本发明涉及新型噻吩并嘧啶衍生物及其药学上可接受的前药、盐或溶剂化物，属于医药领域。
背景技术：
细胞凋亡或程序性细胞死亡是一个生理过程，对胚胎发育、维护组织平衡和肿瘤的形成和发展至关重要。凋亡性细胞死亡的形态学变化类型包括如核浓缩，dna片段化和生化现象，如半胱天冬酶引起的细胞结构的关键部件损伤的激活，从而诱导其损坏和死亡。调控细胞凋亡的过程是复杂的，涉及激活或抑制多种细胞内信号通路。细胞凋亡的放松管制涉及某些病理。细胞凋亡增加与神经退行性疾病如帕金森氏病，阿尔茨海默氏病和缺血有关。相反，细胞凋亡执行的缺陷在癌症的发展和化疗，自身免疫性疾病，炎症性疾病和病毒感染中起着重要的作用。因此，细胞凋亡的缺失是癌症的表型特征之一。b淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)家族的抗凋亡蛋白与多种疾病相关。bcl-2家族蛋白参与在许多类型的癌症，如在结肠癌、乳腺癌、小细胞肺癌，非小细胞肺癌、膀胱癌、卵巢癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、急性髓系白血病，胰腺癌中作用都有过记载。肿瘤的发生、化疗耐药性及在受肿瘤影响都与bcl-2家族抗凋亡蛋白的过表达有关。值得注意的是，髓细胞白血病基因-1(myeloidcellleukemin-1，mcl-1)是抗凋亡的bcl-2家族成员之一，在多种类型的癌症中过度表达(beroukhimr.等人，自然2010，899-905)。mcl-1对很多癌症都很重要，因为它是一种促存活蛋白，使癌细胞能够逃避细胞凋亡的过程。因此，mcl-1的抑制剂就具有抗癌作用。kotschy,andras(wo2015/097123)披露了噻吩并嘧啶衍生物抑制mcl-1蛋白的抗凋亡活性。kotschy又披露了其代表性化合物ii在多种肿瘤模型中抑制肿瘤生长的显著活性(nature2016,538,477-482)。
为了使这类化合物治疗癌症疾病的疗效最大化，需要对已知化合物进行修饰，研发新的药物。
技术实现要素：
为研发新的mcl-1或bcl-2抑制剂，本发明目的在于提供一类新的噻吩并嘧啶衍生物；另一目的在于提供其制备方法和应用。
为实现本发明目的，本发明研发了一系列新型噻吩并嘧啶衍生物以及它们在治疗癌症中的应用。与kotschy披露的化合物相比，这些化合物抑制mcl-1的活性更强，更加稳定。本发明披露的化合物具有促凋亡特性，使其能够在涉及细胞凋亡缺陷的病症中使用，例如，用于治疗多种癌症以及免疫和自体免疫疾病。
本发明所述新型噻吩并嘧啶衍生物具有通式(ⅰ)所示结构，包括其药学上可接受的前药、盐或者溶剂化物，包括其单一立体异构体或消旋体混合物：
r独立地选自氢(h)或氘(d)；r1和r2独立地选自h,d,f，cl,i,cn,n3；r和r1或r2选择h时，另一个r2或r1不能选择h；r3,r4和r5独立地选自任取代的烷基，环烷基，杂环基，芳环基(ar)和杂芳环基。r3,r4和r5独立地优选c1-5烷基，c3-6环烷基，含氮或氧的饱和或不饱和五元或六元杂环，苯基。
优选具有通式(iii)所示结构的化合物，包括其药学上可接受的前药、盐或者溶剂化物，包括其单一立体异构体或消旋体混合物：
其中：
r独立地选自氢(h)或氘(d)，r1和r2独立地选自h,d,f，cl,i,cn,n3；r和r1或r2选择h时，另一个r2或r1不选择h。
更优选如下iv-xi所示结构化合物，包括其药学上可接受的前药、盐或者溶剂化物，包括其单一立体异构体或消旋体混合物：
与化合物式(i)形成盐所用的酸包括但不限于：对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、酒石氢酸、抗坏血酸、马来酸、苯磺酸、富马酸、葡萄糖酸、葡萄糖醒酸、甲酸、谷氨酸、甲磺酸、乙磺酸、乳酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、柠檬酸、苯甲酸、苹果酸、乙酸和相关的无机与有机酸；优选甲磺酸。
本发明还包括所述化合物或者其药学上可接受的前药、盐或者溶剂化物与药学上可接受的载体和稀释剂组成的组合物。
进一步，本发明还包括所述化合物或者其药学上可接受的前药、盐或者溶剂化物和其它抗癌药一起与药学上可接受的载体和稀释剂组成的组合物。
本发明所述化合物或者其药学上可接受的前药、盐或其组合物应用在制备治疗肿瘤的药物中。这些肿瘤包括急性骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤、黑色素瘤、肺癌和乳腺癌、乳腺癌、脑瘤、膜腺癌、肝癌、结肠直肠癌、甲状腺髓样癌、成神经胶质瘤、成神经细胞瘤、肾脏肿瘤卵巢癌或前列腺癌等。
本发明化合物的制备通过下列方法实现：
(1)化合物a-1与a-2反应生成中间体a-3
其中：ar是任取代的芳香环或杂环。
(2)化合物a-3与中间体a-4反应生成a-5
其中：ar与上述相同；r6和r7是任取代的烷基，芳香基或杂环或杂芳香基。
(3)化合物a-5与a-6反应生成中间体a-7
其中：ar与上述相同；r6和r7与上述相同；r8是任取代的烷基，芳香基或杂环或杂芳香基。
(3)化合物a-7用碱包括lioh，koh，naoh等水解得到产物a-8
其中：ar，r6，r7，r8与上述相同。
本发明优点在于：与化合物式(ii)相比，本发明化合物显示出有利的物理性质，更强的抑制mcl-1的活性和更加稳定的特征。
具体实施方式
为对本发明进行更好地说明，举实施例如下：
实施例1.制备化合物(4)和(5)：
a.化合物3：在氮气下，将化合物1(1.26g,10mmol)的thf(20ml)在冰水浴中冷却到0℃。加入nah(60％，0.6g,15mmol),反应液搅拌15min。将试剂2(2.44g,15mmol)的thf(5ml)通过注射器加入。反应混合物搅拌3h。加入ch2cl2(50ml)，混合物用盐水洗，有机相用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物与甲苯(20ml)混合，蒸干，得到粗产物3.不用纯化，直接用于下步反应。esmsm/z209[m+h]+。
b.化合物4：在氮气下，将化合物3(1.04g,5mmol)溶于thf(20ml),所得溶液在干冰-丙酮浴中冷却到-78℃。将liald4(190mg,5mmol)的thf(10ml)溶液通过注射器加入反应液。反应温度控制在-50℃以下。反应液在-50℃搅拌30min。加入etoac(50ml),混合物用盐水洗后，有机相用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物用硅胶柱层析纯化(0-50％etoac/hexance)得到产物4。esmsm/z183[m+h]+。
c.化合物5：按照制备化合物4的方法，用lialh4还原化合物3得到产物5。esmsm/z181[m+h]+。
实施例2.制备化合物(7)和(8)：
a.化合物7：将化合物4(182mg,1.0mmol)、2-羟基苯甲醛6(122mg,1.0mmol)和pph3(314mg,1.2mmol)溶于干甲苯(10ml)。然后加入偶氮二甲酰二哌啶(addp，302mg,1.2mmol)。反应混合物在50℃搅拌24h。etoac(50ml)加入。化合物用盐水洗后用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(0-50％etoac/hexance)得到产物7。esmsm/z287[m+h]+。化合物7可以保存在-20℃备用。
b.化合物8：按照制备化合物7的方法，2-羟基苯甲醛与化合物5缩合得到产物8。esmsm/z285[m+h]+。
c.中间体7或8也可以用下列方法制备：将化合物4或者5(1.0mmol)、2-羟基苯甲酸甲酯(152mg,1.0mmol)和pph3(314mg,1.2mmol)溶于干甲苯(10ml)。然后加入偶氮二甲酰二哌啶(addp，302mg,1.2mmol)。反应混合物在50℃搅拌24h。etoac(50ml)加入。化合物用盐水洗后用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(0-50％etoac/hexance)分别得到相应的甲酯中间体。甲酯经dibal还原分别得到化合物7或8。
实施例3.制备化合物(9)和(10)(chinesejournalofsyntheticchemistry2010,18,215-218)：
a.化合物9：在氮气的保护下冰水浴冷却，在反应瓶里加入化合物7(2.86g,10.0mmg)和氯乙酸乙酯(1.84g,15.0mmol)的ch2cl2(20ml)溶液。搅拌下滴加新鲜制备的1m/l的甲醇钠(30ml,30.0mmol)。滴完后，反应液在20℃搅拌24h。过滤，滤液减压蒸干，剩余物经硅胶柱层析纯化(0-50％etoac/hexance)得到产物9。esmsm/z359[m+h]+。
b.化合物10：按照制备化合物9的方法，化合物8与氯乙酸乙酯反应生成产物10。esmsm/z357[m+h]+。
实施例4.制备化合物rac-11、(2s,3r)-12和(2r,3s)-13
a.化合物rac-11：化合物9(718mg,2.0mmol)溶于甲醇(10ml),加入5％pd/c(100mg),混合物在氘气(d2)下，搅拌2-5h(监测反应进程，减少付反应)。反应完后过滤，蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(0-100％etoac/hexance)得到产物rac-11。esmsm/z362[m+h]+。
b.化合物(2s,3r)-12和(2r,3s)-13：rac-11经手性柱分离分别得到(2s,3r)-12和(2r,3s)-13。
实施例5.制备化合物rac-14、(2s,3r)-15和(2r,3s)-16：
a.化合物rac-14：化合物10通过与制备产物rac-11相同的方法氘代得到产物rac-14。esmsm/z360[m+h]+。
b.化合物(2s,3r)-15和(2r,3s)-16：rac-14经手性柱分离分别得到(2s,3r)-15和(2r,3s)-16。
实施例6.制备化合物rac-17、(2s)-18和(2r)-19(org.lett.2010,12,2936-2939)：
a.化合物rac-17：化合物10通过与制备产物rac-11相同的方法催化氢化得到产物rac-17。esmsm/z359[m+h]+。
b.化合物(2s)-18和(2r)-19：rac-17经手性柱分离分别得到(2s)-18和(2r)-19。
实施例7.制备化合物rac-20、(2s)-21和(2r)-22：
a.化合物rac-20：化合物9通过与制备产物rac-11相同的方法催化氢化得到产物rac-20。esmsm/z361[m+h]+。
b.化合物(2s)-21和(2r)-22：rac-20经手性柱分离分别得到(2s)-21和(2r)-22。
实施例8.制备化合物rac-23、(2r,3r)-24和(2s,3s)-25(org.lett.2010,12,2936-2939)：
a.化合物rac-23：化合物9(718mg,2.0mmol)溶于ch2cl2(10ml)。在0℃加入bf3.oet2(85ul,0.7mmol)。反应液在-20℃搅拌30min，水洗，na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化(0-10％meoh/ch2cl2)得到产物rac-23。esmsm/z379[m+h]+。
b.化合物(2r,3r)-24和(2s,3s)-25：rac-23经手性柱分离分别得到(2r,3r)-24和(2s,3s)-25。
实施例9.制备化合物rac-26、(2s,3r)-27和(2r,3s)-28(org.lett.2010,12,2936-2939)：
a.化合物rac-26：化合物10通过与制备产物rac-23相同的方法氟化得到rac-26。esmsm/z377[m+h]+。
b.化合物(2r,3r)-27和(2s,3s)-28：rac-26经手性柱分离分别得到(2r,3r)-27和(2s,3s)-28。
c.用cis-或trans-3-[(2-甲氧基)苯基]-2,3-丙烯醇的不对称环氧化，再氧化，开环，可以得到2-羟基-3-氟-3-苯基的4个不同的光学异构体。
实施例10.制备化合物31(tetrahedron2004，60，7731-7742)：
a.在氮气的保护下，将化合物29(388mg,2mmol)溶于thf(20ml)。在0℃下加入dast或deoxo-fluor(5mmol),反应液在40℃搅拌24h。etoac(50ml)加入。混合物用盐水洗后经na2so4干燥。蒸去溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-30％etoac/hexane)纯化得到30。
b.在氮气的保护下，将化合物30(216mg,1.0mmol)溶于ch2cl2(10ml)。在-20℃通过注射器加入bbr3(1.2mmol)的ch2cl2(2ml),反应液在-20℃搅拌1h。ch2cl2(20ml)加入，盐水洗后经na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-50％etoac/hexane)纯化得到31。esmsm/z203[m+h]+。
二氟化物也可以由下列方法制备(tetrahedron2004,60,7731-7742)：
实施例11.制备化合物32和33：
a.化合物32：将化合物4(182mg,1.0mmol)、化合物31(202mg,1.0mmol)和pph3(314mg,1.2mmol)溶于干甲苯(10ml)。然后加入dead(208mg,1.2mmol)。反应混合物在50℃搅拌24h。etoac(50ml)加入。化合物用盐水洗后用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-50％etoac/hexance)纯化得到产物32。esmsm/z367[m+h]+。
b.化合物33：按照制备化合物32的方法，化合物31与5缩合得到产物33。esmsm/z365[m+h]+。
实施例12.制备化合物rac-36：
a.化合物34：在氮气的保护下，在-78℃，用注射器将dibal(1.2ml,1m/thf,1.2mmol)加入化合物32(366mg,1.0mmol)的thf溶液中。反应液在-78℃搅拌1h。etoac(50ml)加入。混合物用盐水洗后经na2so4干燥，蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-50％etoac/hexane)纯化得到化合物34。
b.化合物35：将化合物34(336mg,1mmol)的thf(3ml)溶液加入焦亚硫酸钠(190mg,1mmol)的水(10ml)溶液。反应混合物在室温强烈搅拌3h。加入nacn(98mg,2mmol)的水(2ml)溶液。反应混合物再搅拌1h。反应液用etoac(100ml)萃取，有机相用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-50％etoac/hexane)纯化得到化合物35。esmsm/z364[m+h]+。
c.化合物rac-36：将化合物35(364mg,1mmol)溶于etoh(1ml)。慢慢通入hcl气泡10min。4h以后，加入水(5ml)，搅拌30min。etoac(100ml)萃取，有机相用na2so4干燥。蒸去有机溶剂，剩余物经硅胶柱层析(0-80％etoac/hexane)纯化得到化合物rac-36。esmsm/z411[m+h]+。
实施例13.制备化合物(2s)-37和(2r)-38：
化合物(2s)-37和(2r)-38：rac-36经手性柱分离分别得到(2s)-37和(2r)-38。
实施例14.制备化合物rac-41：
化合物rac-41：用制备化合物36的方法，以化合物33为原料得到化合物rac-41。esmsm/z409[m+h]+。
实施例15.制备化合物(2s)-42和(2r)-43：
化合物(2s)-42和(2r)-43：rac-41经手性柱分离分别得到(2s)-42和(2r)-43。
实施例16.制备化合物46：
a.化合物44和试剂45都根据wo2015/097123披露的方法制备。
b.化合物44(3.75g,10.0mmol)，试剂45(8.48g,40mmol)，csco3(6.52g,20.0mmol)，pd(oac)2(112mg,0.5mmol)，tbux-phos(477mg,1mmol)加入到thf(33ml)和水(13ml)。反应混合物在70℃搅拌20h。thf蒸除。过滤收集固体粗产物，经硅胶柱层析(0-80％etoac/hexane)纯化得到化合物46。esmsm/z332[m+h]+。
实施例17.制备化合物47：
将化合物46(331mg,1mmol)，化合物17(411,mg,1.1mmol)和csco3(579mg,3mmol)在t-buoh(10ml)在70℃搅拌24h。蒸去溶剂，加入水(10ml)，用1nhcl调ph到8。用ch2cl2萃取，有机相用na2so4干燥，蒸去溶剂，剩余物经硅胶柱层析纯化得化合物(2s)-47。esmsm/z669[m+h]+。
用同样方法，制得下列中间体48-68：
实施例18.制备化合物69：
a.试剂69根据wo2015/097123披露的方法制备。
b.化合物47(66.9mg,0.1mmol)，试剂69(158mg,0.40mmol)，csco3(65mg,0.20.mmol)，pd(oac)2(30mg)，tbux-phos(47.7mg,0.1mmol)加入到thf(3ml)和水(1.5ml)。反应混合物在70℃搅拌20h。thf蒸除。过滤收集固体粗产物，hplc纯化得到化合物70。esmsm/z857[m+h]+。
用同样方法，制得下列中间体71-91：
实施例19.制备化合物ii：
化合物70(86mg,0.1mmol)和10eq.liohxh2o溶于h2o:dioxane(10ml/mmol)。反应混合物室温搅拌24h。混合物然后用1mhcl水溶液酸化后，用etoac萃取，有机相用na2so4干燥，蒸去有机溶剂，粗产物用hplc(用25mm的nh4hco3水溶液和mecn为流动相)得到产物ii。esmsm/z829[m+h]+。
用同样方法，制得下列中间体iv-x和92-105：
实施例20.生物试验
药理作用研究
一.采用荧光偏振技术测定抑制mcl-1的活性
通过荧光偏振(fp)方法测定各化合物的相对键合能力。该方法利用荧光标记的配体(荧光素-βala-ahx-a-reigaqlrrmaddlnaqy-oh；2765兆瓦)与mcl-1蛋白结合，导致测量的各向异性极化增加，这种增加的量由阅读器以毫伏(mp)单位显示。竞争性键合到配体结合位点的化合物的加入将导致系统内有更大比例的未结合的配体，这由mp单位的降低显示出来。
化合物溶于在dmso，再经过各11次的连续稀释。2μl转移到平底、低键合的384孔板(dmso最终浓度为5％)。加入38μl缓冲液(20mmna2po4,1mmedta,50mmnacl,ph7.4)和含荧光素标记的配体(最终浓度为10nm),然后加入mcl-1蛋白(最终浓度为10nm)。
在用biomeksynergy2读数器(ex.528nm,em.640nm,cutoff510nm)测定fp并计算mp单位之前，检测板在室温下孵育2小时。试验化合物剂量增加所产生的键合量被表示为与"只有5％dmso"和"100％抑制"(50μm没标记的配体)的参照值之间建立起来的窗口的比较所产生的mp百分数的减少。11点的剂量反应曲线采用四参数logistic模型的xl-适合软件(xl-fitsoftware)绘制。根据50％mp减少来决定抑菌半数的浓度(表1，ic50)。
二.体外细胞毒性
毒性研究在多发性骨髓瘤肿瘤细胞(h929)进行。细胞分布在微孔板和暴露试验化合物48小时。细胞的活力然后通过比色法检测量化，mtt噻唑蓝比色法(癌症研究，1987，47，939-942)。结果以ic50表示(表1，化合物抑制细胞活力50％的浓度)。+表示ic50在10nm以上；++表示ic50在1–10nm；+++表示ic50在1nm以下。
表1.抑制mcl-1的活性和对h929细胞的毒性
表1的结果表明，本发明提供的一些化合物包括单氟化物、双氟化物和氘代物都具有较ii相当或更好的抑制mcl-1的活性和选择性。