一步法微滴数字PCR定量检测果蔬中GII型诺如病毒的方法与流程

本发明涉及食品质量安全检测技术领域，具体涉及一种一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法。

背景技术：

食源性病毒疾病是一个正在受到关注的社会问题。在世界范围内，50％以上的急性肠胃炎事件是由诺如病毒所造成，其中主要的基因型为gii。诺如病毒最早在1972年被kapikan等人所检出。它具有感染剂量低，能忍受大范围温度变化等特点，是造成非细菌性急性肠胃炎的重要原因。它主要传播途径为“粪--口”传播，可通过人与人之间直接传播，或接触到被污染的水和食物而进行传播，常受到污染的食品有蔬菜，软质水果，贝类等。如何检测食品中的诺如病毒并进行定量，是一个热点问题。目前诺如病毒的检测方法通常采用荧光定量qpcr进行定性和定量分析。2017年国家颁布食品中诺如病毒检测的荧光定量pcr方法--《gb4789.42-2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》。然而在qpcr方法的实际检测应用中发现：若检测样品存在pcr抑制物，则会降低其灵敏度和准确性，易造成假阴性；同时rt-qpcr法需要依赖ct值和标准曲线的准确性才能对样品进行定量分析，存在一定的不确定性，难以检测微小的拷贝数变化；灵敏度有限也是qpcr的一个不足之处。鉴于诺如病毒是一种高感染性病毒，在食品中的病毒量通常偏低，因此如何提高检测灵敏度，建立可信的检测方法，科学评估受感染食品的安全风险是一个急需解决的问题。

微滴数字pcr(ddpcr)是一种与qpcr不同的定量技术，ddpcr中单个核酸分子被分配到体积极小(0.5fl～0.5nl)的油包水微滴中，使大部分微滴中的核酸分子数目为1或0，这允许在1μl的乳化剂中形成大约10⁷个反应，然后通过pcr扩增和荧光信号的累计读取阳性微滴数目，再根据泊松分布计算出样本中的核酸分子数。ddpcr对检测目标的定量无需标准曲线，就可以实现核酸绝对定量分析。相比现有的常规和实时定量pcr，ddpcr的反应受扩增效率的影响大大降低，对pcr反应抑制物的耐受能力极大地提高，微滴离散技术同时可以规避样品pcr抑制物的影响，从而提高了检测灵敏度。ddpcr现在比较多用于转基因食品中检测，但用于食源性病毒上并未见到有应用，因此若能将ddpcr应用到食源性病毒的检测之中，将有效扩大病毒检测方法的范围，并能有效提高检测隐藏于食品抑制物中的病毒。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法，包括如下步骤：

(1)对果蔬样品中病毒进行洗脱，得到洗脱悬浮液，然后加入氯仿/正丁醇溶液，混合，室温静置，离心，收集上层水相；

(2)以步骤(1)得到的上层水相进行病毒rna提取，得到病毒rna样品；

(3)利用逆转录微滴数字聚合酶链式反应(rt-ddpcr)，结合已报道用于实时荧光定量rt-qpcr检测gii型诺如病毒的引物和探针，进行扩增反应，建立一步法rt-ddpcr高灵敏快速检测gii型诺如病毒的方法，实现gii型诺如病毒的高灵敏快速检测。

所述的果蔬样品的水果为软质水果。

所述的对果蔬样品中病毒进行洗脱的方法，包括如下步骤：

1)将果蔬样品切成约2.5cm*2.5cm*2.5cm的小块，装入锥形瓶中，加入tgbe溶液(对于水果还要额外加入1140ua.aculeatus果胶酶)，用锡纸盖好瓶口；

2)室温250r/min，振荡20min±1min，若ph低于9.0则需要用1mol/l的naoh调节至ph＝9.5±0.1；

3)将振荡液转移至离心管，8698～10000r/min，4±1℃离心30min±5min；取上清，用1mol/l的hcl调ph至7.0±0.5；

4)加入1/3体积的4xpeg8000/nacl溶液，使终浓度为100g/lpeg8000，0.3mol/lnacl；60s摇匀，在4±1℃，200r/min频率下振荡60±5min；

5)在4±1℃，8698～10000r/min离心30min±5min；弃上清，再在4±1℃，8698～10000r/min离心5±1min，紧实沉淀，弃上清；

6)加入磷酸缓冲液(pbs)进行悬浮沉淀，得到洗脱悬浮液。

步骤(1)中所述的洗脱悬浮液与氯仿/正丁醇溶液的体积比为1:1；

步骤(1)中所述的氯仿/正丁醇溶液中氯仿与正丁醇的体积比为1:1；

步骤(1)中所述的室温静置的时间为5±1min；

步骤(1)中所述的离心的条件为4±1℃、8698～10000r/min离心15min±1min。

步骤(2)中所述的病毒rna提取采用试剂盒提取。

步骤(3)中所述的引物和探针：

上游引物qnif2：5′-atgttcagrtggatgagrttctcwga-3′；

下游引物cog2r：5′-tcgacgccatcttcattcaca-3′；

探针qnifs：5′-fam-agcacgtgggagggcgatcg-bhq1-3′。

步骤(3)中所述的rt-ddpcr的反应体系为：采用伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒。

优选的，步骤(3)中所述的rt-ddpcr的反应体系为：

所述的rt-ddpcr的反应条件为：

逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃±2℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。

通过试验证明：本发明检测方法灵敏、准确、直观，对农业部、检验检疫局等政府部门以及相关检测机构和企业提供了新的检测方法并具有指导意义。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

(1)引物特异性好，与其他食源性病毒无交叉反应。

(2)灵敏度高，qpcr的灵敏度通常为10copies/μl左右，而ddpcr的灵敏度可达约2copies/μl。

(3)扩增效率高，扩增效率为95.4％，r²＝0.9973。

(4)稳定性好，对病毒样品经过不同时间后进行检测，组内cv小于4％，组间cv结果小于2％，说明重现性高。

(5)受抑制物影响小，qpcr的检测容易受反应抑制物的影响呈现假阴性，而利用ddpcr的微滴反应体系，能有效避免假阴性的出现。

(6)ddpcr检测效果等于或优于qpcr。病毒浓度较高时，ddpcr检测效果与qpcr无显著差异。低浓度下未经氯仿/丁醇处理的ddpcr病毒回收率显著优于qpcr(p<0.05)。

(7)优化后的蔬菜病毒洗脱步骤与原来国标步骤相比，在qpcr上有显著差异(p<0.05)，ddpcr上没有显著差异，但平均回收率有所提升。

附图说明

图1是rt-ddpcr检测novgii最佳退火温度探究实验，其中从左往右的温度分别为(℃)：60，58，57，56，54，52，51，50。

图2是rt-ddpcr检测novgii最佳引物浓度探究实验，引物浓度左至右分别为1.2μm，0.9μm，0.6μm，0.3μm，阴性对照。

图3是rt-ddpcr检测novgii最佳探针浓度探究实验，探针浓度左至右分别为450nm，350nm，250nm，150nm，阴性对照(阴性对照采用了250nm探针浓度)。

图4是rt-ddpcr检测novgii引物特异性试验。

图5是rt-ddpcr检测novgii敏感性试验，其中从左至右标准品的基因拷贝数分别为：阴性，2.116copies/μl，4.232copies/μl，8.465copies/μl，8.465*10¹copies/μl，8.465*10²copies/μl，8.465*10³copies/μl，8.465*10⁴copies/μl，8.465*10⁵copies/μl，8.465*10⁶copies/μl。

图6是rt-qpcr检测novgii敏感性试验，曲线1～8：标准品的基因拷贝数分别为：8.47*10⁶～8.47copies/μl，阴性。

图7是根据灵敏度计算出的rt-ddpcr检测novgii的标准曲线。

图8是根据灵敏度计算出的rt-qpcr检测novgii的标准曲线。

图9是生菜未经氯仿/丁醇处理qpcr检测，经氯仿/丁醇处理qpcr检测，未经氯仿/丁醇处理ddpcr检测，经氯仿/丁醇处理ddpcr检测四种方法下的生菜中诺如病毒gii回收率。

图10是草莓未经氯仿/丁醇处理qpcr检测，经氯仿/丁醇处理qpcr检测，未经氯仿/丁醇处理ddpcr检测，经氯仿/丁醇处理ddpcr检测四种方法下的草莓中诺如病毒gii回收率。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例用到的诺如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)、诺如病毒gi型(norovirusgenegroupi，novgi)、札如病毒(sapovirus，sav)、轮状病毒(rotavirus，rv)、星状病毒(astrovirus，astv)、腺病毒(adenovirus，adv)，均由广东省疾病预防控制中心提供。

实施例1rt-ddpcr扩增退火温度优化

按照loisy中诺如病毒gii型的上游引物和探针序列及kageyama中的诺如病毒gii型下游引物合成引物探针(见备注1，2)：

上游引物qnif2：5′-atgttcagrtggatgagrttctcwga-3′；

下游引物cog2r：5′-tcgacgccatcttcattcaca-3′；

探针qnifs：5′-agcacgtgggagggcgatcg-3′，探针5′端标记荧光报告基团fam，3′端标记荧光淬灭基团为bhq1。以同一病毒核酸为模板，按照仪器的梯度温度设置，从50～60℃(具体为50℃，51℃，52℃，54℃，56℃，57℃，58℃，60℃)选择8个温度进行实验优化。反应条件为：伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，采用0.9μmol/l的上、下游引物和0.35μmol/l探针浓度，模板添加量为2μl，用rnasefree水补充至20μl。逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，50～60℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。结果显示54℃下检测结果达最大值，因此选用54℃作为最优退火温度。(图1)

备注1.loisy,f.,etal.,real-timert-pcrfornorovirusscreeninginshellfish.journalofvirologicalmethods,2005.123(1):p.1-7

备注2.kageyama,t.,etal.,broadlyreactiveandhighlysensitiveassayfornorwalk-likevirusesbasedonreal-timequantitativereversetranscription-pcr.jclinmicrobiol,2003.41(4):p.1548-57.

实施例2rt-ddpcr扩增引物浓度优化

采用与实施例1相同的引物探针序列进行实验，以同一病毒核酸为模板，分别选用0.3μm，0.6μm，0.9μm，1.2μm的引物浓度进行探究，其余反应条件为：伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，终浓度0.35μmol/l探针浓度，模板添加量为2μl，用rnasefree水补充至20μl。逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。结果显示在0.9μm引物浓度中反应检测结果达最大值，因此采用0.9μm的引物浓度(图2)。

实施例3rt-ddpcr扩增探针浓度优化

采用与实施例1相同的引物探针序列进行实验，以同一病毒核酸为模板，分别选用150nm，250nm，350nm，450nm的探针浓度进行探究，其余反应条件为：伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，终浓度0.9μm的引物浓度，模板添加量为2μl，用rnasefree水补充至20μl。逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。结果显示在350nm探针浓度中反应检测结果达最大值，因此采用350nm的探针浓度(图3)。

实施例4

用建立的ddpcr方法分别对诺如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)、诺如病毒gi型(norovirusgenegroupi，novgi)，札如病毒(sapovirus，sav)，轮状病毒(rotavirus，rv)，星状病毒(astrovirus，astv)，腺病毒(adenovirus，adv)进行检测，验证该方法的特异性。结果显示，该方法对诺如病毒gii型有扩增，对其他病毒均无扩增，标明该方法特异性较好(图4)。

实施例5ddpcr与rt-qpcr敏感性分析对比

将连续梯度倍比稀释好的阳性标准品跟别进行ddpcr与rt-qpcr，微滴pcr的反应条件为：伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，终浓度0.9μm的引物浓度，终浓度为350nm的探针浓度，模板添加量为2μl，用rnasefree水补充至20μl。逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。rt-qpcr的反应条件为：大连宝生物公司onestepprimescriptrt-pcrkit(perfectrealtime)试剂盒中2*1stepbuffer10μl，rt-enzymemix0.4μl，extaqhs0.4μl，终浓度为0.8μmol/l的引物和0.4μmol/l探针，模板添加量为2μl。优化后的反应程序：逆转录：42℃15min，灭活逆转录酶：95℃10s；95℃5s，56℃30s，72℃30s，45个循环，在退火阶段收集荧光信号。由图5和6结果显示，在荧光定量pcr中，对连续梯度倍的阳性质粒进行10次检测，发现当质粒最低浓度为8.465copies/μl时，10次检测仅4次检出，其余浓度检出率为100％，因此推断荧光定量pcr的理论检测限为8.465copies/μl，而实验检测限为80.465copies/μl。ddpcr对低浓度的阳性质粒有扩增，最低检测拷贝数为2.116copies/μl，即其灵敏度是荧光定量pcr最低检测限的四倍。由图7和8可知，荧光定量pcr的r值为0.9986，斜率为-3.4123，扩增效率为96.36％。微滴数字pcr的r值为0.9973，扩增效率为95.44％，表明ddpcr和qpcr均具有良好的线性关系。

实施例6rt-ddpcr的稳定性试验

在确认了最优退火温度，最优引物及探针浓度后，为了确定该反应体系的稳定性，对病毒核酸样品进行组内(n＝5)以及组间(n＝3)实验。ddpcr的反应条件为：伯乐公司one-steprt-ddpcradvancedkitforprobes试剂盒中supermix5μl，rt-enzymemix2μl，dtt1μl，终浓度0.9μm的引物浓度，终浓度为350nm的探针浓度，模板添加量为2μl，用rnasefree水补充至20μl。逆转录42℃60min，95℃10min灭活逆转录酶，95℃30s，54℃1min，45个循环，98℃10min，爬坡速度为1℃/s。在三周内进行检测，每周检测一次，计算组内与组间检测结果的变异系数(coefficientofvariation,cv)，判断该方法的重复性和稳定性。

结果显示三周内组内cv均小于4％，组间cv结果为1.75％，说明本方法具有良好的重复性(表1)

表1一步法rt-ddpcr检测novgii稳定性性分析

实施例7

果蔬病毒粒子洗脱及通过人工染毒样品的病毒回收率进行微滴数字pcr的实用性检测

经测序确定为诺如病毒gii型(norovirusgenegroupii，novgii)的粪便标本加入pbs制成10％的便悬液，混匀，再用pbs依次稀释至10^-3并命名为高、中、低浓度，用于后续的食品染毒，每浓度留200μl用作提取rna用，病毒核酸拷贝数的测定通过病毒rna试剂盒直接对3个稀释度的粪便样本进行核酸提取，并用rt-ddpcr进行检测定量。

果蔬染毒：将生菜，草莓每份25g分装，每份样品中加入100μlgii型诺如病毒阳性粪便染毒液，点状涂布于果蔬表面约20个点，并放于4℃干燥过夜以增加附着量，做高、中、低三个浓度(其中染毒用的高浓度粪便样本核酸经rt-ddpcr测定值为1.70*10⁴copies/μl，中浓度测定值为1725copies/μl，低浓度测定值为160copies/μl)，每个浓度做三个重复，同时准备未染毒果蔬样品作为阴性对照。

果蔬病毒粒子洗脱方法参考《gb4789.42-2016食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》但修改为，1、将25g±0.3g果蔬样品切成约2.5cm*2.5cm*2.5cm的小块，装入250ml锥形瓶中，加入40ml±1mltgbe溶液(对于水果还要额外加入1140ua.aculeatus果胶酶)，用锡纸盖好瓶口。2、室温250r/min，振荡20min±1min。若ph低于9.0则需要用1mol/l的naoh调节至ph＝9.5±0.1。3、将振荡液转移至离心管，10000r/min，4±1℃离心30min±5min。取上清，用1mol/l的hcl调ph至7.0±0.5。4、加入1/3体积的4xpeg8000/nacl溶液，使终浓度为100g/lpeg8000，0.3mol/lnacl。60s摇匀，在4±1℃，200r/min频率下振荡60±5min。5、在4±1℃，10000r/min离心30min±5min。弃上清，再在4±1℃，10000r/min离心5±1min，紧实沉淀，弃上清。6、加入1000±10μlpbs进行悬浮沉淀。取500±10μl的悬浮液在中加入氯仿/正丁醇溶液(1：1)，涡旋混合，室温放置5±1min，于4±1℃、10000r/min离心15±1min。转移上层水相到新离心管中。将得到的悬浮液和氯仿丁醇处理后的富集液放于－20℃保存准备提取rna。

病毒rna核酸提取：用qiagen公司的qiaampviralrnaminikit试剂盒进行rna的提取。

提取的rna分别经rt-ddpcr与rt-qpcr按照实施例5的条件进行扩增，未染毒样品结果为阴性。根据不同染毒浓度和处理办法在两种检测仪器上得出的回收率数据在spss22.0软件中采用双因素方差分析法进行tukey差异显著性方差分析，回收率结果见表2，表3及图9，图10。

表2rt-qpcr与rt-ddpcr对生菜不同染毒浓度和方法回收率计算结果对比

表3rt-qpcr与rt-ddpcr对草莓不同染毒浓度和方法回收率计算结果对比

^a：3个样品中仅2个被检出

从生菜的回收率结果中显示，高、中浓度下，四种检测方法没有显著性差异。低浓度下，未经氯仿处理的qpcr(方法1)结果与另外三种方法均存在显著性差异(p<0.05)。而各种浓度下，方法2与方法3与方法4之间没有显著性差异。

从草莓的回收率结果显示，高浓度下，方法1与方法4存在显著差异(p<0.05)。中浓度下，有经过氯仿/丁醇处理的检测方法均与没有经过氯仿/丁醇对应的检测方法有显著差异(方法1与方法2，方法3与方法4)。于此同时，方法2与方法4没有显著差异。低浓度下，方法2与方法1有显著差异，且使用ddpcr检测的方法4与使用qpcr检测的方法2存在显著差异，但方法3与方法4没有显著差异。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>暨南大学

<120>一步法微滴数字pcr定量检测果蔬中gii型诺如病毒的方法

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agcacgtgggagggcgatcg20