肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法与流程

本发明体外诊断免疫检测领域，特别涉及肺炎支原体，以及肺炎支原体的嵌合抗原表达载体的构建、嵌合重组抗原的表达、制备，还涉及含有该抗原或抗原组合物的试剂盒和应用。

背景技术：

肺炎支原体（mycoplasmapneuoniae,mp）是介于细菌和病毒之间的一种超过滤性病原微生物，主要通过呼吸道飞沫以气溶胶微粒的形式传播。1962年首先从人类原发性非典型肺炎（primaryatypicalpneumonia,pap）患者的痰液中分离和培养而来。

20世纪90年代以来，随着肺炎病原学的变迁，mp已成为小儿肺炎的重要病原体，mp感染不仅引起肺部病变，且能侵犯心、脑、肝肾等其他器官，引起多种肺外表现。mp还是社区获得性肺炎（cap）的重要病原，尤其是5岁以上小儿，mp在非流行年占cap病原10~20%。因mp生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，形成间歇发病缓慢、长时期传播的流行特点，流行可达数月至数年。近些年来，流感人群比例逐年增加，不仅侵犯青少年和儿童，婴幼儿发病率也呈增多趋势，且由于mp感染常无特异性临床表现，容易与一般的病毒性感冒相混淆。因此，能够及时确诊何种病因致病，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，故早期诊断极为重要。

肺炎支原体抗体分为igg抗体和igm抗体两种，因为肺炎支原体感染的潜伏期为2周-3周，当患者出现症状而就诊时，igm抗体已达到相当高的水平，因此igm抗体阳性可作为急性期感染的诊断指标。如igm抗体阴性，也不能否定肺炎支原体感染，还需检测igg抗体。igg较igm出现晚，需动态观察。肺炎支原体igg抗体的测定，同时结合肺炎支原体igm抗体的检测，可用于辅助诊断支原体肺炎等疾病。

间接法检测人血清中特异的抗mp的igg与igm，在目前应用较多。优点是方便快捷，技术操作简单，对实验设备要求低，适合大规模检测。但国内至今尚无令人满意的免疫层析检测试剂盒。研制高质量的免疫层析检测试剂盒，最重要的是选用抗原性强、特异性好的抗原。我国目前使用的mp抗原多是培养的mp提取物，常混有其它蛋白产物，所以抗原特异性不强，容易产生假阳性。应用基因工程技术大量制备高纯度重组抗原是一种比较经济、实用的方法。随着分子生物学技术不断发展，越来越多的的mp主要抗原基因相继被克隆。这些基因表达的重组蛋白，表达纯化后可作为抗原包被，用于抗mp抗体检测。但是要筛选出抗原性好、表达量较高易于纯化的抗原，有一定困难。用重组嵌合抗原作为血清检测抗原可以克服多个基因重组抗原制备复杂、非特异性强及难以纯化的缺点，价廉、安全、快速且重复性好。

国外的研究证实mp的p1蛋白和p30蛋白具有较强的抗原性，在mp感染者的血清中抗体检出率较高，但也有两个缺点，一个是假阳性较高，另一个就是制备过程复杂。大量研究证明p1对应的b细胞表位属于空间构象特异性表位，蛋白属于线性表位。我们构建了mp多抗原表位序列的嵌合抗原，疫层析检测显示构建的嵌合抗原具有良好的抗原活性，其检测的灵敏度和特异性较市面上的产品的性能都有较大提高。

技术实现要素：

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列，包含如seqidno:1所示的氨基酸序列。

本发明其次所要解决的技术问题是提供一种全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列，包含如seqidno:2所示的氨基酸序列。

本发明还要解决的技术问题是提供一种构建首先是构建肺炎支原体嵌合抗原氨基酸序列的方法，步骤如下：s101利用计算机软件分析肺炎支原体蛋白的全部氨基酸序列，筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列p1：residues1177-1535、p30蛋白的抗原表位：residues170–254和mpn456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接。

在该基础上，本发明还提供了一种构建全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列的方法，步骤在上述s101基础上还有如下步骤：

根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上catatg和aagctt以分别获得内切酶ndeⅰ和hindⅲ的酶切识别位点catatg和aagctt，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pgem-tvector（promega公司产品）载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列。

同时，本发明还提供了上述包含全基因合成的肺炎支原体嵌合抗原的制备方法，包括如下步骤：

s301利用计算机软件分析肺炎支原体蛋白的全部氨基酸序列，该计算机软件可以选择anthewin等，筛选出肺炎支原体蛋白中包含抗原性的蛋白序列p1：residues1177-1535、p30蛋白的抗原表位：residues170–254和mpn456蛋白的抗原表位：residues765–846，并用柔性多肽互相连接，上述蛋白序列为抗原性较强的蛋白序列；

s302根据肺炎支原体基因，采用全基因合成方法，在其5′和3′端分别加上catatg和aagctt以分别获得内切酶ndeⅰ和hindⅲ的酶切识别位点catatg和aagctt，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pgem-tvector（promega公司产品）载体上，获得肺炎支原体嵌合抗原的全基因序列；

s303将上述步骤获得的含肺炎支原体基因质粒载体1μg用限制性内切酶hindⅲ/ndeⅰ进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pet28a（+），1%琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段，1%琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段=4:1混合，加入5μgt4连接酶16°c连接过夜，取5μl连接产物转化100μl预制好的dh5a感受态细胞，涂布抗性lb平板，37°c倒置培养过夜，挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有肺炎支原体的重组表达载体对的克隆命名为pet28a-mp。

进一步的，还包括步骤：将待鉴定含重组表达载体pet28a-mp克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶hindⅲ/ndeⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，可测得一条大小为1668bp的肺炎支原体基因。

该全基因合成方法合成嵌合基因的序列，表达出重组嵌合抗原，解决现有的免疫层析检测抗原特异性不强，灵敏度不高的问题。

进一步的，该肺炎支原体的重组表达载体的诱导表达过程和扩大培养过程如下，

诱导表达：

重组表达载体pet28a-mp转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，在含有卡那霉素的lb培养平板上培养，挑选单菌落接种到5mllb培养基中筛选得到的阳性重组菌进行诱导表达，产物进行sds-page分析；

扩大培养：

接种经过sds-page鉴定有目的蛋白表达的工程菌单菌落到200ml含kanamycin的lb三角瓶，200rpm，37°c震荡培养过夜，次日，按5%接种量，接种到400mllb含kanamycin的1l三角瓶中，37°c，240rpm震荡培养至od600=0.5，置冰水浴冷却至22°c，加入iptg诱导肺炎支原体基因表达，其中，iptg的浓度为0.01mm，诱导时间为6小时，震荡速度为240rpm/min。

本发明另外又提供了一种肺炎支原体检测试剂条，所述试剂条包括pvc板及粘贴在pvc板上的nc膜、金标条、玻纤以及吸水纸，该pvc板首尾两端为样品垫及吸水垫，其特征在于所述nc膜的t柱包被有如前所述的重组的肺炎支原体嵌合抗原，c柱包被有如前所述重组的肺炎支原体嵌合抗培养的单克隆抗体。

最后，本发明提供了一种肺炎支原体检测试剂的制备方法，它包括如下步骤：胶体金的制备；

金标制备：

1、抗原稀释：

取一定量的如权利要求2或4所述的肺炎支原体重组抗原，经过透析、离心处理后，用ph8.00.1mpb稀释至1mg/ml，4℃保存备用；

2、抗原偶联；

3、制备金标工作液；

4、制备金标条；

5、试剂条的组装：

将处理好的nc膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到pvc板上，该pvc板首尾两端为样品垫及吸水垫。

进一步的，该步骤详细为：

s801胶体金的制备：

取1ml1%氯金酸（haucl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化。此时制得的胶体金颗粒为30nm；

s802金标制备：

1、抗原稀释：

取一定量的肺炎支原体重组抗原（mp-ag），经过透析、离心处理后，用ph8.00.1mpb稀释至1mg/ml，4℃保存备用；

2、抗原偶联：

取250ml制备好的30nm胶体金，用1mnaoh调节ph至9.0，然后加入上述抗原1ml，磁力搅拌器上搅拌1小时，然后加入一定量的bsa至终浓度1%，继续搅拌0.5小时；

3、金标工作液的制备

将上述已经偶联好抗原的胶体金溶液离心（4000rpm，15分钟），弃去沉淀，保留溶液。然后进行二次离心（12000rpm，30分钟），弃去上清液，保留沉淀。沉淀用含20%的蔗糖的金标稀释液（ph8.00.02mtris+1%bsa）复溶至10ml，转入棕色瓶内，4℃保存备用；

4、金标条的制备：

取上述金标工作液10ml，上样到喷金机，设定参数选取喷量为1.5μl/cm。打开气泵，待气压稳定后，启动喷金机，将金标工作液均匀喷到30cm*6.5cm的金标垫上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，切成8mm宽的条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

s803nc膜的包被：

1、抗体及多抗稀释

将一定量的鼠抗人igg单抗（igg-mab），经过透析、离心处理后，用ph7.40.01mpbs稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。

将一定量的肺炎支原体重组抗原单克隆抗体（mp-mab），经过透析、离心处理后，用ph7.40.01mpbs稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。

2、抗原包被

将上述抗原及多抗分别上样到点膜机的t、c柱中，设定参数选择喷量为1.0μl/cm。调整划膜头的位置，使t、c线在nc中部，且间距5mm。启动点膜机，将t、c线溶液包被到nc膜上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

s805玻纤的处理：

将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用；

s806试剂条的组装：

将处理好的nc膜、金标条、玻纤以及吸水纸分别粘贴到pvc板上，然后切割成4.0mm条，该pvc板首尾两端为样品垫及吸水垫。

该试剂或试剂条为检测成本低、灵敏度高、检测线性范围广、重现性高、可定量的、操作简单的肺炎支原体igg试剂盒，利用金标免疫层析对定标品进行检测，测试试剂样本，并对肺炎支原体igg金标免疫层析分析系统进行性能（灵敏度、线性、精密度、干扰性）的评价。

本发明与目前技术相比，具有以下优点：

1、本发明选择mp重组嵌合抗原作为标记材料，并应用于金标免疫层析系统，

该检测体系为直接标记捕获，与市场评价较好的、以单一片段重组抗原为包被的igg检测产品相比较，灵敏度有较大幅度的提高，而抗原其特异性又较以mp培养物为包被的产品有提高，且其抗原易于培养纯化，更加节约成本；

2、为临床提供一种既快速又能准确检测肺炎支原体igg的新方法，为诊断mp感染提供帮助，具有良好的市场前景。

附图说明

图1表示的是重组表达载体pet28a-mp酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示重组表达载体pet28a-mp酶切后可以看到两条带，上面一条为pet28a，下面一条是大小为1668bp的肺炎支原体基因。

图2表示的是重组肺炎支原体的诱导表达sds-page蛋白电泳图。

图3表示的是纯化的肺炎支原体sds-page蛋白电泳图。

图4为本发明所述的试剂条示意图。

图5为本发明nc膜的性能示意图。

具体实施方式

下面的实施例可更详细地说明本发明，但不可以任何形式限制本发明。并且，实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例一、含有肺炎支原体基因的重组表达载体的构建及重组mp嵌合抗原的制备：

1、mpp1蛋白、p30蛋白和mpn456蛋白抗原表位的筛选

利用anthewin等软件，通过计算机分析mp蛋白的全部氨基酸序列（m.pneumoniafhstrain），筛选出mp蛋白包含抗原性的蛋白序列p1(residues1177–1535)；筛选出p30蛋白的抗原表位（residues170–254）和mpn456蛋白的抗原表位((residues765–846）,并用柔性多肽（gly4ser）3互相连接。他们的氨基酸序列为seqidno:1。

2、肺炎支原体基因的获取

不同于其他病原体，mp采用不同于独特的偏性密码子系统，通用的终止密码子uga在mp中编码色氨酸，如果直接采用mp的野生基因能造成蛋白翻译的中断，限制了重组mp抗原的研制。为了获得具有诊断意义的重组mp抗原，本发明针对mp的黏附蛋白1(p1)、p30以及mpn456蛋白抗原区间进行生物信息学表位预测，获得其中可能与患者血清发生免疫反应的抗原片段的氨基酸序列,同时采用了不影响抗原反应性的柔性多肽将三个片段串联表达，减少了制备重组抗原的难度。

为了克服野生mp基因密码子偏性的问题，本发明采用大肠杆菌优势密码子反向翻译上述抗原的氨基酸序列，获得由大肠杆菌优势密码子组成的全新mp嵌合抗原基因。

根据肺炎支原体基因（m.pneumoniafhstrain），采取全基因合成方法，并在其5′和3′端分别加上catatg和aagctt以分别获得内切酶ndeⅰ和hindⅲ的酶切识别位点catatg和aagctt，序列长度1668bp，将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pgem-tvector（promega公司产品）载体上，获得了肺炎支原体（mp）嵌合抗原的全基因序列,其基因序列如seqidno:2所示。

3、重组表达载体构建

将上述步骤获得的含肺炎支原体基因质粒载体1μg用限制性内切酶hindⅲ/ndeⅰ进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pet28a（+），1%琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段，1%琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段=4:1混合，加入5μgt4连接酶16°c连接过夜。取5μl连接产物转化100μl预制好的dh5a感受态细胞，涂布抗性lb平板，37°c倒置培养过夜。挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有肺炎支原体的重组表达载体对的克隆命名为pet28a-mp。

4、重组表达载体的酶切鉴定

将待鉴定含重组表达载体pet28a-mp克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶hindⅲ/ndeⅰ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图1所示。其中泳道1为重组表达载体pet28a-mp酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，m为dna分子量标准。说明书附图1表示的是重组表达载体pet28a-mp酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示重组表达载体pet28a-mp酶切后可以看到两条带，上面一条为pet28a，下面一条是大小为1668bp的肺炎支原体基因。

实施例二、肺炎支原体的诱导表达和扩大培养

取实施例一获得的重组表达载体pet28a-mp转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，在含有卡那霉素的lb培养平板上培养，挑选单菌落接种到5mllb培养基中筛选得到的阳性重组菌进行诱导表达，产物进行sds-page分析，并与含有表达载体pet28a(+)的对照菌进行对比，结果如图2所示，说明书附图2表示的是重组肺炎支原体的诱导表达sds-page蛋白电泳图，其中杂蛋白较多。

与无目的基因的对照菌的破菌上清与总蛋白(图2中的泳道3、4)相比，阳性重组菌的破菌上清与总蛋白中均可观察到分子量约为60kda的重组蛋白条带(图2中的泳道1、2)，该重组蛋白的分子量与重组肺炎支原体的分子量相符，初步判定该条带即为mp。虽然破菌上清中的目的蛋白(图2中泳道1)没有总蛋白中的目的蛋白(图2中泳道2)含量高，但其所占比例与总蛋白中目的蛋白所占比例相当，说明mp大部分以可溶形式表达，能够方便地通过镍亲和层析的方式纯化。

接种经过sds-page鉴定有目的蛋白表达的工程菌单菌落到200ml含kanamycin的lb三角瓶，200rpm，37°c震荡培养过夜，次日，按5%接种量，接种到400mllb含kanamycin的1l三角瓶中，37°c，240rpm震荡培养至od600=0.5，置冰水浴冷却至22°c，加入iptg诱导肺炎支原体基因表达，其中，iptg的浓度为0.01mm，诱导时间为6小时，震荡速度为240rpm/min。

实施例三、肺炎支原体的分离纯化

由于上述实施例1构建的重组表达载体pet28a-mp上带有融合标签（his·tag）的基因序列，所以表达出的目的蛋白上也带有his·tag标签。因此，利用络合ni的琼脂糖通过亲和层析法可以进行目的蛋白的纯化，亲和层析柱购于gehealthcare公司。

按照上述实施例2的方法用iptg进行诱导表达后，以10000rpm/min离心5min收获菌体沉淀；将菌体沉淀用buffera(20mmtris，0.5mnaclph8.0)（60mlbuffera/l菌体）重悬，250w超声裂解90次，每次5s，间歇10s，4°c条件下12000rpm/min离心20min收集上清准备上样。

具体纯化步骤如下：

1）用buffera平衡ni柱至od280读数恒定；

2）收集的样品滤过上清上柱；

3）用含有40mm咪唑的buffera过柱淋洗去掉杂蛋白；

4）用含有300mm咪唑的buffera缓慢过柱，将纯化的目的蛋白收集到离心管中；

5）取纯化后的目的蛋白进行sds-page，观察，目的蛋白的纯化效果；

结果如图3所示，说明书附图3表示的是纯化的肺炎支原体sds-page蛋白电泳图；其中，泳道1为样品纯化后的sds-page检测结果，泳道2m为14.0kda～116.0kda的蛋白质分子量标准。

实施例四、肺炎支原体检测试剂制备及检测

一、胶体金的制备

取1ml1%氯金酸（haucl4）溶液，加入到100ml水中，加热至沸，再加入1.5ml1%柠檬酸三钠，混合煮沸5分钟，直到颜色不再发生变化。此时制得的胶体金颗粒为30nm。

二、金标制备

1、抗原稀释

取一定量的肺炎支原体重组抗原（mp-ag），经过透析、离心处理后，用ph8.00.1mpb稀释至1mg/ml，4℃保存备用。

2、抗原偶联

取250ml制备好的30nm胶体金，用1mnaoh调节ph至9.0，然后加入上述抗原1ml，磁力搅拌器上搅拌1小时，然后加入一定量的bsa至终浓度1%，继续搅拌0.5小时。

3、金标工作液的制备

将上述已经偶联好抗原的胶体金溶液离心（4000rpm，15分钟），弃去沉淀，保留溶液。然后进行二次离心（12000rpm，30分钟），弃去上清液，保留沉淀。沉淀用含20%的蔗糖的金标稀释液（ph8.00.02mtris+1%bsa）复溶至10ml，转入棕色瓶内，4℃保存备用。

4、金标条的制备

取上述金标工作液10ml，上样到喷金机，设定参数选取喷量为1.5μl/cm。打开气泵，待气压稳定后，启动喷金机，将金标工作液均匀喷到30cm*6.5cm的金标垫上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，切成8mm宽的条放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。

三、nc膜的选择

选取市场上使用率较高的三家公司的nc膜：pallvivid170、millipore135、sartoriuscn140，规格为2.5*30cm，带背衬，孔径为8um进行对比，要求膜各点的宽度与厚度均一；跑水性能符合要求：层析4cm的时间在130s-140s，且无倾斜和空白；性能测试符合要求：将三种nc膜分别包被1.0mg/ml的鼠抗人igg并配对相应的金标条，测试一份阴性样本、一份临界阴性样本（要求3-5分钟显色）以及一份临界阳性样本（要求5分钟之内显色）

如图5所示，结果分析，我们选择millipore135作为肺炎支原体抗体检测试剂盒的生产用nc膜。

四、nc膜的包被

1、抗体及多抗稀释

将一定量的鼠抗人igg单抗（igg-mab），经过透析、离心处理后，用ph7.40.01mpbs稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。

将一定量的肺炎支原体重组抗原单克隆抗体（mp-mab），经过透析、离心处理后，用ph7.40.01mpbs稀释至终浓度1.0mg/ml，4℃保存备用。

2、抗原包被

将上述抗原及多抗分别上样到点膜机的t、c柱中，设定参数选择喷量为1.0μl/cm。调整划膜头的位置，使t、c线在nc中部，且间距5mm。启动点膜机，将t、c线溶液包被到nc膜上。将喷好金标工作液的金标垫放入37℃恒温箱内干燥24小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。

五、玻纤的处理

将玻璃纤维素膜切割成17*300mm条，放入玻纤处理液中浸泡1小时后取出，放入37℃恒温箱内干燥12小时后取出，放入自封袋中，然后封入内装干燥剂的铝箔袋，20℃保存备用。

玻纤处理液配方

六、试剂条的组装

将处理好的nc膜2、金标条4、玻纤以及吸水纸分别粘贴到pvc板1上，然后切割成4.0mm条，如图4所示，该pvc板首尾两端为样品垫5及吸水垫3。

七、用重组mp嵌合抗原检测mp抗体igg

组装好的肺炎支原体抗体检测试剂盒适用于肺炎支原体抗体的检测。结果显示，灵敏度及特异性与已上市其它公司产品相比，都有比较显著的提高。并且与含有hbsag抗体、hiv抗体、hcv抗体、tp抗体、hav抗体样品以及htlv抗体样本均不发生交叉反应。

在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。以上所述仅是本发明的示范性实施方式，而非用于限制本发明的保护范围，本发明的保护范围由权利要求确定。

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<110>杭州隆基生物技术有限公司

<120>肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法

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<110>杭州隆基生物技术有限公司

<120>肺炎支原体嵌合抗原、该抗原检测试剂及两者的制备方法

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