全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物、制备方法及其应用与流程

本发明涉及高分子技术领域，特别是涉及全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物、制备方法及其应用。

背景技术：

数字聚合酶链式反应即Digital PCR(dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字聚合酶链式反应能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。数字聚合酶链式反应现阶段也分为芯片式与微滴式，相对来说，微滴式数字聚合酶链式反应系统技术含量更高，数据精确度更高。其原理为将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴含或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。在经聚合酶链式反应扩增后，逐个对每个微滴进行检测，利用泊松分布对荧光信号进行处理。

微滴式数字聚合酶链式反应系统作为21世纪科研含量极高，备受生物医疗界关注的一项技术，现阶段仅有Bio-Rad及RainDance外国品牌具备相关成熟产品，因此市面上数字聚合酶链式反应仪器所需生成油，包括探针法及染料法，几乎全部都来源于以上厂家。

表面活性剂通过降低油水界面张力，可以避免液滴发生融合，甚至可以在加热加压条件下保持液滴系统的稳定，目前报道的有全氟聚醚酯化物、全氟聚醚酰胺化物等非离子型氟表面活性剂。而稳定的液滴可以使液滴内部成为一个反应仓，利于将DNA模板细分成单一进行扩展。

现有的氟表面活性剂中非离子型产品以聚氧乙烯链为亲水基团的类型为主，该类活性剂制备工艺非常复杂，一般制作步骤在两步以上且中间产物市面上并无销售，因此，导致该液滴生成所需的耗材价格高昂，满足不了更广阔的市场。

哈佛大学的C.Holtze等在Lab on a chip期刊中提到，可将含氟聚醚羧酸与氯化亚砜反应生成酰氯完成第一步之后，接着溶加入自制的PEG-Block在惰性气体保护下进行反应生成含氟聚醚羧酸酰胺。但反应过程中间产物酰氯非常容易与水发生反应，导致后续步骤效果不佳甚至产物报废，而且制备PEG-Block的难度非常大。另外利用离心的提纯方法会导致反应物产率低下，不适合商业化生产。

技术实现要素：

基于此，有必要针对上述问题，提供一种全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的制备方法，该全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物具有制备简单，性能优越以及产量高的特点，可以用作氟表面活性剂，用来制备用于数字聚合酶链式反应扩增的微滴化处理过程中的液滴生成油。

一种全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物，所述全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的结构式如下式Ⅰ所示：

其中，20≤n≤80，3≤o+q≤7，9≤p≤14。

在其中一个实施例中，所述全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的平均分子量为5000～16000。

本发明还提供了上述全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的制备方法，将全氟聚醚、草酰氯和聚酰胺于一溶剂中进行反应得到全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物，其中，所述溶剂为氟油，所述全氟聚醚的结构式如下式II所示，草酰氯的结构式如下式III所示，聚酰胺的结构式如下式Ⅳ所示：

其中，20≤n≤80，3≤o+q≤7，9≤p≤14。

本发明以结构式如式Ⅳ所示的商业聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)为原料，替代使用PEG胺这种制备复杂、提纯困难的化合物，使制备方法更简单，适合商业化生产。

具体反应方程式为：

该反应过程中，式III所示的草酰氯起到酰氯化的作用，将原料全氟聚醚(PFPE-COOH)的COOH变成COCl，然后其COCl再跟式Ⅳ所示的商业聚酰胺反应，得到式Ⅰ所示的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物产物。反应中的副产物为盐酸，其在后期清洗过程中，产物会溶于氟油7100中，而其余杂质很容易可以析出清洗。

在其中一个实施例中，所述反应的温度为60℃～120℃，时间为36h～72h。控制反应按照所限定条件进行，能够减少副反应的发生，提高产物得率。优选的，所述反应的温度为80℃～110℃，时间为48h～62h。优选理由为：该温度范围及反应时间范围可以使原料之间反应更加完全。

在其中一个实施例中，所述溶剂为氟油。该氟油可避免草酰氯的水解，而可将各反应原料溶解而进行反应得到最终产物。

在其中一个实施例中，所述氟油为甲氧基-九氟代丁烷。以甲氧基-九氟代丁烷作为反应时的溶剂，具有与极性有机溶剂配合好、可控度高的优点。

在其中一个实施例中，反应的溶剂还可包括具有极性的有机溶剂。所述有机溶剂为三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二甲基亚砜中的至少一种，优选为三氟甲苯。将具有极性的有机溶剂与氟油同时作为反应溶剂，能够提高全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的纯度。

在其中一个实施例中，所述氟油与所述有机溶剂的体积比为(0.5～2.0):1。

在其中一个实施例中，在反应的过程中还可使用催化剂。所述催化剂为有机碱。该有机碱可为4-二甲氨基吡啶、三已胺、或三乙烯二胺。优选的，该有机碱为4-二甲氨基吡啶。优选的理由为：以4-二甲氨基吡啶作为催化剂，具有较高的催化能力，可对反应物实现酰化，从而对提高产品的收率有极其明显的效果。

在其中一个实施例中，在反应完成之后还进一步包括纯化和/或离心步骤。所述纯化步骤中，将所得到的产物再次加入氟油溶解，然后滴加有机溶剂，使产物中的式I所示的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物析出，再干燥即可。通过纯化步骤，可以大幅度提高产物的纯度。在纯化之后，可进行离心步骤，也可直接对反应所得到的混合物进行离心，即离心之后，将产物进行干燥即得。

本发明还提供上述的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的应用。所述PFPE-PEG嵌段式共聚物可用作氟表面活性剂。

本发明还提供一种液滴生成油。所述液滴生成油包括氟表面活性剂和氟油，所述氟表面活性剂为全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物。该液滴生成油能够保证液滴的稳定性，具有较好的效果。

在其中一个实施例中，所述氟油溶液中氟表面活性剂的质量百分数为2％-6％。

在其中一个实施例中，所述液滴生成油使用的氟油的型号为HFE-7500。

在其中一个实施例中，所述液滴生成油用于数字聚合酶链式反应扩增的微滴化处理过程中。将上述氟表面活性剂应用于液滴式数字聚合酶链式反应中，能够降低液滴表面张力，有效提高微滴稳定性。

本发明的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物用作氟表面活性剂可作为试剂广泛运用在微流控领域中，如单细胞包裹或者微生物检测。在液滴式数字聚合酶链式反应上应用，液滴稳定性可以得到保证，此外，全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物用作氟表面活性剂具有优越的表面性能及生物相容性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

以全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物用作氟表面活性剂，可作为聚合酶链式反应探针法油相使用，实现在液滴式数字聚合酶链式反应上应用，液滴稳定性可以得到保证，而且其具备生物相容性特征，不妨碍生物水相试剂扩增反应。

所述全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物制备方法为一步法制备工艺，具有工艺简单，成本低廉的优点，适合商业化用途。

以全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物用作氟表面活性剂制备液滴生成油，具有原料成本低，性能及稳定性好的特点。

附图说明

图1为实施例1中反应原料与产物红外光谱对比图，其中：a表示产物全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物红外光谱，b表示原料全氟聚醚红外光谱，c表示原料聚酰胺红外光谱。

图2为实施例1中产物全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物氟谱图。

图3为实施例6中液滴生成后及时取样显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图4为实施例6中液滴生成静置30天后取样显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图5为实施例6中液滴生成后及时取样显微镜下观察图，图中图例长度为100μm。

图6为实施例6中液滴生成静置30天后取样显微镜下观察图，图中图例长度为100μm。

图7为实施例6中使用微流控芯片生成均一的油包水液滴示意图。

图8为实施例6中聚合酶链式反应扩增热循环前显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图9为为实施例6中聚合酶链式反应扩增热循环后显微镜下观察图，图中图例长度为200μm。

图10为图9黑线框放大视野图，图中图例长度为100μm。

图11为图10在汞灯环境下调整曝光率后液滴荧光示意图。

图12为实施例6中液滴进入微流控芯片进行荧光检测示意图。

图13为实施例6中液滴进行荧光信号采集波形图。

图14为图13经软件算法处理后的数据图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

以下实施例中所用原料均为市售购得。

实施例1：

全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的反应式如下：

其中，20≤n≤80，3≤o+q≤7，9≤p≤14。

具体的，在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为5000-7500)、式III的草酰氯、式Ⅳ的聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与三氟甲苯的混合反应溶剂中。其中HFE-7100与三氟甲苯的体积比为1:1。在100℃的温度下搅拌反应50h，抽滤后旋干溶剂，得到产物。

纯化：将上述反应得到的产物再次加入HFE-7100溶解，滴加二氯甲烷清洗，将最终产物析出并进行旋蒸。然后真空干燥，得到白色透明油状物的产物，即得式I的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物。所得到的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物的平均分子量为5000-16000。

将所得全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物进行红外图谱及核磁图谱(氟谱)测试，测试结果如图1、图2所示。

由图1可见，位于1716cm-1位置的特征峰对应于产物中酰胺C＝O双键，位于1635cm-1位置的特征峰对应于产物中胺基。

由图2可见，化学位移在-83～-74范围的一系列共振峰对应于全氟聚醚。

由图1及图2的结果，均证实了该反应得到如式I的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物。

实施例2：

实施例2的反应过程和纯化步骤与实施例1相同。具体如下：

在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为5000-7500)、式III的草酰氯、式Ⅳ的聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与三氟甲苯的混合反应溶剂中。其中HFE-7100与三氟甲苯的体积比为1.5:1。在110℃的温度下搅拌反应42h，抽滤后旋干溶剂，得到产物。

实施例3：

实施例3的反应过程和纯化步骤与实施例1相同。具体如下：

在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为5000-7500)、式III的草酰氯、式Ⅳ的聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与二甲基甲酰胺的混合反应溶剂中。其中HFE-7100与三氟甲苯的体积比为0.5:1。在80℃的温度下搅拌反应65h，抽滤后旋干溶剂，得到产物。

实施例4：

实施例4的反应过程与实施例1相同，反应后将产物进行离心，取底部溶液进行干燥得到式I的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物。

具体的过程为：在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为5000-7500)、式III的草酰氯、式Ⅳ的聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与四氢呋喃的混合反应溶剂中。其中HFE-7100与三氟甲苯的体积比为0.8:1。在60℃的下搅拌反应72h，抽滤后旋干溶剂，得到产物。

实施例5：

实施例5的反应过程与实施例1相同，反应后将产物分别进行纯化和离心，得到式I的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物。

具体的过程为：在惰性气体保护下，将式II的全氟聚醚(购自杜邦，型号为FSH157，该全氟聚醚的平均分子量为5000-7500)、式III的草酰氯、式Ⅳ的聚酰胺(购自亨斯曼，型号为JEFFAMINE系列)与催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于氟油(购自杜邦，型号为HFE-7100)与二甲基亚砜的混合反应溶剂中，其中HFE-7100与三氟甲苯的体积比为2:1，在120℃的下搅拌反应36h，抽滤后旋干溶剂得到产物。

实施例6：

将实施例1制备得到的平均分子量为5000-16000的全氟聚醚-聚乙二醇嵌段式共聚物用作氟表面活性剂，按质量百分浓度3％的量溶于HFE-7500氟油(购自杜邦，型号为HFE-7500)中，即得液滴生成油。

利用实施例6液滴生成油进行液滴生成实验：

一、静置稳定性测试

对实施例6的液滴生成油进行液滴静置稳定性的测试，使用生成后立即取样的液滴与放置30天后的液滴进行对比，如图3至图6所示，在显微镜可以观察到两者几乎没有区别，液滴照样能呈现蜂巢式均一性排布，可以说明该油相所制液滴具备优秀的静置稳定性能。

二、液滴式数字聚合酶链式反应测试

对实施例6的液滴生成油进行液滴式数字聚合酶链式反应测试，具体为：以Hotstart master mix配合引物、探针及DNA模板作为水相(如图7所示)，在微流控芯片中生成均一的油包水液滴，进行聚合酶链式反应扩增热循环。

如图8、9所示，在显微镜下观察到，液滴经40至50轮聚合酶链式反应热循环过程后，其均一性状态依然保持良好，仍然呈现规律的蜂窝形貌，破损及融合液滴的存在率(CV值)远低于5％。

将图9中黑线框的局部放大，得到图10的局部视图。在汞灯环境下调整曝光率，清晰观察到，扩增后呈阳性的液滴荧光强度相对其他阴性液滴更加明亮，如图11所示，该图11为图10相同视野图。

再对液滴荧光强度进行定量分析，利用光机模块对每个通过微流控芯片检测口的液滴进行荧光信号采集并进行软件算法处理，如图12至图14所示。在随机一段采集片段中可以清晰看到，几个阳性峰的峰值强度是众多阴性峰值的3倍左右，符合显微镜观察结果。经过软件算法处理后，可以清晰看到数据图上两个明显的阴阳条带，符合实验预期结果。

实施例7：

实施例7的液滴生成油与实施例6的区别仅在于，氟表面活性剂的质量百分浓度为2％。

实施例8：

实施例8的液滴生成油与实施例6的区别仅在于，氟表面活性剂的质量百分浓度为4％。

实施例9：

实施例9的液滴生成油与实施例6的区别仅在于，氟表面活性剂的质量百分浓度为5％。

实施例10：

实施例10的液滴生成油与实施例6的区别仅在于，氟表面活性剂的质量百分浓度为6％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。