本发明涉及植物基因工程技术领域，并且更具体地，涉及到一种提升植物干旱胁迫耐性的拟南芥基因及该基因的用途。
背景技术：
干旱已是世界性的问题，世界干旱、半干旱地区已占陆地面积的1/3以上，干旱对植物的影响在诸多自然逆境因素中占首位。旱灾造成的粮食损失要占全部自然灾害粮食损失的一半以上。在自然条件下，干旱胁迫不仅严重影响了作物生长发育和产量，而且限制了植物的分布。因此，解析植物耐受干旱胁迫的分子机制，培育高产、抗逆农作物新品种成了一个高度紧迫的重大问题。随着分子生物学技术的发展，基因工程已成为当今种质资源创新和改良的强有力的武器。
目前用于抗旱基因工程的基因主要包括以下几类。
第一，参与渗透保护物质(如脯氨酸、甘露醇、甜菜碱、海藻糖等)合成的基因。这些基因能够使植物在水分胁迫下能合成更多的渗透调节物质，以提高植物的渗透调节能力，从而增强植物的抗旱性。如在水稻中过量表达脯氨酸生物合成途径上的关键酶基因(p5cs，deltal-pyrroline-5-carboxylatesynthase)提高了转基因植株的抗旱性(zhu等，plantsci，1998，199：41-48)。
第二，与清除活性氧(ros，reactiveoxygenspecies)相关的基因。这类基因的表达增强植物对活性氧自由基的清除能力，使植物在水分胁迫下过量表达一些酶(如sod，pod，cat等)，以有效地排除有害的活性氧自由基，从而提高细胞耐脱水的能力。如拟南芥干旱响应nac转录因子ntl4，能够通过直接结合在ros合成酶基因的启动子区，在干旱诱导的叶片衰老过程中促进活性氧产量。与此相反，ros水平在缺乏ntl4基因的ntl4突变体中表现出降低，延缓叶片衰老，以及增强的抗旱性(lee等，plantjournal，2012，70：831-844)。
第三，编码干旱诱导蛋白的基因。这类蛋白主要可分为两类，(i)起间接保护作用的调节蛋白，主要包括g蛋白、钙调素、蛋白激酶、磷脂酶、转录因子蛋白等；(ii)功能蛋白，包括离子通道蛋白、lea蛋白(lateembryogenesisabundantprotein)、热激蛋白、水通道蛋白、渗透调节蛋白、代谢酶等。在干旱耐受过程中，这些蛋白可以直接在细胞内发挥重要的保护作用，提高植物对干旱的耐受性。例如lea基因的过度表达导致了转基因植株对干旱的耐受性增强，尽管其确切机制尚不清楚。lea蛋白也可作为分子伴侣保护分子对抗细胞损伤(umezawa等，currentopinioninbiotechnology，2006，17：113-122)。
第四，调控基因。这类基因包括与aba途径相关的基因，包括aba生物代谢相关基因(如nced和abaox)及aba信号传导途径相关的基因(如编码bzip类、myb类、zinc-finger类转录因子的基因)。例如，分离得到的erf/ap2类转录因子家族cbf/dreb1和dreb2能够与顺式作用元件dre/crt结合，过表达cbf/dreb1转基因植株对冷冻、干旱和盐胁迫的耐受性增加(liu等，plantcell，1998，10∶1391-1406)。激活形式的反式作用因子dreb2可以激活受胁迫诱导基因的表达而提高拟南芥的抗旱性(sakuma等，pnas，2006，103：18822-18827)。其它的内源aba调控的基因如rd22(abe等，plantcell，2003，15：63-78)、rd29b(fuiita等，plantcell，2005，17：3470-3488)、abf3或者areb2/abf4(kang等，2002，plantcell，14：343-357)等过量表达也能够提高转基因植物的抗渗透胁迫能力。模式植物拟南芥的hrd基因(hardy)其编码的蛋白是ap2/erflike转录因子，在拟南芥功能获得性突变体hrd-d中表现为增强的抗旱性和耐盐性，将该基因转化至农作物水稻中也表现出与抗旱性相一致的水分利用效率提高的表型(karaba等，pnas，2007，104：15270-15275)。
由于人们对植物抗旱的分子机制缺乏了解，抗旱分子育种还有很大的盲目性。而且植物抗旱作用通常是众多抗旱基因共同表达的结果，采用单基因策略提高植物的抗旱性在实际生产应用中效果不明显，如果改变一个基因的表达能够整体调控植物耐旱反应能力，那将是一个理想的选择。
早在1998年，colasanti等人发现了一个控制玉米开花的基因id1(indeterminate1)，其编码蛋白是含有四个锌指结构的转录因子。后续研究发现多个转录因子含有类似id1中锌指结构的功能域，将其命名为indeterminatedomain，这些转录因子也被命名为idd。idds是植物所特有一类转录因子，玉米、水稻和拟南芥分别含有21、15和16个idd基因。水稻osid1/ehd2/rid1的蛋白序列与玉米id1有高度的同源性，也是控制水稻成花的决定因子。osidd14/lpa1(looseplantarchitecture1)则参与水稻茎的向重性和株型的调控。与玉米和水稻中少有的几个idd的功能被解析不同，近半拟南芥的idd基因已被研究。idd8/nuc(nutcracker)通过调节蔗糖代谢而调控开花，idd3/mag(magpie)、idd8/nuc和idd10/jkd(jackdaw)调控根的发育，而idd1/eny(enhydrous)参与调控种子的成熟和萌发。
优良抗旱基因的挖掘对于培育能够进行田间生产应用的抗旱农作物至关重要。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种提升植物干旱胁迫耐性的拟南芥基因、超表达载体及拟南芥基因的编码蛋白。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明所提供的提升植物干旱胁迫耐性的基因，名称为idd14，来源于拟南芥，编码如下蛋白质：序列表中的seqidno：1所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明的提升植物干旱胁迫耐性的拟南芥idd14基因的核酸序列可以是该基因的cds序列或者是与该序列具有90％以上一致性且编码相同的功能蛋白的dna序列。序列表中seqidno：2所示的是idd14基因的序列。
本发明还提供包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。进一步地，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列，可以是花椰菜花叶病毒35s启动子。
本发明还提供了一种提升植物干旱胁迫耐性的方法。
表达idd14基因可以提升拟南芥等植物的干旱胁迫耐性，该方法是将所述idd14基因导入植物细胞、组织或器官，将导入后的植物细胞、组织或器官培养成植株，使所述idd14基因在植物中表达，得到干旱胁迫耐性提升的植物。
进一步地，该idd14基因可以是该基因的cds序列或者是与该序列具有90％以上一致性且编码相同的功能蛋白的dna序列。与该序列具有90％以上一致性且编码相同的功能蛋白的dna序列是将该基因的cds序列用已知的方法进行分离、修饰和/或设计得到的。本领域技术人员应该理解的是，基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。
本发明的idd14基因可以通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。该植物表达载体是pvipmyc(cui等，plosgenetics，2013，9：e1003759)，pvipmyc是在国际常用的植物遗传转化载体，是在pvip96基础上改造而成的。使用本发明的idd14基因或其同源序列构件植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种组成型或诱导型启动子。组成型启动子可为花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、水稻actin启动子或玉米ubiquitin启动子等；诱导型启动子可为受低温、干旱、aba、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可以单独或与其它的植物启动子复合使用。
携带有上述idd14基因或其同源序列的植物表达载体可以通过农杆菌介导、ti质粒、植物病毒载体、微注射、基因枪等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合使用转化植物细胞、组织或器官，并将导入后的植物细胞、组织或器官培养成植株；本发明中涉及的植物组织或器官包含植物的种子、花蕾、果荚、叶片、花茎等。植物可以是玉米、水稻、小麦或拟南芥。
本发明将idd14基因的核酸序列在拟南芥中过量表达，结果表明在2个独立的转基因拟南芥植株中，idd14蛋白质的水平都明显高于野生型。
本发明通过拟南芥激活突变体库的筛选，得到了一个抗旱性增强的突变体idd14-1d，该突变体的抗旱表型是由于一个编码idd转录因子的基因idd14超表达所致。因此，在拟南芥中超表达idd14基因，对于提高拟南芥干旱胁迫耐性具有重要意义，这为培育高抗旱性新品种提供了新的思路。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种提高拟南芥干旱胁迫耐性的基因idd14的应用。本发明在拟南芥生态型哥伦比亚中，超表达idd14基因后，发现突变体植株的干旱胁迫耐性明显提高。在同样条件下失水和复水处理后，发现100％突变体植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株仅2％左右恢复正常生长。
(2)本发明首次在拟南芥中过量表达拟南芥idd14基因。为培育高抗旱拟南芥品种提供了新的思路，也为其它作物利用同源基因技术提高抗旱性提供了理论支持。
(3)本发明中应用的idd14基因可以为玉米、水稻、小麦等粮食作物以及其它作物抗旱性研究提供支持。
附图说明
图1a和图1b为本发明的idd14-1d植株和野生型植株的干旱胁迫耐性的比较图；
图2a和图2b为idd14-1d植株和野生型植株的叶片的失水速率的比较图；
图3为idd14-1d植株和野生型植株的气孔密度比较图；
图4a和图4b为超表达idd14基因的转基因植株和野生型植株的干旱胁迫耐性比较图；
图5为用westernblot检测t3代转基因阳性植株中iddl4蛋白质的表达水平结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆idd14基因以及验证功能中所用的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其使用不同的用途和条件。
实施例1：筛选超表达idd14基因植株
本发明所用突变体idd14-1d是从含有激活标签的拟南芥t-dna突变体库(cui等，plosgenetics，2013，9：e1003759)中筛选获得的叶发育异常的突变体，具有明显的叶下卷表型。通过前期遗传分析表明，idd14-1d是一个单t-dna插入的显性突变体，突变体idd14-1d的表型是由idd14的超表达引起的。
实施例2：idd转录因子亚家族正向调控拟南芥干旱胁迫耐受反应
应用干旱处理实验、离体叶片失水速率测定、叶片气孔密度比较分析超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株以及对照野生型植株对干旱胁迫的耐受反应。
(一)超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株具有较强的干旱胁迫耐性
称取一定量的idd14-1d突变体植株和野生型拟南芥植株的种子，消毒后，4℃低温2～3天，将种子播在ms培养基上连续光照培养7天，移苗。将蛭石∶营养土按1∶1混合，称取相同重量营养土(约70～85克)于底部平整的小盆中，底部浇水使土壤完全润湿后，每小盆种植9棵苗，盖膜，每盘12个小盆。生长室培养条件为：21℃(光)/18℃(暗)，光周期：12h(光)/12h(暗)，光照强度为80～120μmol·m-2·s-1，相对湿度50％左右。3天后揭膜，继续生长7天，选取生长一致的小盆进行干旱处理，将不同株系的小盆随机放置，经常变换小盆位置，减少位置效应。相同实验重复3次以上，结果表明，停止浇水20天后，野生型拟南芥植株比超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株更早出现萎蔫现象，至所有植株均出现萎蔫现象后，加水恢复3天后统计结果显示，百分之百的超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株仅2％左右恢复正常生长(如图1a-1b所示，其中图1a为wt(野生型拟南芥植株)和idd14-1d(超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株)对照、干旱处理和复水表型。图1b为wt和idd14-1d复水后的存活率，**代表各遗传材料与wt相比存在极显著性差异(p＜0.01))。
(二)超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株叶片的失水速率降低
离体叶片失水实验具体方法如下：idd14-1d突变体植株和野生型拟南芥植株的种子经消毒后低温3天，播在1/2ms培养基上，连续光照培养7天后，移入土壤中，在21℃(光)/18℃(暗)，12h(光)/12h(暗)生长室中生长约四周。在未开花前，将地上部剪去立即放入培养皿中称重，放在温度22±1℃条件下进行叶片失水实验，每间隔一定时间进行称重，每个株系重复4次，以失去最初鲜重的百分比计算叶片失水速率。如图2a-2b所示(图2a表示wt和idd14-1d离体叶片失水表型，bar＝1cm；图2b表示wt和idd14-1d离体叶片失水率。*代表各遗传材料与wt相比存在显著性差异(p＜0.05))，结果表明超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株离体叶片的失水速率显著低于野生型植株(p＜0.05)。
(三)超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株的气孔密度降低
分别剪取5～6周idd14-1d突变体和野生型拟南芥植株的相同部位完全展开的莲座叶片(在12h(光)/12h(暗)下生长)，将其置于缓冲液中。每个处理取3片叶片做平行实验，分别撕下表皮条，刷去叶肉细胞，在10×20倍leica光学显微镜下观察。每个表皮随机取3到5个视野，记录气孔数目。每个处理重复4～6次，统计其气孔数目平均值和平行实验中的误差。如图3所示(其中idd14-1d表示超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株。**代表各遗传材料与wt(野生型拟南芥植株)相比存在极显著性差异(p＜0.01))，结果表明超表达idd14基因的idd14-1d突变体植株叶片的气孔密度低于野生型植株，并且这种差异极显著(p＜0.01)。
保卫细胞气孔观察缓冲液：
500mmkcl(10×)：3.7275g溶至100mlh2o中。
5.0mmcacl2(50×)：0.0555g溶至100mlh2o中。
100mmmes/koh(10×)：1.952g溶至100ml双蒸水中，用1.0mkoh调ph至6.1。
1.0mkoh：5.61g溶至100ml双蒸水中。
实施例3：分离克隆用于构建idd14基因植物表达载体的dna片段
采用trizol试剂(购买自invitrogen公司)从拟南芥的叶片中提取总rna。具体步骤如下：预冷离心机，取50～100mg样品加入液氮充分研磨，加入1mltrizol溶液，室温下静置5min；加入200μl氯仿，剧烈震荡15s，室温下静置3min；4℃，12,000g离心15min；吸取上清至新的1.5ml离心管(rnase-free，无核糖核酸酶)(购买自axygen公司)中，加入1倍体积的异丙醇，混匀后，室温下静置10min；4℃，12,000g离心10min；倒掉上清，加入1ml70％乙醇溶液，将沉淀弹起；4℃，7,500g离心5min；倒掉上清，短时离心后吸去剩余乙醇；室温下开口放置10min后，加入50μlrnase-free的水并进行充分溶解，利用紫外分光光度计测定rna的浓度。
利用反转录酶(购买自invitrogen公司)将其反转录成cdna，具体步骤如下：依次加入2μg总rna、1μl10×消化缓冲液、1μldnasei(脱氧核糖核酸酶i)(rnase-free)和depc水(用焦碳酸二乙酯处理过并经高温高压消毒的miliq纯水)至10μl制备成dna消化反应液，置于37℃消化半小时，加入1μl25mmedta，65℃失活处理10min；向消化产物中加入1μl50mmoligo(dt)18和1μl10mmdntp(deoxy-ribonucleosidetriphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸)，混匀后置于65℃变性5min，反应结束后迅速置于冰浴中冷却至少1min。然后依次加入4μl5倍浓度第一链缓冲液、1μl0.1mdtt、0.4μlrnase(核糖核酸酶)抑制剂和0.6μl反转录酶(200u/μl)，混匀后50℃下孵育1h。然后70℃水浴15分钟使酶失活，终止反应，这样就合成了第一链cdna，以第一链cdna为模板扩增目的基因。
用带有酶切位点的上游引物idd14f(5’-gggcccccatgcatagaagacgacataaag-3’，序列特异引物外加apai位点和两个保护碱基，seqidno：3)和下游引物idd14r(5’-gagctcctgaagatgctctatcactcg-3’，序列特异引物外加xhoi位点和一个保护碱基，seqidno：4)。利用高保真phusiondna聚合酶(购买自thermo公司)进行扩增目的片段，pcr反应条件是98℃预变性30秒；98℃10秒，51℃30秒，72℃30秒，30个循环；72℃10分钟。琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，利用dna凝胶回收试剂盒(购买自vigorous公司)回收相应的目的条带；连接测序载体
实施例4：idd14基因35s超表达载体的构建和遗传转化
为了能更好地分析idd14基因的功能，申请人通过35s超表达技术使idd14基因在拟南芥中的表达水平升高。根据转基因植株的表型和生理特征研究该基因的功能。35s超表达idd14基因植物表达载体的构建方法如下：使用花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子；首先将实施例3中得到的阳性克隆peasy-idd14cdna用apai和xhoi双酶切，回收插入片段；同样，用同样的方法酶切pvipmyc的植物表达载体，回收载体片段。用回收的插入片段和载体片段做连接反应，转化大肠杆菌dh5α。通过酶切筛选阳性克隆，获得植物表达载体，命名为pvipmyc-idd14。pvipmyc是在国际常用的植物遗传转化载体，是在pvip96基础上改造而成的。将pvipmyc-idd14转化至eha105宿主菌(eha105宿主菌为农杆菌的一种)。
通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化将其导入到拟南芥哥伦比亚型中，转化共获得30株独立的转基因拟南芥植株。具体步骤：将抽薹开花的植物上已开的花和角果剪掉，保留未开放的花蕾；将要转化植物的农杆菌接种到含有相应抗生素的lb(luria-bertani)液体培养基中，28℃220rpm过夜培养至od600约为1.8；室温6,000rpm离心10min收集菌体；倒掉上清，加入等体积浸染液(5.0％蔗糖溶液+0.025％(v/v)silwet-l77)重悬菌体；重悬好的菌液放入培养皿中，将拟南芥的花茎浸泡在浸染液中，充分浸泡；转化完毕的植株浇水并用塑料袋罩住保湿，约24h后去掉塑料袋正常培养；转化3周后的材料将慢慢成熟，收取转基因材料种子，在含相应载体抗性的1/2ms培养基上筛选获得t1代转基因阳性苗，t1代材料进一步自交，通过t2代抗性分离比可以确定是否为单拷贝插入，在t3代则获取纯合的转基因株系。
如图4a-4b所示，为上述idd14基因转基因植株和野生型植株的干旱胁迫耐性比较图。其中35s-idd14表示超表达idd14基因的转基因植株。图4a为wt和35s-idd14干旱处理和复水表型，12-1和3-2代表不同阳性转基因株系，bar＝1cm。图4b为wt和35s-idd14不同阳性转基因株系复水后的存活率，**代表各遗传材料与wt相比存在极显著性差异(p＜0.01)。选取生长一致的转基因植株和野生型植株进行干旱处理，将不同株系的小盆随机放置，经常变换小盆位置，减少位置效应。相同实验重复3次以上，结果表明，停止浇水20天后，野生型植株比转基因植株更早出现萎蔫现象，至所有植株均出现萎蔫现象后，加水恢复3天后统计结果显示，图4b示出了35s-idd14植株的恢复率达到100％，即百分之百的超表达idd14基因的转基因植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株仅2％左右恢复正常生长。
基因idd14连入pvipmyc载体的序列：
idd14apaif5′-gggcccccatgcatagaagacgacataaag-3′
idd14xhoir5′-gagctcctgaagatgctctatcactcg-3′
tm52.1℃/50.6℃pcr引物长度：999bp
实施例5：检测转基因植株和野生型拟南芥的idd14蛋白质水平
以拟南芥哥伦比亚野生型和由实施例4得到的2个独立的t3代转基因拟南芥植株为材料，提取叶片的可溶性蛋白质，利用westernblot检测拟南芥叶片中idd14蛋白质水平。具体方法如下：从上述材料收集2g叶片，在液氮中充分研磨成粉末，加入适量蛋白质提取缓冲液(0.5mtris-mes，ph＝8.0，0.5mmedta和蛋白酶抑制剂混合物)，混匀，在冰上放置30分钟。然后12000g4℃离心20分钟，上清用滤布过滤后零下80℃冻存备用。利用10％sds-page进行蛋白质电泳。电泳结束后，通过印迹法转移到pvdf膜(millipore，billerica，ma)。然后通过检测与idd14蛋白质发生融合的myc标签蛋白质水平，来反映idd14蛋白质的表达。如图5所示(其中35s-idd14表示转idd14基因的植株；12-1和3-2代表不同阳性转基因株系)，在2个独立的转基因拟南芥植株(12-1和3-2)中，idd14蛋白质的水平都明显高于拟南芥哥伦比亚野生型植株。
本发明所用突变体idd14-1d是从含有激活标签的拟南芥t-dna突变体库中筛选获得的叶发育异常的突变体，具有明显的叶下卷表型。通过前期遗传分析表明，idd14-1d是一个单t-dna插入的显性突变体，它的表型是由idd14的超表达引起的。在突变体的t3代植株中发现，拟南芥植株的干旱胁迫耐性明显高于野生型植株：在同样条件下失水和复水处理后，发现100％的超表达idd14基因植株能够恢复正常生长，而对应的野生型植株仅仅2％左右恢复正常生长。因此，在拟南芥中超表达idd14基因，对于提高拟南芥干旱胁迫耐性具有重要意义，这为玉米、水稻、小麦等粮食作物以及其它作物抗旱性研究提供支持。
本发明所使用的所有试剂、操作步骤与方法均是本领域的常用试剂、操作步骤与方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
序列表
<110>齐鲁师范学院
<120>拟南芥idd14基因在提升植物干旱胁迫耐性中的应用
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>333
<212>prt
<213>拟南芥
<400>1
methisargargarghislysvalprotrplysleuleulysargglu
151015
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202530
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<210>2
<211>1002
<212>dna
<213>拟南芥
<400>2
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<210>3
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
gggcccccatgcatagaagacgacataaag30
<210>4
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gagctcctgaagatgctctatcactcg27