:1％)和半制备hplc(甲醇/水，10％)得化合物环(甘氨酸-异亮氨酸)和环(甘氨酸-亮氨酸)。
进一步地，所述的环二肽是通过从美洲大蠊中提取获得或通过人工合成获得。
进一步地，所述的环二肽在促进血管生成方面的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明首次公开了从美洲大蠊中提取分离所述的4个环二肽的方法。
2.本发明所述的4个环二肽是首次从美洲大蠊中分离鉴定得到的。
3.本发明所述的4个环二肽具有显著促进huvec细胞血管生成的功效。
附图说明
图1化合物促进huvecs血管生成活性试验结果(n＝3)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1本发明所述环二肽的提取分离及结构鉴定
美洲大蠊来源于四川好医生攀西药业有限责任公司美洲大蠊gap基地，美洲大蠊提取物是康复新液的主要成分。
取美洲大蠊干燥虫体(25kg)，粉碎后用热水提取2～3次，每次1～2h，提取液减压回收溶剂得总提物。总提取液经mcigelchp20p柱梯度洗脱(甲醇/水，0％～100％)得11个组分，分别为f1～f11。其中f4(8g)经rp-18柱(甲醇-水，0％～100％)得6个组分(f4.1～f4.6)。f4.2(3.2g)经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行半制备hplc(甲醇-水，12％)得化合物环(酪氨酸-天冬氨酸)(3.5mg)。f6(20g)行mcigelchp20p柱(甲醇/水，0％～100％)得10个组分(f6.1～f6.10)。f6.3(1.3g)经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行制备薄层色谱(氯仿/甲醇/氨水，4:1:1％)和半制备hplc(甲醇/水，8％)得化合物环(丙氨酸-缬氨酸)(1.8mg)；f6.4(1.8g)经sephadexlh-20(h2o)凝胶过滤，再行制备薄层色谱(氯仿/甲醇/氨水，4:1:1％)和半制备hplc(甲醇/水，10％)得化合物环(甘氨酸-异亮氨酸)(5.6mg)和环(甘氨酸-亮氨酸)(28.5mg)。
化合物结果鉴定如下：
化合物环(丙氨酸-缬氨酸)：白色固体，1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ:4.04(1h,q,j＝7.0hz,h-3),3.84(1h,m,h-6),2.27(1h,m,h-8),1.45(3h,d,j＝7.0hz,h-7),1.05(3h,d,j＝7.1hz,h-9/h-10),0.95(3h,d,j＝6.8hz,h-9/h-10)。
化合物环(甘氨酸-异亮氨酸)：白色粉末，1hnmr(400mhz,methanol-d4)δ:4.00(1h,d,j＝17.6hz,hb-3),3.84(1h,overlap,h-6),3.84(1h,overlap,ha-3),1.97(1h,m,h-7),1.57(1h,m,hb-8),1.28(1h,m,ha-8),1.03(3h,d,j＝7.0hz,h-10),0.97(3h,t,j＝7.4hz,h-9)；13cnmr(100mhz,methanol-d4)δ:170.1(c-5),168.8(c-2),61.0(c-6),45.3(c-3),41.2(c-7),25.5(c-8),12.0(c-9),15.4(c-10)。
化合物环(甘氨酸-亮氨酸)：棕色固体，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.27(1h,s,h-1),8.02(1h,s,h-4),3.82(1h,d,j＝17.3hz,hb-3),3.61(1h,overlap,h-6),3.61(1h,overlap,ha-3),1.74(1h,m,h-8),1.51(2h,t,j＝6.8hz,h-7),0.86(6h,overlap,h-9,h-10)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)δ:168.8(c-5),166.5(c-2),53.0(c-6),44.3(c-3),42.2(c-7),23.7(c-8),23.0(c-9/c-10),21.9(c-9/c-10)。
化合物环(酪氨酸-天冬氨酸)：淡黄色固体，1hnmr(400mhz,dmso-d6)δ:8.00(1h,s,13-oh),7.62(1h,s,h-1/h-4),7.62(1h,s,h-1/h-4),6.96(2h,d,j＝8.2hz,h-11,h-15),6.66(2h,d,j＝8.2hz,h-12,h-14),4.08(1h,m,h-6),4.02(1h,m,h-3),2.98(1h,dd,j＝13.7,4.6hz,ha-9),2.81(1h,dd,j＝13.6,4.6hz,hb-9),2.32(1h,dd,j＝15.7,4.0hz,ha-7),1.52(1h,dd,j＝15.7,8.7hz,hb-7)；13cnmr(150mhz,dmso-d6)δ:171.7(c-8),166.9(c-2),166.5(c-5),156.2(c-13),131.1(c-11,c-15),126.2(c-10),115.0(c-12,c-14),55.4(c-6),51.2(c-3),38.2(c-9),37.4(c-7)。
实施例2本发明所述环二肽促huvec细胞血管生成活性测试
创伤愈合的最后阶段是组织构建，这一过程中血管形成发挥了重要作用，为考察化合物是否干预这一过程，对部分环二肽进行了血管生成活性试验。
人脐静脉内皮细胞(huvec)由深圳大学医学部馈赠。m199培养基和胎牛血清购自gibco公司。matrigel胶购自corning公司。将matrigel胶均匀铺于预冷的96孔板中，每孔50μl，37℃孵育40min。待matrigel胶凝固后，每孔加入1×104huvec细胞，实验组加入待测化合物(终浓度20μm)处理，对照组不含药物。在37℃、5％co2条件下，培养6h后，于显微镜下观察拍照，图片分析用imagej软件进行，每个实验重复3次。
血管生成率(％)＝药物处理组成管长度/对照组成管长度×100％
由图1可知，被筛选的环二肽中，化合物环(丙氨酸-缬氨酸)(编号9)、环(甘氨酸-异亮氨酸)(编号10)、环(甘氨酸-亮氨酸)(编号11)、环(酪氨酸-天冬氨酸)(编号21)在20μm时可显著促进huvecs形成管状结构，表明具有血管生成促进活性。且促进血管生成活性效果为：环(甘氨酸-亮氨酸)＞环(丙氨酸-缬氨酸)＞环(酪氨酸-天冬氨酸)＞环(甘氨酸-异亮氨酸)。