miR‑21的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种mir-21的模拟物和一种抑制物及后者的重组表达载体及其用途。

背景技术：

肝脏是机体的重要器官，具有储存、代谢、生物转化、解毒、造血、合成胆色素、分泌、再生等功能。研究肝再生相关基因对肝细胞增殖和肝再生的作用，对揭示肝再生机制、构建人工肝、建立治疗和预防肝病方法等都有重要理论意义和应用价值。

microrna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，在动植物以及病毒中已经发现有28645个mirna分子。大多数mirna基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。

研究表明，mir-21出现于多种生物，能调节包括faslg在内的多种靶基因作用。faslg是死亡受体fas的配体，一方面，faslg与fas结合后，引起fas的聚合，后者通过胞质区的死亡结构域招募接头蛋白fadd和caspase-8/10酶原，形成死亡诱导信号复合体disc。caspase-8酶原在复合物中通过自身切割而被激活，活化的caspase-8/10将胞质中的促凋亡分子bid剪切，形成活性分子tbid(truncatedbid)，tbid进入线粒体，导致细胞色素c从线粒体释放到细胞质，进入细胞质的细胞色素c与凋亡相关因子1(apaf-1)结合形成复合体，进而激活caspase-9。被激活的caspase-9又通过激活其它caspase诱导细胞凋亡；或者活化的caspase-8/10直接切割执行者caspase-3酶原，产生有活性的caspase-3，导致细胞凋亡。另一方面，faslg与fas结合后，也可通过与死亡结构域相关蛋白daxx结合激活促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶5(mapkkk5)，后者通过磷酸化级联反应激活下游的mekk3/6、mkk4/7和jnk。jnk通过使线粒体外膜通透性发生改变，促进细胞色素c释放和活化凋亡复合体的形成，引起细胞的凋亡。或者通过激活p38mapk途径导致细胞的凋亡。

mir-21的模拟物体内促细胞增殖的原理是用基因转染的方法将模拟物导入受体细胞，该模拟物与faslg的3′-utr结合，导致faslg表达水平降低，从而阻遏fas的促凋亡作用，促进细胞增殖；mir-21的抑制物体内发挥作用的原理是设计并构建重组载体，其内含有mir-21的抑制物核苷酸序列，用基因转移的方法将重组载体导入受体细胞，通过载体过表达mir-21的抑制物核苷酸序列，此抑制物核苷酸序列与mir-21定点结合，从而抑制mir-21与faslg的3′-utr结合，faslg表达水平增加，与fas结合水平增加，从而促进fas的促细胞凋亡作用。

技术实现要素：

本发明提供了一种mir-21的模拟物及抑制物，该模拟物及抑制物可用于调节faslg蛋白表达，以及调节肝细胞增殖或凋亡的基础医学和临床医学的研究，有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进mirna在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种mir-21的模拟物，所述模拟物为seqidno.1。

本发明还提供了一种能抑制mir-21结合faslg的3′-utr的抑制物，所述抑制物选自faslg的3′-utr中长约700～1000bp区段；所述抑制物与mir-21的结合位点为ataagcta。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物为seqidno.2。

在根据本发明的一个实施方案中，所述抑制物核苷酸序列的5′和3′末端分别添加限制性酶切位点；优选地，所述限制性酶切位点在酶切后产生粘性末端；更优选地，所述的限制性酶切位点分别为xhoi和noti对应的核苷酸序列；所述xhoi酶切位点位于5′末端，所述noti酶切位点位于3′末端。

本发明进一步提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含上述mir-21的抑制物。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体中的标记基因为双荧光素报告酶。

在根据本发明的一个实施方案中，所述重组表达载体是通过将上述的mir-21抑制物连接到报告载体psi-check-2中得到的。

本发明还提供了上述mir-21的模拟物及抑制物在制备用于促进肝再生的药物中的应用；优选的，所述促进肝再生的药物为抑制细胞凋亡相关蛋白faslg表达和/或促进肝细胞增殖相关蛋白表达的药物。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本发明提供的mir-21的模拟物可以用于降低faslg蛋白的表达，以及促进肝细胞增殖的基础医学和临床医学的研究；本发明提供的mir-21的抑制物及其重组表达载体可以用于增加faslg蛋白的表达，以及促进肝细胞凋亡的基础医学和临床医学的研究；二者有利于为开发相关药物提供高效的、大通量的筛选和评价平台及手段，将大大促进mirna在肿瘤预防、诊断和治疗中的应用。

附图说明

图1为mir-21的高通量检测结果与qrt-pcr检测结果的比较。灰色线为高通量检测结果；黑色线为qrt-pcr检测结果；

图2为用含mir-21抑制物的重组表达载体转染brl-3a细胞的mtt检测结果；

图3a为brdu免疫组化检测rno-mir-21的mimic对brl-3a细胞增殖的影响；

图3b为brdu免疫组化检测细胞增殖结果统计；

图4a为mir-21与faslg的3′-utr结合位点示意图；

图4b为mir-21的mimic和inhibitor分别与faslg的3′-utr共转染brl-3a细胞后dual-luciferace检测结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：大鼠肝再生模型制备与取材

实验大鼠为成年健康雄性sprague-dawley大鼠，体重230±20g，由河南师范大学实验动物中心提供。饲养温度为21±2℃，相对湿度为60±10％，光照时间12h/d(8：00-20：00)，自由饮水、摄食。取114只上述大鼠，随机分为19组，每组6只。其中，正常对照(0h)1组，2/3肝切除(partialhepatectomy，ph)与假手术对照(shamoperation，so)各9组。ph组按higgins和anderson方法进行，so组除不切除肝叶外，其他同ph。手术后2、6、12、24、30、36、72、120和168h时，取肝右叶置于组织储存试剂(例如rnalater)中，于-20℃保存备用。

实施例2：mirnas的高通量测序

取适量上述保存于-20℃的肝组织置于装有液氮的研钵中研磨，按mirvanamirnaisolationkit(ambion，usa)操作指南提取和纯化mirnas。用琼脂糖凝胶电泳(180v，0.5h)检测总rna质量，分别通过260nm和280nm波长测定rna的浓度和纯度。实验用样品的28s和18srrna亮度比约为2∶1，od260/od280≥2.0。mirnas的定性和定量分析由上海伯豪生物技术公司进行，测序方法为单端solexamicrorna-seq测序，读长36nt。将测序得到的mirnas序列与mirnas库比对，确定mirnas的种类和丰度。

实施例3：大鼠肝再生相关mirnas

用单端solexamicrorna-seq高通量测序法，从实验组(ph)和假手术组(so)的0、2、6、12、24、30、36、72、120和168h等10个时间点的大鼠再生肝中检测出425条mirnas，经过ratio值分析表明，信号值大于20的126条mirnas中，39条发生了有意义的表达变化。其中，31条的ratio值≥对照2倍，视为有意义表达上调。4条的ratio值≤对照2倍，视为有意义表达下调。4条在有的时间点上调，有的时间点下调，视为上/下调。t-检验表明，上述39条发生了有意义表达变化的mirnas中，23条mirnas与肝再生相关(表1)。

表1大鼠肝再生中发生有意义转录变化的mirnas

注：表示ratio值≥2；表示ratio值≤05；“”表示p＜005，推测为大鼠肝再生相关micrornas。

实施例4：实时荧光定量pcr(qrt-pcr)检测

利用oligo6及primerpremier5.0软件，设计特异性stem-loop反转录(rt)引物和qrt-pcr上下游引物序列，并与mirbase进行物种比对，确定引物的特异性。将设计好的引物序列及u6内参引物序列交由上海生工生物工程公司合成(表2)。将提取的mir-21按照amv反转录试剂盒(promega，usa)操作说明进行反转录得到cdna，进行pcr反应，确定最佳反应温度、时间、模板和引物量，继而进行qrt-pcr。

qrt-pcr的条件均为：95℃2min，95℃15sec，60℃20sec，72℃20sec，40个循环。每个样品重复检测三次，所得数据用2^-δδct法作相对定量处理。

表2反转录引物及pcr引物序列

注：rt：反转录引物；fp：上游引物；rp：下游引物。

用qrt-pcr验证mir-21在大鼠再生肝中表达变化，验证结果如图1所示，mir-21的表达趋势与高通量测序结果基本吻合。

实施例5：大鼠肝细胞培养

实验所用大鼠正常肝细胞brl-3a购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，培养基为含10％胎牛血清(fbs)的dmem高糖培养基，细胞培养于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱里。取对数生长期细胞进行传代，5×10⁴个细胞/瓶。

实施例6：mtt法检测肝细胞增殖

在含brl-3a细胞的培养基中加入mtt(geneview，usa)，使其最终浓度达0.5mg/ml，于37℃避光培养4h，彻底弃去培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜(dmso，geneview，usa)，轻轻震荡10min，充分溶解甲瓒晶体。最后，用biotekreader酶标仪检测490nm处各孔的吸光值。每个实验组设置5个复孔，实验重复3次。

利用mir-21的mimic(50nm/孔)和inhibitor(100nm/孔)分别转染brl-3a细胞24、48和72h后做mtt检测，检测结果如图2所示，mimic促进了brl-3a细胞的增殖，inhibitor抑制了brl-3a细胞增殖，且差异显著(p＜0.01)。

实施例7：brdu-标记法检测肝细胞增殖

将brl-3a细胞接种于24孔细胞培养板中，1×10⁵个细胞/孔，待细胞长到50％融合度时，加入lipofectamine2000(invitrogen)和mimic(50nm/孔)转染细胞。在5％co2、37℃培养箱中培养48h，brdu荧光标记10h，70％体积分数的乙醇固定，变性(1mhcl，56℃，35min)、抗原修复(0.1％胰酶37℃孵育1h)。brdu一抗(用体积分数为0.1％的bsa以1∶1000的体积比稀释，sigma，usa)4℃孵育12h，fitc-二抗(用0.1％bsa1∶50稀释，sigma，usa)室温孵育35min；然后0.1μg/ml的dapi(sigma，usa)中室温孵育10min复染细胞核，上述每进行一个步骤，均用pbs洗3次，每次5min。然后，在荧光显微镜下随机选取5个不重叠的视野(20×)拍照，用生物学软件image-proplus6.0对brdu阳性细胞和dapi标记的细胞核数分别进行计数，统计每组brdu阳性细胞占总细胞数的百分率，并用spss13.0统计学软件的单因素方差分析方法分析组间差异，p＜0.05表示有显著差异，p＜0.01表示差异极显著。

进一步用brdu免疫荧光检测brdu阳性肝细胞，检测结果如图3a、3b所示，mimic处理组brdu阳性对照显著高于对照组，inhibitor处理组brdu高于对照组。

实施例8：mirnas的靶基因预测及其功能确认

根据mirnas在大鼠肝再生中的表达变化，找出发生有意义表达变化的mirnas。用targetscan、miranda、pcitar、mirdb、mirwalk等在线分析工具预测上述mirnas的靶基因。简要地说，在mirwalk(www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirqwalk/index.html)主页上点击“micrornatargets”栏的“genetargets”，将目的mirnas输入搜索栏，在数据库选项中选择targetscan、miranda、pcitar、mirdb、mirwalk，点击“search”，获得靶基因。进一步查找kegg(www.genome.jp/keg/pathway.html)网站，确认mirnas的靶基因。将确认的靶基因与go数据库比对，找出靶基因参与的信号通路和/或细胞增殖和凋亡活动。继续将参与细胞增殖和凋亡信号通路的靶基因输入ipa等软件和qiagen等数据库，获得信号通路的结构、成分和信号传导路径。

实施例9：双荧光素酶报告基因检测系统的设计与构建

按上述方法，将目的mirnas输入mirwalk网站的“genetargets”搜索栏，点击“search”，获得mirna及其靶基因3′-utr端的结合位点。通过ncbi网站，找到相应结合位点的。委托上海捷瑞生物工程公司用其相应方法合成mir-21可识别的faslg基因的3′-utr约900bp核苷酸序列，并将该序列克隆到靶基因报告载体psi-check-2，备扩增、检测、筛选和使用。

实施例10：目的mirna与靶基因3′-utr结合的验证

用双荧光素酶报告基因检测系统(dlr)验证目的mirna与靶基因的结合。简要地说，在24孔细胞培养板中，加入0.5ml10％fbs的dmem高糖培养液和2×10⁴个细胞/孔，培养于37℃、饱和湿度、5％co2的培养箱里。待细胞的融合度达到50％时，分别将以下分组共转染brl-3a细胞。(1)lipofectamine2000(invitrogen)、“靶基因-报告载体”和mimic；(2)lipofectamine2000(invitrogen)、“靶基因-报告载体”和inhibitor；(3)lipofectamine2000(invitrogen)、“点突变-靶基因-报告载体”和mimic；(4)lipofectamine2000(invitrogen)、“点突变-靶基因-报告载体”和inhibitor；(5)lipofectamine2000(invitrogen)、“报告载体”和mimic；(6)lipofectamine2000(invitrogen)、“报告载体”和inhibitor。此外，还包括上述六组的mimic和inhibitor的阴性对照。mimic浓度为50nm/孔，inhibitor浓度为100nm/孔。转染48h后，小心吸掉上清，每孔加入200μl报告基因-细胞裂解液，轻轻振荡30min，15000g/min离心5min，取上清，在96孔板中加入100μl/孔上清和100μl/孔萤火虫荧光素酶检测液(购自碧云天生物技术有限公司)，迅速混匀，在560nm波长条件下检测其吸光值(od值)；检测完毕后，再在其中加入100μl/孔海肾荧光素酶检测液(按海肾荧光素酶检测底物：海肾荧光素酶检测缓冲液＝1∶100稀释)，迅速混匀，在465nm波长条件下，检测其吸光值(od值)。做3次重复实验，每次检测3个复孔。t检验实验组与对照的差异性，找出差异显著(p＜0.05)、极显著(p＜0.01)和不显著(p≥0.05)组。

实施例11：mir-21的促进brl-3a细胞生长增殖机制

取对数生长期的brl-3a细胞，按5×10⁴/孔接种在24孔板中，用含faslg3′-utr的萤光素酶报告质粒或含突变faslg的3′-utr的报告质粒和mir-21mimic/inhibitor共转。在转染后48h，使用双荧光素酶报告基因测定试剂盒(promega)分析蛋白质提取物的荧光值。结果表明，mir-21的mimic能与faslg的3′-utr结合，并降低荧光活性(p＜0.05)，但添加mir-21的inhibitor后，mir-21与faslg的3′-utr结合降低，也未见荧光活性降低(p＜0.01)(图4a、b)。此结果表明mir-21可以通过靶向结合faslg的3′-utr，阻遏faslg表达，降低faslg与凋亡蛋白fas结合水平，从而抑制brl-3a细胞凋亡，促进brl-3a的增殖。而mir-21的inhibitor可以抑制mir-21与faslg的3′-utr结合，促进faslg表达，faslg又与凋亡蛋白fas结合，促进brl-3a细胞凋亡。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明透露的技术范围内，可想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

<110>河南师范大学

<120>mir-21的模拟物、抑制物及其重组表达载体与应用

<130>ey01pt011700460

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列

<400>1

uagcuuaucagacugauguuga22

<210>2

<211>712

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aggaaaaagcattttagaatgatctattattctttatcatggatgccaggaatattgtcc60

ttcaatgagagtcttcttaagaccaattgagccacaaagaccacaaggtccaacaggtca120

gctacccttcattttctagaggtccatggagtggtccttaatgcctgcatcatgagccag180

atgggaagaagactgttcctgaggaacataaagttttgggctgctgtgtggcaatgcaga240

ggcaaagagaaggaactgtctgatgttaaatggccaagagcattttagccattgaagaaa300

aaaaaaacctttaaactcaccttccagggtgggtctacttgctacctcacaggaggccgt360

cttttagacacatggttgtggtatgactatacaagggtgagaaaggatgctaggtttcat420

ggataagctagagactgaaaaaagccagtgtcccattggcatcatctttatttttaactg480

atgttttctgagcccacctttgatgctaacagagaaataagaggggtgtttgaggcacaa540

gtcattctctacatagcatgtgtacctccagtgcaatgatgtctgtgtgtgtttttatgt600

atgagagtagagcgattctaaagagtcacatgagtacaacgcgtacattacggagtacat660

attagaaacgtatgtgttacatttgatgctagaatatctgaatctttcttgc712

<210>3

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgactcaaca50

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctagcttatcagactgatgttg22

<210>5

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

gtgcagggtccgaggt16

<210>6

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctcgcttcggcagcaca17

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

aacgcttcacgaatttgcgt20