一种用于扩增甲型流感病毒的LAMP引物组及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于扩增甲型流感病毒(influenzaavirus，iav)的lamp引物组及试剂盒。

背景技术：

流感病毒属于正黏病毒科，可分为甲型，乙型和丙型。其中，甲型和乙型流感病毒引起的季节性流感，发病率和死亡率较高，不断引发全球性健康问题，造成的经济损失巨大。甲型病毒粒子表面囊膜上有血凝素(hemagglutinin，ha)与神经氨酸酶(neuraminidase，na)两种表面纤突，是两种重要的糖蛋白，也是病毒主要的表面抗原，根据ha与na的不同可区分为不同的亚型，例如h1n1和h7n9等，目前已被发现的h亚型有18种(h1～h18)，而n亚型有11种(n1～n11)，这些亚型的病毒几乎都可以从水生鸟类、家禽类和其他禽类种分离到。高致病性流感不仅会给养禽业造成巨大经济损失，同时还可以跨越宿主屏障直接感染人，严重威胁公共卫生安全。最广为人知的例子是目前在亚洲某些地区和非洲东北地区流行的亚型禽流感病毒h5n1，据报道该病毒从1997年开始导致人类患病和死亡，造成了严重的公共卫生安全问题，因此被列为需要报告的高致病性疫病，也被我国归为一类动物疫病。

目前甲型流感病毒的疫苗和药物只能针对特定型别，而目前为止尚无准确的甲型流感病毒的全分型检测方法。也因甲型流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，因此对于该疾病的防控则显得极为重要。而对于该病毒的快速、特异、高灵敏的诊断则为防控中的重要一环。世界卫生组织(who)推荐iav病毒检测方法为基于rt-pcr的针对2段及以上基因组特异性核酸序列的信号扩增检测，但应用rt-pcr方法，需要在标准生化分析实验室中使用精密的实时荧光pcr仪，并需要试剂准备、标本制备和pcr扩增检测三个独立的实验区，不适合用于现场快速筛查。而免疫检测技术所制成的试纸条具有简便快捷的优势，但该方法误检率较高、灵敏度较低，难于检测处于潜伏期的iav携带者，可能造成疫情的扩散。因此，面向现场的快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为iav防控提供强有力的保障。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是2000年日本荣研化学株式会社开发的替代pcr核酸扩增方法。该方法主要是利用4种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。环介导等温扩增技术(lamp)不需要昂贵的特殊仪器设备，反应结果可用肉眼直接观察，非常适合在基层开展病原微生物的早期诊断和筛选。其特点是在恒温(约65℃)条件下，利用针对靶序列的六段区域设计4条特异引物，在1h内能将数个拷贝的rna高效扩增到10⁹～10¹⁰倍。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，lamp反应在恒温水浴箱便可完成，仪器设备要求低，较传统pcr和培养法操作简单许多，不需要专业人员也可准确完成，适合基层医疗机构的应用。并且，lamp还可以大大缩短操作时间，减少了样品污染机会，适合应用于iav的快速诊断。

目前，关于iav的多保守位点的lamp全分型检测技术还未见报道。

技术实现要素：

本发明主要解决的技术问题在于提供一种用于扩增iav的二十九段保守序列的lamp引物组及试剂盒与应用，本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，将其制备成为试剂盒可实现对iav快速准确的分型检测。

本发明的用于扩增甲型流感病毒的lamp引物组，其特征在于，所述lamp引物组包括以下二十九组引物组中的一种或几种：针对iav的h1片段(例如genbank:u47310.1，其核苷酸序列如seqidno.117所示)扩增的引物组、针对iav的h2片段(例如genbank:ay207522.1，其核苷酸序列如seqidno.118所示)扩增的引物组、针对iav的h3片段(例如genbank:v01087.1，其核苷酸序列如seqidno.119所示)扩增的引物组、针对iav的h4片段(例如genbank:d90302.1，其核苷酸序列如seqidno.120所示)扩增的引物组、针对iav的h5片段(例如genbank:af144305.1，其核苷酸序列如seqidno.121所示)扩增的引物组、针对iav的h6片段(例如genbank:ay968676.1，其核苷酸序列如seqidno.122所示)扩增的引物组、针对iav的h7片段(例如genbank:aj584647.1，其核苷酸序列如seqidno.123所示)扩增的引物组、针对iav的h8片段(例如genbank:d90304.1，其核苷酸序列如seqidno.124所示)扩增的引物组、针对iav的h9片段(例如genbank:d90305.1，其核苷酸序列如seqidno.125所示)扩增的引物组、针对iav的h10片段(例如genbank:m21647.1，其核苷酸序列如seqidno.126所示)扩增的引物组、针对iav的h11片段(例如genbank:d90306.1，其核苷酸序列如seqidno.127所示)扩增的引物组、针对iav的h12片段(例如genbank:d90307.1，其核苷酸序列如seqidno.128所示)扩增的引物组、针对iav的h13片段(例如genbank:m26090.1，其核苷酸序列如seqidno.129所示)扩增的引物组、针对iav的h14片段(例如genbank:m35997.1，其核苷酸序列如seqidno.130所示)扩增的引物组、针对iav的h15片段(例如genbank:l43916.1，其核苷酸序列如seqidno.131所示)扩增的引物组、针对iav的h16片段(例如genbank:cy177441.1，其核苷酸序列如seqidno.132所示)扩增的引物组、针对iav的h17片段(例如genbank:cy103892.1，其核苷酸序列如seqidno.133所示)扩增的引物组、针对iav的h18片段(例如genbank:cy125945.1，其核苷酸序列如seqidno.134所示)扩增的引物组、针对iav的n1片段(例如genbank:gq290690.1，其核苷酸序列如seqidno.135所示)扩增的引物组、针对iav的n2片段(例如genbank:kc190181.1，其核苷酸序列如seqidno.136所示)扩增的引物组、针对iav的n3片段(例如genbank:ay207524.1，其核苷酸序列如seqidno.137所示)扩增的引物组、针对iav的n4片段(例如genbank:ay207531.1，其核苷酸序列如seqidno.138所示)扩增的引物组、针对iav的n5片段(例如genbank:km244094.1，其核苷酸序列如seqidno.139所示)扩增的引物组、针对iav的n6片段(例如genbank:ay207556.1，其核苷酸序列如seqidno.140所示)扩增的引物组、针对iav的n7片段(例如genbank:km244102.1，其核苷酸序列如seqidno.141所示)扩增的引物组、针对iav的n8片段(例如genbank:km244070.1，其核苷酸序列如seqidno.142所示)扩增的引物组、针对iav的n9片段(例如genbank:kc853231.1，其核苷酸序列如seqidno.143所示)扩增的引物组、针对iav的n10片段(例如genbank:cy103894.1，其核苷酸序列如seqidno.144所示)扩增的引物组、针对iav的n11片段(例如genbank:cy125947.1，其核苷酸序列如seqidno.145所示)扩增的引物组、。

其中，所述针对iav的h1区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h1-f3：其核苷酸序列如seqidno.1所示，h1-b3：其核苷酸序列如seqidno.2所示；以及，h1-fip：其核苷酸序列如seqidno.3所示，h1-bip：其核苷酸序列如seqidno.4所示；

所述针对iav的h2区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h2-f3：其核苷酸序列如seqidno.5所示，h2-b3：其核苷酸序列如seqidno.6所示；以及，h2-fip：其核苷酸序列如seqidno.7所示，h2-bip：其核苷酸序列如seqidno.8所示；

所述针对iav的h3区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h3-f3：其核苷酸序列如seqidno.9所示，h3-b3：其核苷酸序列如seqidno.10所示；以及，h3-fip：其核苷酸序列如seqidno.11所示，h3-bip：其核苷酸序列如seqidno.12所示；

所述针对iav的h4区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h4-f3：其核苷酸序列如seqidno.13所示，h4-b3：其核苷酸序列如seqidno.14所示；以及，h4-fip：其核苷酸序列如seqidno.15所示，h4-bip：其核苷酸序列如seqidno.16所示；

所述针对iav的h5区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h5-f3：其核苷酸序列如seqidno.17所示，h5-b3：其核苷酸序列如seqidno.18所示；以及，h5-fip：其核苷酸序列如seqidno.19所示，h5-bip：其核苷酸序列如seqidno.20所示；

所述针对iav的h6区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h6-f3：其核苷酸序列如seqidno.21所示，h6-b3：其核苷酸序列如seqidno.22所示；以及，h6-fip：其核苷酸序列如seqidno.23所示，h6-bip：其核苷酸序列如seqidno.24所示；

所述针对iav的h7区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h7-f3：其核苷酸序列如seqidno.25所示，h7-b3：其核苷酸序列如seqidno.26所示；以及，h7-fip：其核苷酸序列如seqidno.27所示，h7-bip：其核苷酸序列如seqidno.28所示；

所述针对iav的h8区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h8-f3：其核苷酸序列如seqidno.29所示，h8-b3：其核苷酸序列如seqidno.30所示；以及，h8-fip：其核苷酸序列如seqidno.31所示，h8-bip：其核苷酸序列如seqidno.32所示；

所述针对iav的h9区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h9-f3：其核苷酸序列如seqidno.33所示，h9-b3：其核苷酸序列如seqidno.34所示；以及，h9-fip：其核苷酸序列如seqidno.35所示，h9-bip：其核苷酸序列如seqidno.36所示；

所述针对iav的h10区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h10-f3：其核苷酸序列如seqidno.37所示，h10-b3：其核苷酸序列如seqidno.38所示；以及，h10-fip：其核苷酸序列如seqidno.39所示，h10-bip：其核苷酸序列如seqidno.40所示；

所述针对iav的h11区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h11-f3：其核苷酸序列如seqidno.41所示，h11-b3：其核苷酸序列如seqidno.42所示；以及，h11-fip：其核苷酸序列如seqidno.43所示，h11-bip：其核苷酸序列如seqidno.44所示；

所述针对iav的h12区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h12-f3：其核苷酸序列如seqidno.45所示，h12-b3：其核苷酸序列如seqidno.46所示；以及，h12-fip：其核苷酸序列如seqidno.47所示，h12-bip：其核苷酸序列如seqidno.48所示；

所述针对iav的h13区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h13-f3：其核苷酸序列如seqidno.49所示，h13-b3：其核苷酸序列如seqidno.50所示；以及，h13-fip：其核苷酸序列如seqidno.51所示，h13-bip：其核苷酸序列如seqidno.52所示；

所述针对iav的h14区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h14-f3：其核苷酸序列如seqidno.53所示，h14-b3：其核苷酸序列如seqidno.54所示；以及，h14-fip：其核苷酸序列如seqidno.55所示，h14-bip：其核苷酸序列如seqidno.56所示；

所述针对iav的h15区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h15-f3：其核苷酸序列如seqidno.57所示，h15-b3：其核苷酸序列如seqidno.58所示；以及，h15-fip：其核苷酸序列如seqidno.59所示，h15-bip：其核苷酸序列如seqidno.60所示；

所述针对iav的h16区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h16-f3：其核苷酸序列如seqidno.61所示，h16-b3：其核苷酸序列如seqidno.62所示；以及，h16-fip：其核苷酸序列如seqidno.63所示，h16-bip：其核苷酸序列如seqidno.64所示；

所述针对iav的h17区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h17-f3：其核苷酸序列如seqidno.65所示，h17-b3：其核苷酸序列如seqidno.66所示；以及，h17-fip：其核苷酸序列如seqidno.67所示，h17-bip：其核苷酸序列如seqidno.68所示；

所述针对iav的h18区片段扩增的引物组包括两对引物，分别为：h18-f3：其核苷酸序列如seqidno.69所示，h18-b3：其核苷酸序列如seqidno.70所示；以及，h18-fip：其核苷酸序列如seqidno.71所示，h18-bip：其核苷酸序列如seqidno.72所示。

本发明上述各引物的核苷酸序列如表1所示。

表1引物序列

进一步优选地，本发明所述lamp引物组包括针对iav的h1～h18区片段扩增的引物组中的一组或几组，和，针对iav的n1～n11区片段扩增的引物组中的一种或几种。

本发明的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，包括上述的lamp引物组。优选将lamp引物组制成工作液，所述工作液母液可以是(20mmtris-hclph8.8，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2～20mmmgso4，0.1～0.5％tritonx-100，0.2～1m甜菜碱，1～1.6mmdntp)引物组工作液为含1～20μm的f3、b3及5～80μm的fip、bip混合液，进行检测时推荐使用10～15μl的工作液母液及3～5μl的引物组工作液加上酶和水组成25μl的检测混合液。

根据本发明所述的试剂盒，其中，还包括lamp反应液和lamp显色液。进一步地，所述lamp反应液包括：bst聚合酶、amv反转录酶、lamp反应缓冲液和超纯水。

具体地，作为优选地，本发明所述的试剂盒中，包括引物组工作液(1～20μm的f3、b3及5～80μm的fip、bip混合液)、lamp反应液(20mmtris-hclph8.8，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2～20mmmgso4，0.1～0.5％tritonx-100，0.2～1m甜菜碱，1～1.6mmdntp，8ubstdna聚合酶和5uamv逆转录酶)和lamp显色液(羟基萘酚蓝或铬黑t等)。

lamp反应液(25μl体系)

20mmtris-hclph8.8

10mmkcl

10mm(nh4)2so4

2～20mmmgso4

0.1～0.5％tritonx-100

0.2～1m甜菜碱

1～1.6mmdntp

5～10ubstdna聚合酶(newenglandbiolabs)

5～10uamv反转录酶(newenglandbiolabs)

lamp显色液可优选sybrgreeni，evagreen，羟基萘酚蓝(hnb)，铬黑t(ebt)等中的一种。

在进行检测时，例如可以使用4～8μl的引物组工作液与lamp反应液组成25μl的检测混合液。lamp显色液加入量可以是100～150μmol/l检测混合液。

本发明还提供了非疾病诊断目的的iav病毒检测方法，包括以下步骤：

1)取核酸样本、所述lamp引物组的工作液与lamp反应液、超纯水、lamp密封液混合，制得扩增反应液；

2)取制得的扩增反应液，60～65℃反应20～80min，优选63℃反应60min，根据显色结果判断样品是否含有iav病毒。

根据权利本发明所述的检测方法，其中，所述lamp引物组的工作液中，引物h1-f3与h1-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h1-fip与h1-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h2-f3与h2-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h2-fip与h2-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h3-f3与h3-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h3-fip与h3-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h4-f3与h4-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h4-fip与h4-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h5-f3与h5-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h5-fip与h5-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h6-f3与h6-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h6-fip与h6-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h73-f3与h7-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h7fip与h7-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h8-f3与h8-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h8-fip与h8-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h9-f3与h9-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h9-fip与h9-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h10-f3与h10-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h10-fip与h10-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h11-f3与h11-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h11-fip与h11-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h12-f3与h12-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h12-fip与h12-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h13-f3与h13-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h13-fip与h13-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h14-f3与h14-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h14-fip与h14-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h15-f3与h15-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h15-fip与h15-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h16-f3与h16-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h16-fip与h16-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h17-f3与h17-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h17-fip与h17-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物h18-f3与h18-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物h18-fip与h18-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n1-f3与n1-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n1-fip与n1-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n2-f3与n2-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n2-fip与n2-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n3-f3与n3-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n3-fip与n3-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n4-f3与n4-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n4-fip与n4-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n5-f3与n5-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n5-fip与n5-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n6-f3与n6-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n6-fip与n6-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n7-f3与n7-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n7fip与n7-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n8-f3与n8-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n8-fip与n8-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n9-f3与n9-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n9-fip与n9-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n10-f3与n10-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n10-fip与n10-bip的浓度均为1～2μm；

所述引物n11-f3与n11-b3的浓度均为0.2～0.4μm，引物n11-fip与n11-bip的浓度均为1～2μm；

本发明还提供了上述lamp引物组以及试剂盒在非疾病诊断目的的iav病毒检测中的应用。

本发明基于lamp技术，针对iav的29个特异保守区域分别设计4条引物。本发明提供的引物组敏感性高、特异性强，由其制成的试剂盒能够快速、准确的检测到待测样品中含有的iav，并且可对待测样品中的iav型别进行分型检测及鉴定。由于本发明提供的引物组具有极高的特异性，在lamp扩增所需时间短，进一步缩短了检测的时间，简化了操作。本发明利用人造rna作为对照检测的过程中，无假阳性及假阴性现象产生。本发明提供的引物灵敏度和特异性皆很高，所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利。由于本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作就可完成对iav的快速准确检测，因此，适用于iav爆发时，专业程度不高的机场、海关、口岸、社区等地的现场快速检测。本发明所提供的可视化试剂盒将为现场检测提供极大便利，将其制备成为试剂盒可实现对iav快速准确的检测。

附图说明

图1为本发明实施例1中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图2为本发明实施例2中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图3为本发明实施例3中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图4为本发明实施例4中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图5为本发明实施例5中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图6为本发明实施例6中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图7为本发明实施例7中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图8为本发明实施例8中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图9为本发明实施例9中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图10为本发明实施例10中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图11为本发明实施例11中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图12为本发明实施例12中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图13为本发明实施例13中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图14为本发明实施例14中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图15为本发明实施例15中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图16为本发明实施例16中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图17为本发明实施例17中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图18为本发明实施例18中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图19为本发明实施例19中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图20为本发明实施例20中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图21为本发明实施例21中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图22为本发明实施例22中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图23为本发明实施例23中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图24为本发明实施例24中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图25为本发明实施例25中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图26为本发明实施例26中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图27为本发明实施例27中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图28为本发明实施例28中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图29为本发明实施例29中的荧光强度随反应时间变化的曲线图。

图30为本发明实施例30中的检测结果示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《分子克隆实验指南》(第三版)j.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1应用evagreen验证对iav-h1的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)

20mmtris-hclph8.8

10mmkcl

10mm(nh4)2so4

14mmmgso4

0.1％tritonx-100

1m甜菜碱

1.25mmdntp

8ubstdna聚合酶(newenglandbiolabs)

1xevagreen(biotum)

引物：

200nmh1-f3/seqidno.1

200nmh1-b3/seqidno.2

1600nmh1-fip/seqidno.3

1600nmh1-bip/seqidno.4

靶:iav-h1dsdna/seqidno.117

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例2应用evagreen验证对iav-h2的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh2-f3/seqidno.5

200nmh2-b3/seqidno.6

1600nmh2-fip/seqidno.7

1600nmh2-bip/seqidno.8

靶:iav-h2dsdna/seqidno.118

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例3应用evagreen验证对iav-h3的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh3-f3/seqidno.9

200nmh3-b3/seqidno.10

1600nmh3-fip/seqidno.11

1600nmh3-bip/seqidno.12

靶:iav-h3dsdna/seqidno.119

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例4应用evagreen验证对iav-h4的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh4-f3/seqidno.13

200nmh4-b3/seqidno.14

1600nmh4-fip/seqidno.15

1600nmh4-bip/seqidno.16

靶:iav-h4dsdna/seqidno.120

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例5应用evagreen验证对iav-h5的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh5-f3/seqidno.17

200nmh5-b3/seqidno.18

1600nmh5-fip/seqidno.19

1600nmh5-bip/seqidno.20

靶:iav-h5dsdna/seqidno.121

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例6应用evagreen验证对iav-h6的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh6-f3/seqidno.21

200nmh6-b3/seqidno.22

1600nmh6-fip/seqidno.23

1600nmh6-bip/seqidno.24

靶:iav-h6dsdna/seqidno.122

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例7应用evagreen验证对iav-h7的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh7-f3/seqidno.25

200nmh7-b3/seqidno.26

1600nmh7-fip/seqidno.27

1600nmh7-bip/seqidno.28

靶:iav-h7dsdna/seqidno.123

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例8应用evagreen验证对iav-h8的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh8-f3/seqidno.29

200nmh8-b3/seqidno.30

1600nmh8-fip/seqidno.31

1600nmh8-bip/seqidno.32

靶:iav-h8dsdna/seqidno.124

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例9应用evagreen验证对iav-h9的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh9-f3/seqidno.33

200nmh9-b3/seqidno.34

1600nmh9-fip/seqidno.35

1600nmh9-bip/seqidno.36

靶:iav-h9dsdna/seqidno.125

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例10应用evagreen验证对iav-h10的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh10-f3/seqidno.37

200nmh10-b3/seqidno.38

1600nmh10-fip/seqidno.39

1600nmh10-bip/seqidno.40

靶:iav-h10dsdna/seqidno.126

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例11应用evagreen验证对iav-h11的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh11-f3/seqidno.41

200nmh11-b3/seqidno.42

1600nmh11-fip/seqidno.43

1600nmh11-bip/seqidno.44

靶:iav-h11dsdna/seqidno.127

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例12应用evagreen验证对iav-h12的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh12-f3/seqidno.45

200nmh12-b3/seqidno.46

1600nmh12-fip/seqidno.47

1600nmh12-bip/seqidno.48

靶:iav-h12dsdna/seqidno.128

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例13应用evagreen验证对iav-h13的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh13-f3/seqidno.49

200nmh13-b3/seqidno.50

1600nmh13-fip/seqidno.51

1600nmh13-bip/seqidno.52

靶:iav-h13dsdna/seqidno.129

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例14应用evagreen验证对iav-h14的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh14-f3/seqidno.53

200nmh14-b3/seqidno.54

1600nmh14-fip/seqidno.55

1600nmh14-bip/seqidno.56

靶:iav-h14dsdna/seqidno.130

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例15应用evagreen验证对iav-h15的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh15-f3/seqidno.57

200nmh15-b3/seqidno.58

1600nmh15-fip/seqidno.59

1600nmh15-bip/seqidno.60

靶:iav-h15dsdna/seqidno.131

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例16应用evagreen验证对iav-h16的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh16-f3/seqidno.61

200nmh16-b3/seqidno.62

1600nmh16-fip/seqidno.63

1600nmh16-bip/seqidno.64

靶:iav-h16dsdna/seqidno.132

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例17应用evagreen验证对iav-h17的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh17-f3/seqidno.65

200nmh17-b3/seqidno.66

1600nmh17-fip/seqidno.67

1600nmh17-bip/seqidno.68

靶:iav-h17dsdna/seqidno.133

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例18应用evagreen验证对iav-h18的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmh18-f3/seqidno.69

200nmh18-b3/seqidno.70

1600nmh18-fip/seqidno.71

1600nmh18-bip/seqidno.72

靶:iav-h18dsdna/seqidno.134

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例19应用evagreen验证对iav-n1的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn1-f3/seqidno.73

200nmn1-b3/seqidno.74

1600nmn1-fip/seqidno.75

1600nmn1-bip/seqidno.76

靶:iav-n1dsdna/seqidno.135

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例20应用evagreen验证对iav-n2的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn2-f3/seqidno.77

200nmn2-b3/seqidno.78

1600nmn2-fip/seqidno.79

1600nmn2-bip/seqidno.80

靶:iav-n2dsdna/seqidno.136

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例21应用evagreen验证对iav-n3的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn3-f3/seqidno.81

200nmn3-b3/seqidno.82

1600nmn3-fip/seqidno.83

1600nmn3-bip/seqidno.84

靶:iav-n3dsdna/seqidno.137

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例22应用evagreen验证对iav-n4的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn4-f3/seqidno.85

200nmn4-b3/seqidno.86

1600nmn4-fip/seqidno.87

1600nmn4-bip/seqidno.88

靶:iav-n4dsdna/seqidno.138

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例23应用evagreen验证对iav-n5的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn5-f3/seqidno.89

200nmn5-b3/seqidno.90

1600nmn5-fip/seqidno.91

1600nmn5-bip/seqidno.92

靶:iav-n5dsdna/seqidno.139

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例24应用evagreen验证对iav-n6的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn6-f3/seqidno.93

200nmn6-b3/seqidno.94

1600nmn6-fip/seqidno.95

1600nmn6-bip/seqidno.96

靶:iav-n6dsdna/seqidno.140

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例25应用evagreen验证对iav-n7的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn7-f3/seqidno.97

200nmn7-b3/seqidno.98

1600nmn7-fip/seqidno.99

1600nmn7-bip/seqidno.100

靶:iav-n7dsdna/seqidno.141

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例26应用evagreen验证对iav-n8的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn8-f3/seqidno.101

200nmn8-b3/seqidno.102

1600nmn8-fip/seqidno.103

1600nmn8-bip/seqidno.104

靶:iav-n8dsdna/seqidno.142

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例27应用evagreen验证对iav-n9的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn9-f3/seqidno.105

200nmn9-b3/seqidno.106

1600nmn9-fip/seqidno.107

1600nmn9-bip/seqidno.108

靶:iav-n9dsdna/seqidno.143

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例28应用evagreen验证对iav-n10的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn10-f3/seqidno.109

200nmn10-b3/seqidno.110

1600nmn10-fip/seqidno.111

1600nmn10-bip/seqidno.112

靶:iav-n10dsdna/seqidno.144

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例29应用evagreen验证对iav-n11的扩增反应

evagreen同sybrgreeni类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。

反应溶液组合(25μl)，同实施例1；

引物：

200nmn11-f3/seqidno.113

200nmn11-b3/seqidno.114

1600nmn11-fip/seqidno.115

1600nmn11-bip/seqidno.116

靶:iav-n11dsdna/seqidno.145

同时设置无靶的对照组。

设置abisteponerealtimepcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图1所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可提前判断结果。

实施例30iav基因目标片段人造rna片段的可视化检测

在lamp反应体系中加入逆转录酶即可以实现对于rna的检测。因iav为烈性rna病毒，具有极强危害性，对于该病毒的研究必须在高等级生物安全实验室中进行，故对于该病毒检测技术及产品的研发一般采用无害的人造rna片段进行模拟。故本专利亦使用人造rna片段，利用promega公司提供的ribomaxtmlargescalernaproductionsystems进行体外转录以获得。而后应用所可视化试剂进行rna检测研究。

羟基萘酚蓝(hnb)是应用于lamp技术中可视化检测的指示剂。其原理为：当发生核酸体外扩增反应时会产生大量不溶副产物焦磷酸镁，从而导致镁离子减少，而hnb为镁离子指示剂故可监测有无扩增反应发生。当lamp未发生扩增反应时，体系中镁离子浓度高，反应液呈紫色；当lamp发生扩增反应时，体系中镁离子浓度低，反应液呈蓝色。

通过这些引物和可视化试剂进行iav病毒rna检测的反应溶液的组合在下面所示。

反应溶液组合(25μl)

20mmtris-hclph8.8

10mmkcl

10mm(nh4)2so4

14mmmgso4

0.1％tritonx-100

1m甜菜碱

1.25mmdntp

8ubstdna聚合酶(newenglandbiolabs)

5uamv反转录酶(newenglandbiolabs)

120μmhnb

以上为可视化检测的所共用的试剂，下述为针对各rna片段所使用的引物及靶序列：

1)iav-h1rna检测引物：

200nmh1-f3/seqidno.1

200nmh1-b3/seqidno.2

1600nmh1-fip/seqidno.3

1600nmh1-bip/seqidno.4

靶:iav-h1dsdna/seqidno.117

同时设置无靶的对照组。

2)iav-h2rna检测引物：

200nmh2-f3/seqidno.5

200nmh2-b3/seqidno.6

1600nmh2-fip/seqidno.7

1600nmh2-bip/seqidno.8

靶:iav-h2dsdna/seqidno.118

同时设置无靶的对照组。

3)iav-h3rna检测引物：

200nmh3-f3/seqidno.9

200nmh3-b3/seqidno.10

1600nmh3-fip/seqidno.11

1600nmh3-bip/seqidno.12

靶:iav-h3dsdna/seqidno.119

同时设置无靶的对照组。

4)iav-h4rna检测引物：

200nmh4-f3/seqidno.13

200nmh4-b3/seqidno.14

1600nmh4-fip/seqidno.15

1600nmh4-bip/seqidno.16

靶:iav-h4dsdna/seqidno.120

同时设置无靶的对照组。

5)iav-h5rna检测引物：

200nmh5-f3/seqidno.17

200nmh5-b3/seqidno.18

1600nmh5-fip/seqidno.18

1600nmh5-bip/seqidno.20

靶:iav-h5dsdna/seqidno.121

同时设置无靶的对照组。

6)iav-h6rna检测引物：

200nmh6-f3/seqidno.21

200nmh6-b3/seqidno.22

1600nmh6-fip/seqidno.23

1600nmh6-bip/seqidno.24

靶:iav-h6dsdna/seqidno.122

同时设置无靶的对照组。

7)iav-h7rna检测引物：

200nmh7-f3/seqidno.25

200nmh7-b3/seqidno.26

1600nmh7-fip/seqidno.27

1600nmh7-bip/seqidno.28

靶:iav-h7dsdna/seqidno.123

同时设置无靶的对照组。

8)iav-h8rna检测引物：

200nmh8-f3/seqidno.29

200nmh8-b3/seqidno.30

1600nmh8-fip/seqidno.31

1600nmh8-bip/seqidno.32

靶:iav-h8dsdna/seqidno.124

同时设置无靶的对照组。

9)iav-h9rna检测引物：

200nmh9-f3/seqidno.33

200nmh9-b3/seqidno.34

1600nmh9-fip/seqidno.35

1600nmh9-bip/seqidno.36

靶:iav-h9dsdna/seqidno.125

同时设置无靶的对照组。

10)iav-h10rna检测引物：

200nmh10-f3/seqidno.37

200nmh10-b3/seqidno.38

1600nmh10-fip/seqidno.39

1600nmh10-bip/seqidno.40

靶:iav-h10dsdna/seqidno.126

同时设置无靶的对照组。

11)iav-h11rna检测引物：

200nmh11-f3/seqidno.41

200nmh11-b3/seqidno.42

1600nmh11-fip/seqidno.43

1600nmh11-bip/seqidno.44

靶:iav-h11dsdna/seqidno.127

同时设置无靶的对照组。

12)iav-h12rna检测引物：

200nmh12-f3/seqidno.45

200nmh12-b3/seqidno.46

1600nmh12-fip/seqidno.47

1600nmh12-bip/seqidno.48

靶:iav-h12dsdna/seqidno.128

同时设置无靶的对照组。

13)iav-h13rna检测引物：

200nmh13-f3/seqidno.49

200nmh13-b3/seqidno.50

1600nmh13-fip/seqidno.51

1600nmh13-bip/seqidno.52

靶:iav-h13dsdna/seqidno.129

同时设置无靶的对照组。

14)iav-h14rna检测引物：

200nmh14-f3/seqidno.53

200nmh14-b3/seqidno.54

1600nmh14-fip/seqidno.55

1600nmh14-bip/seqidno.56

靶:iav-h14dsdna/seqidno.130

同时设置无靶的对照组。

15)iav-h15rna检测引物：

200nmh15-f3/seqidno.57

200nmh15-b3/seqidno.58

1600nmh15-fip/seqidno.59

1600nmh15-bip/seqidno.60

靶:iav-h15dsdna/seqidno.131

同时设置无靶的对照组。

16)iav-h16rna检测引物：

200nmh16-f3/seqidno.61

200nmh16-b3/seqidno.62

1600nmh16-fip/seqidno.63

1600nmh16-bip/seqidno.64

靶:iav-h16dsdna/seqidno.132

同时设置无靶的对照组。

17)iav-h17rna检测引物：

200nmh17-f3/seqidno.65

200nmh17-b3/seqidno.66

1600nmh17-fip/seqidno.67

1600nmh17-bip/seqidno.68

靶:iav-h17dsdna/seqidno.133

同时设置无靶的对照组。

18)iav-h18rna检测引物：

200nmh18-f3/seqidno.69

200nmh18-b3/seqidno.70

1600nmh18-fip/seqidno.71

1600nmh18-bip/seqidno.72

靶:iav-h18dsdna/seqidno.134

同时设置无靶的对照组。

19)iav-n1rna检测引物：

200nmn1-f3/seqidno.73

200nmn1-b3/seqidno.74

1600nmn1-fip/seqidno.75

1600nmn1-bip/seqidno.76

靶:iav-n1dsdna/seqidno.135

同时设置无靶的对照组。

20)iav-n2rna检测引物：

200nmn2-f3/seqidno.77

200nmn2-b3/seqidno.78

1600nmn2-fip/seqidno.79

1600nmn2-bip/seqidno.80

靶:iav-n2dsdna/seqidno.136

同时设置无靶的对照组。

21)iav-n3rna检测引物：

200nmn3-f3/seqidno.81

200nmn3-b3/seqidno.82

1600nmn3-fip/seqidno.83

1600nmn3-bip/seqidno.84

靶:iav-n3dsdna/seqidno.137

同时设置无靶的对照组。

22)iav-n4rna检测引物：

200nmn4-f3/seqidno.85

200nmn4-b3/seqidno.86

1600nmn4-fip/seqidno.87

1600nmn4-bip/seqidno.88

靶:iav-n4dsdna/seqidno.138

同时设置无靶的对照组。

23)iav-n5rna检测引物：

200nmn5-f3/seqidno.89

200nmn5-b3/seqidno.90

1600nmn5-fip/seqidno.91

1600nmn5-bip/seqidno.92

靶:iav-n5dsdna/seqidno.139

同时设置无靶的对照组。

24)iav-n6rna检测引物：

200nmn6-f3/seqidno.93

200nmn6-b3/seqidno.94

1600nmn6-fip/seqidno.95

1600nmn6-bip/seqidno.96靶:iav-n6dsdna/seqidno.140同时设置无靶的对照组。

25)iav-n7rna检测引物：

200nmn7-f3/seqidno.97

200nmn7-b3/seqidno.98

1600nmn7-fip/seqidno.99

1600nmn7-bip/seqidno.100靶:iav-n7dsdna/seqidno.141同时设置无靶的对照组。

26)iav-n8rna检测引物：

200nmn8-f3/seqidno.101

200nmn8-b3/seqidno.102

1600nmn8-fip/seqidno.103

1600nmn8-bip/seqidno.104靶:iav-n8dsdna/seqidno.142同时设置无靶的对照组。

27)iav-n9rna检测引物：

200nmn9-f3/seqidno.105

200nmn9-b3/seqidno.106

1600nmn9-fip/seqidno.107

1600nmn9-bip/seqidno.108

靶:iav-n9dsdna/seqidno.143

同时设置无靶的对照组。

28)iav-n10rna检测引物：

200nmn10-f3/seqidno.109

200nmn10-b3/seqidno.110

1600nmn10-fip/seqidno.111

d600nmn10-bip/seqidno.112靶:iav-n10dsdna/seqidno.144同时设置无靶的对照组。

29)iav-n11rna检测引物：

200nmn11-f3/seqidno.113

200nmn11-b3/seqidno.114

1600nmn11-fip/seqidno.115

1600nmn11-bip/seqidno.116

靶:iav-n11dsdna/seqidno.145

同时设置无靶的对照组。

结果判断：蓝色为阳性，紫色为阴性。结果在图7中显示，各反应管的标记数字分别对应样品如下：

1：iavh1rna检测的阳性结果。2：iavh1rna检测的阴性结果。3：iavh2rna检测的阳性结果。4：iavh2rna检测的阴性结果。5：iavh3rna检测的阳性结果。6：iavh3rna检测的阴性结果。7：iavh4rna检测的阳性结果。8：iavh4rna检测的阴性结果。9：iavh5rna检测的阳性结果。10：iavh5rna检测的阴性结果。11：iavh6rna检测的阳性结果。12：iavh6rna检测的阴性结果。13：iavh7rna检测的阳性结果。14：iavh7rna检测的阴性结果。15：iavh8rna检测的阳性结果。16：iavh8rna检测的阴性结果。17：iavh9rna检测的阳性结果。18：iavh9rna检测的阴性结果。19：iavh10rna检测的阳性结果。20：iavh10rna检测的阴性结果。21：iavh11rna检测的阳性结果。22：iavh11rna检测的阴性结果。23：iavh12rna检测的阳性结果。24：iavh12rna检测的阴性结果。25：iavh13rna检测的阳性结果。26：iavh13rna检测的阴性结果。27：iavh14rna检测的阳性结果。28：iavh14rna检测的阴性结果。29：iavh15rna检测的阳性结果。30：iavh15rna检测的阴性结果。31：iavh16rna检测的阳性结果。32：iavh16rna检测的阴性结果。33：iavh17rna检测的阳性结果。34：iavh17rna检测的阴性结果。35：iavh18rna检测的阳性结果。36：iavh18rna检测的阴性结果。37：iavn1rna检测的阳性结果。38：iavn1rna检测的阴性结果。39：iavn2rna检测的阳性结果。40：iavn1rna检测的阴性结果。41：iavn3rna检测的阳性结果。42：iavn3rna检测的阴性结果。43：iavn4rna检测的阳性结果。44：iavn4rna检测的阴性结果。45：iavn5rna检测的阳性结果。46：iavn5rna检测的阴性结果。47：iavn6rna检测的阳性结果。48：iavn6rna检测的阴性结果。49：iavn7rna检测的阳性结果。50：iavn7rna检测的阴性结果。51：iavn8rna检测的阳性结果。52：iavn8rna检测的阴性结果。53：iavn9rna检测的阳性结果。54：iavn9rna检测的阴性结果。55：iavn10rna检测的阳性结果。56：iavn10rna检测的阴性结果。57：iavn11rna检测的阳性结果。58：iavn11rna检测的阴性结果。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

序列表

<110>中国科学院过程工程研究所

<120>一种用于扩增甲型流感病毒的lamp引物组及试剂盒

<160>145

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<400>1

actattattggacactattagacc24

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<400>2

gtacattctgaaaaggaaggc21

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>artificial

<400>3

tgcgaaagcataccatggtgggagacactataacatttgaagc43

<210>4

<211>43

<212>dna

<213>artificial

<400>4

tggaattataacatcagatgctccagttcaaagccccatgagg43

<210>5

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<400>5

aatacgattgggcgagaa18

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>6

tcctattgggaaccgaatc19

<210>7

<211>46

<212>dna

<213>artificial

<400>7

tgcaaaggaccagcaattattattgaagacgttatagtcacgagag46

<210>8

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<400>8

cttgcccaaggggcattactgatctatagggtgttctgtct41

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>9

gcaaaagaggacctgctaa19

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<400>10

actctccctgatgcttga18

<210>11

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<400>11

cacgttcagcactgggtatgttcttcagtagactgaactgg41

<210>12

<211>47

<212>dna

<213>artificial

<400>12

gacaaactatacatctggggagtacacatacaggttggtttgttctt47

<210>13

<211>17

<212>dna

<213>artificial

<400>13

acccctgcgcaaaatgc17

<210>14

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>14

ttgttagggttccgcgtcc19

<210>15

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<400>15

agaagtaccacctgggagccaggtattggcggagacaggaca42

<210>16

<211>39

<212>dna

<213>artificial

<400>16

gaactggacccgaagcagcagtggcgccatcttcatgga39

<210>17

<211>18

<212>dna

<213>artificial

<400>17

ggcaaagtggaagaatgg18

<210>18

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<400>18

ggcatactagagtttatcgcc21

<210>19

<211>49

<212>dna

<213>artificial

<400>19

ttgtatgcatattctggagcaatgaagttcttctggacaattttaaagc49

<210>20

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<400>20

gtcaagaaaggggactcagcacattggagtttgacacttgg41

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<400>21

gtgatgctgtctgccaaacg20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<400>22

tcatccctgtccatcctcct20

<210>23

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<400>23

tggggcattctccaatccagaggttgctggagcactaaggac42

<210>24

<211>41

<212>dna

<213>artificial

<400>24

gcctaagactggcaactggtctcagctatggccccgaacaa41

<210>25

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>25

accagagattccatgacag19

<210>26

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>26

agtcgtcatcacacttgtg19

<210>27

<211>42

<212>dna

<213>artificial

<400>27

ccagatcaattgtgtgctggttcaagtgtggtcctataacgc42

<210>28

<211>43

<212>dna

<213>artificial

<400>28

atgaacaaactatacgaacgagtgagaagcaaccagtgccatc43

<210>29

<211>19

<212>dna

<213>artificial

<400>29

gtgttaccctggatctgtg19

<210>30

<211>20

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<213>artificial

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