一种具有SOD酶活性的双三氮大环双核铜配合物及制备方法与流程

本发明涉及生物无机化学以及药学研究领域，具体涉及一种具有sod酶活性的双三氮大环双核铜配合物及制备方法。

背景技术：

当细胞呼吸和新陈代谢时会产生o2^-。、h2o2、oh^。等不同种类的活性氧自由基，这些自由基在生物体内积累至较高浓度时可造成细胞损伤，进而引发机体衰老以及炎症、再灌注损伤或者神经退行性疾病。大量的研究结果表明，在生物体内广泛存在一种针对于超氧离子o2^-。的重要的抗氧化酶，它具有催化超氧离子分解的功能，通过歧化反应把生物体内过量的超氧离子o2^-。分解转化为o2和h2o2，这种抗氧化剂被命名为超氧化物歧化酶，简称sod酶。

目前利用双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生物制备超氧化物歧化酶人工模拟物的研究已取得了丰富的成果，研究中主要以环骨架n原子非取代的双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生物或者环骨架n原子连接有配位侧臂的双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生物作为大环配体所合成的铜、锰、镍配合物作为超氧化物歧化酶人工模拟物。

迄今为止，利用双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生配体已经合成了种类丰富的sod酶模拟物，它们也展现出了一定的酶活性。但是利用骨架n原子非取代的双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生配体合成的sod酶模拟物容易在溶液状态下易形成无活性/活性较弱的二聚体物种；而由骨架n原子上连接有配位侧臂的双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生配体合成的sod酶模拟物虽然可借助侧臂的空间位阻效应避免形成二聚体，但是由于金属离子周围可交换的配位位点减少以及侧臂自身的空间位阻，也会导致模拟物的sod酶活性降低。

综上所述，现有的基于双1，4，7-三氮杂环壬烷衍生配体的sod酶模拟物的酶活性距离天然sod酶的活性依然存在较大差距。

技术实现要素：

本发明的目的就在于为了解决现有的sod酶模拟物的酶活性低问题而提供一种具有sod酶活性的双三氮大环双核铜配合物（以下称为“双核铜配合物[cu2lcl4]”）及制备方法。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：

双核铜配合物[cu2lcl4]，是在基于具异丙基侧臂的双大环配体1，4-二[4，7-二（异丙基）-1，4，7-三氮杂环壬烷-1-甲基]苯（l）（以下简称为“双大环配体l”）制备出的双核铜配合物[cu2lcl4]。

双核铜配合物[cu2lcl4]，其制备方法包括以下步骤：

第一步，将双大环配体l和氯化铜按照1:2的摩尔比加入到甲醇中，所得溶液回流反应，产生绿色沉淀；

第二步，反应结束后减压过滤，用甲醇洗涤沉淀，室温下自然干燥，得到呈绿色粉末状产物即为双核铜配合物[cu2lcl4]。

双核铜配合物[cu2lcl4]，其制备所需双大环配体l的合成步骤包括：

第一步，将1，4-二[1，4，7-三氮杂环壬烷-1-甲基]苯与2-溴丙烷按照1：4~1：8的摩尔比混合于无水乙腈中；

第二步，加入无水碳酸钾固体，反应混合物在氮气保护下加热反应；

第三步，反应结束后减压抽滤，收集滤液，去除乙腈，得深黄色油状物；

第四步，用蒸馏水溶解该油状物，用氯仿萃取，合并氯仿相，经干燥、过滤、减压去除溶剂后得到双大环配体l。

有益效果在于：由于配体上非配位的异丙基可有效阻止无活性/弱活性的二聚体的形成，同时又可保证金属活性中心附近存在足够的可交换配位点用于结合超氧阴离子，从而使得该双核铜配合物[cu2lcl4]具有优异的sod酶活性。

附图说明

图1是本发明中双核铜配合物[cu2lcl4]的分子结构图；

图2是本发明中双大环配体l的合成路线示意图；

图3是本发明中双核铜配合物[cu2lcl4]浓度对nbt还原速率的影响示意图；

图4是本发明中v0/vcat^-1对双核铜配合物[cu2lcl4]浓度图。

附图标记说明如下：

v0表示不加双核铜配合物[cu2lcl4]时nbt的还原速率；vcat表示加入不同浓度的双核铜配合物[cu2lcl4]时nbt的还原速率。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

（一）双大环配体l的合成（图2），其合成方法如下：

在250ml的三颈烧瓶中依次加入50ml无水乙腈、2g碳酸钾、1.16g1，4-二[1，4，7-三氮杂环壬烷-1-甲基]苯以及1.59~3.18g2-溴丙烷，所得到的混合液在氮气保护下于80℃加热反应24小时；减压抽滤，收集滤液，减压蒸除乙腈，得深黄色油状物；加入25ml蒸馏水溶解油状物，用氯仿（3×50ml）萃取，合并氯仿相，经无水硫酸镁干燥半小时，用旋转蒸发仪去除溶剂，得到黄色的双大环配体（l）。

产量:1.26g,产率：74%。元素分析c32h60n6：理论值c72.67,h11.44,n15.89；计算值：c72.64,h11.40,n15.95%。红外光谱(kbr,cm^–1)：3473(s),2948(s),2840(m),1652(s),1463(s),1362(m),1158(s),829(w),711(m)。电喷雾质谱：m/z=529.6[l+h]⁺。

（二）双核铜配合物[cu2lcl4]的制备

双核铜配合物[cu2lcl4]是由一个具异丙基侧臂的双1，4，7-三氮杂环壬烷化合物作为配体与氯化铜在甲醇等有机溶剂中通过常规的溶液相反应获得，具体操作如下：

向50ml圆底烧瓶中加入53mg1，4-二[4，7-二（异丙基）-1，4，7-三氮杂环壬烷-1-甲基]苯（l）作为配体，通过滴液漏斗向烧瓶内逐滴加入5ml溶解有34mg二水合氯化铜的甲醇溶液；混合溶液于80℃回流反应3小时，反应过程中产生绿色沉淀；反应结束后冷却至室温，减压过滤，并用甲醇（3×5ml）洗涤沉淀，室温下自然干燥，得到双核铜配合物[cu2lcl4]的呈绿色粉末状产物。

产量：62mg，产率：76%。元素分析c32h60cl4cu2n6：理论值c48.24,h7.54,n10.55%；计算值c48.18,h7.46,n10.61%。红外光谱(kbr,cm^–1)：3485(s),2935(s),2851(m),1642(s),1458(s),1369(m),1165(s),827(w),719(m)。电喷雾质谱：m/z=363.1[cu2lcl2]⁺。

所得到的双核铜配合物[cu2lcl4]，两个cu(ii)离子均处于由三氮大环骨架氮原子以及两个氯离子构成的配位层中，配体上非配位的异丙基可有效阻止无活性/弱活性的二聚体的形成，而金属活性中心附近由氯离子占据的可交换配位点可用于结合超氧离子，对于配合物呈现sod酶活性起关键作用。

（三）双核铜配合物[cu2lcl4]的sod酶活性测试

通过黄嘌呤(xo)与黄嘌呤氧化酶(xod)发生原位反应产生o2^•-，使用氯化硝基四氮唑蓝(nbt)作为超氧阴离子（o2^•-）的指示剂，间接测定双核铜配合物[cu2lcl4]的sod酶活性。因为nbt可以被o2^•-还原生成蓝色的甲臜。当加入sod酶或者其模拟物时，它们会与nbt竞争o2^•-并使o2^•-发生歧化反应。甲臜的最大紫外可见吸收在550nm处，加入双核铜配合物[cu2lcl4]前后用分光光度法测定黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-nbt复合体系在550nm处的吸光度，可测得nbt的还原速率（即甲臜的生成速率）从而确定双核铜配合物[cu2lcl4]催化o2^•-发生歧化反应的速率常数和ic50（ic50值是抑制nbt还原的百分数为50%时所需双核铜配合物[cu2lcl4]的浓度）。

具体实施步骤如下：

利用10mmpb缓冲溶液分别配置浓度为3×10^-4m的双核铜配合物[cu2lcl4]、2.5×10^-3m的nbt以及1.0×10^-3m的黄嘌呤(xd)储备液，并用10mmpb缓冲溶液将黄嘌呤氧化酶(xod)稀释为21μl/ml。用移液枪移取黄嘌呤储备液100μl、nbt储备液200μl和10mmpb缓冲液1.7ml，并将上述三种溶液混合均匀(混合溶液的总体积为2ml，其中包含250μmolnbt和50μmol的黄嘌呤)，加入适量的黄嘌呤氧化酶，确定黄嘌呤氧化酶的用量后，向体系中加入等体积但不同浓度的双核铜配合物[cu2lcl4]溶液，在25℃下，以10mmpb缓冲溶液作为参比溶液，利用紫外可见光谱仪观测各个体系在550nm处的吸光度值，设定吸光度的变化值为0.024/min，连续监测各个体系在10min内吸光度变化情况，每个浓度体系平行测定三组数据，以含不同浓度的双核铜配合物[cu2lcl4]的体系的吸光度值对时间作散点图，获得如附图3所示的6条直线，所得直线的斜率即为不同条件下nbt的还原速率。v0表示不加双核铜配合物[cu2lcl4]时nbt的还原速率，vcat表示加入不同浓度的双核铜配合物[cu2lcl4]时nbt的还原速率。

由图3可知，当体系中含有不同浓度的双核铜配合物[cu2lcl4]时，以550nm处甲臜的吸光度对时间作图所得的直线斜率有明显的变化，且随着双核铜配合物[cu2lcl4]浓度的增大相应直线的斜率也变得越小，说明该配合物能呈现出sod酶活性，可催化o2^•-发生歧化反应从而有效抑制nbt的还原。

以v0/vcat^-1对双核铜配合物[cu2lcl4]的浓度作散点图，得到附图4，线性拟合得到的直线斜率为kcat/knbt[nbt]，其中knbt是nbt被o2^•-还原的反应速率常数，knbt=5.88×10⁴mol/(l·s)，由直线斜率与kcat的关系计算出加入双核铜配合物[cu2lcl4]后的反应速率常数kcat，ic50为图3中v0/vcat^-1=1时对应的双核铜配合物[cu2lcl4]的浓度数值。

由图3得到ic50为0.074m，kcat=2×10⁸mol/(l·s)，双核铜配合物[cu2lcl4]催化歧化o2^•-的过程已接近扩散控制，该配合物的sod酶活性大约相当于同等实验条件下天然cu，zn-sod酶活性的20%（ic50为0.015m，kcat=10⁹mol/(l·s)），是目前现有的基于1，4，7-三氮杂环壬烷衍生配体的sod酶模拟物中酶活性最优异的一种化合物。