本实用新型涉及生物技术领域，尤其涉及一种RNA反义纯化试剂盒。
背景技术：
长链非编码RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)是长达两百个核苷酸以上的转录本，绝大多数位于细胞核内。虽然lncRNA没有编码任何蛋白质，但它们在不同组织和发育阶段的表达依然具有特异性，这说明lncRNA具有重要的生物学意义。在测序技术的帮助下，人们已经发现了数千种lncRNA，但这些lncRNA的生物学功能依然还是个谜。
2013年，Jesse M.Engreitz教授开发了RNA反义纯化(RNAantisensePurification，RAP)技术，该技术可以在转录后水平鉴定RNA与RNA及相关DNA和蛋白质的互作。其原理如下：首先用紫外交联固定细胞，以维持如lncRNA等调控RNA与RNA、RBP的相互作用，然后进行细胞裂解，接着用生物素标记的寡核苷酸探针组与靶lncRNA杂交，基于生物素和链霉亲和素相互作用的原理，用链霉亲和素磁珠来分离、纯化探针-基因或蛋白质复合体，最后从纯化的复合体中分离蛋白质或RNA，以进行下游的分析。
RAP技术被不同领域的研究者们广泛采用。如Engreitz J M等(2013)利用RAP技术通过研究LncRNA Xist成功地阐释了Xist使X染色体失活的作用机理(Engreitz J M,Pandyajones A,Mcdonel P,et al.The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome[J].Science,2013,341(6147):L35-L38.)。随着人们进一步认识非编码RNA在转录后水平发挥的重要作用，研究者对RAP技术进行不断的完善，旨在阐明lncRNA在机体内与内源性RNA、蛋白质的互作关系。2014年，Engreitz J M及其同事们运用RAP技术研究了核内小RNA U1和lncRNA Malat1与前体mRNA互作的作用机理。通过使用不同交联试剂及交联条件，改进的RAP技术能够进一步研究体内RNA-RNA互作关系及RNA在染色体上的定位及参与的转录调控(Engreitz J,Sirokman K,Mcdonel P,et al.RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites[J].Cell,2014,159(1):188-99.)。
然而，现有RAP技术因磁珠会吸附非特异性的核酸及蛋白质、探针组与RNA杂交的效率不高、核酸及蛋白质等产品回收效率不高等问题而存在特异性低、灵敏度不佳的缺点。
技术实现要素：
有鉴于此，有必要针对上述的问题，提供一种RNA反义纯化试剂盒。
为了实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案：
一种RNA反义纯化试剂盒，包含盒体和位于盒体内的海绵垫，海绵垫上开设有多个容器孔，所述容器孔内放置EP管和试剂瓶，所述海绵垫上开设有一个大孔、四个中孔和十四个小孔，大孔用于放置100ml试剂瓶，中孔用于放置20ml试剂瓶，小孔用于放置2ml EP管，所述100ml试剂瓶内盛放Wash Buffer，所述四个20ml试剂瓶分别用于盛放Lysis buffer、2×Hybridization Buffer、1×Hybridization Buffer和10mM pH 7.5 Tris-HCl，所述十四个2ml EP管分别用于盛放Streptavidin Beads、RNA Elution Buffer、RNA Elution Buffer、Proteinase K buffer、Glycogen、1×DNase salt stock、20 U Turbo DNase、EDTA、EGTA、DTT、RNase Inhibitor、Proteinase K、RNase-free water、5M NaCl。
优选地，所述大孔和中孔位于海绵垫的左侧，大孔在后，中孔在前，中孔分为两排，每排两个；小孔位于海绵垫的右侧，小孔分为四排，前两排每排三个，后两排每排四个。
优选地，所述100ml试剂瓶中装有90ml Wash Buffer；四个20ml试剂瓶分别装有14ml Lysis buffer、12ml 2×Hybridization Buffer、10ml 1×Hybridization Buffer、20ml 10mM pH 7.5Tris-HCl。
优选地，所述十四个2ml EP管分别装有1.2ml Streptavidin Beads、2.0ml RNA Elution Buffer、0.5ml RNA Elution Buffer、0.75ml Proteinase K buffer、60μl Glycogen、50μl 1×DNase salt stock、150μl 20 U Turbo DNase、0.2mlEDTA、0.1ml EGTA、12.5μl DTT、50μl RNase Inhibitor、30μl Proteinase K、0.9ml RNase-free water、0.6ml 5M NaCl。
优选地，每个EP管上标有编号。
与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：
本实用新型包含了RNA反义纯化过程所需的试剂，可以直接使用，不必再另行配制。本实用新型试剂盒通过预先使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠的非特异性吸附。BSA和寡核苷酸随机引物的大小正合适，既能封闭磁珠增强实验的特异性，又不会过大而影响探针与RNA的结合。本实用新型中磁珠首先与探针孵育，去除多余探针后再与RNA孵育，过量探针封闭链霉亲和素与蛋白质、核酸等的非特异性结合，提高检测特异性，灵敏度高；杂交后经梯度温度多次洗涤，保证磁珠充分结合探针并结合目标RNA，提高杂交效率。
附图说明
图1为本实用新型结构示意图。
附图标记为：
盒体 1，海绵垫 2，容器孔 3，盖子 4，2ml EP管 5，100ml试剂瓶 6、20ml试剂瓶 7。
具体实施方式
为了更好的说明本实用新型，下面结合附图和具体实施方式做进一步说明。本实用新型中所用试剂或仪器均可由市场购得，使用的检测方法等都是本领域所熟知的，在此不再赘述。
实施例1
如图1所示，一种RNA反义纯化试剂盒，包含盒体1、位于盒体1内的海绵垫2和盖子4，海绵垫2上开设有多个容器孔3，所述容器孔3内放置EP管和试剂瓶，所述海绵垫2上开设有一个大孔、四个中孔和十四个小孔，大孔用于放置100ml试剂瓶6，中孔用于放置20ml试剂瓶7，小孔用于放置2ml EP管5。所述大孔和中孔位于海绵垫2的左侧，大孔在后，中孔在前，中孔分为两排，每排两个；小孔位于海绵垫2的右侧，小孔分为四排，前两排每排三个，后两排每排四个。
优选地，所述100ml试剂瓶中装有90ml Wash Buffer；四个20ml试剂瓶分别装有14ml Lysis buffer、12ml 2×Hybridization Buffer、10ml 1×Hybridization Buffer、20ml 10mM pH 7.5Tris-HCl。所述十四个2ml EP管分别装有1.2ml Streptavidin Beads、2.0ml RNA Elution Buffer、0.5ml RNA Elution Buffer、0.75ml Proteinase K buffer、60μl Glycogen、50μl 1×DNase salt stock、150μl 20U Turbo DNase、0.2mlEDTA、0.1ml EGTA、12.5μl DTT、50μl RNase Inhibitor、30μl Proteinase K、0.9ml RNase-free water、0.6ml 5M NaCl。每个EP管上标有编号，第一至四排分别标为A-D排，每排中每个EP管自左自右依次标为a-c或d。如第一排第一个空中的EP管标为Aa管，依此类推。
下面结合具体实施例来说明本实用新型试剂盒的使用方法。CTNNB1为编码catenin beta 1蛋白的mRNA，物种为人类。针对CTNNB1mRNA开展RAP实验，靶基因为hsa-miR-214。探针的设计和用生物素标记方法是本领域技术人员所熟知的，在此不再赘述。链霉亲和素偶联在磁珠(BeaverBeadsTMStreptavidin，海狸生物科技有限公司)上，并和脱硫生物素亲和结合；RNA与磁珠-RNA探针孵育，经过洗涤可以将非特异性结合RNA等去除；最后，再用洗脱液(针对链霉亲和素)进行洗脱，纯化后可以验证RNA类型。具体步骤如下：
S1、细胞的交联、裂解及基因组DNA的消化，得到RNA样品
S11、培养和收集细胞
本实施例中使用cCL-RAP细胞培养或PAR-CL细胞培养方式。采用15cm细胞培养皿培养，cCL-RAP细胞的培养使用含10v/v％FCS DMEM，PAR-CL细胞的培养使用含100μM 4SU及10v/v％FCS DMEM。培养结束时每皿约2×107个细胞，每次实验需要5皿细胞，共计约1×108个细胞。
S12、交联细胞
去除培养基后，向培养皿中加入0.3ml PBS，摇动洗涤一次后，充分去除残余PBS并将培养皿置于冰上；将培养皿置于紫外灯10～15cm距离，0.15J cm2254nm UV交联约1min(cCL)，或者365nm UV交联约1min(4SU-labeled，PAR-CL)。交联结束后，尽快向培养皿中加入15ml预冷的PBS并短暂静置于冰上；用细胞刮收集细胞；4℃400g离心3min收集细胞沉淀，去除上清。
S13、裂解细胞
向细胞沉淀中加入1.4ml预冷的Lysis buffer、5μl RNase Inhibitor，并充分吹打充分裂解；使用0.4mm针头口径注射器，抽动混匀3次，冰浴静置裂解10min；裂解样品立即使用或-80℃保存一周内使用。
S14、消化基因组DNA
向细胞裂解液中添加4.8μl 1×DNase salt stock、15μl DNase(20U)，37℃温育10min；转移样品到冰浴环境，快速加入20μl 0.5M EDTA、10μl 0.5M EGTA、5μl 1M DTT并充分混匀；将细胞裂解液按0.5ml、0.5ml、0.2ml及0.05ml分为四管，分别为标示实验组1样品、实验组2样品(平行试验)、NC组样品和input组样品；向NC组和各实验组样品中分别加入等体积2×Hybridization Buffer，充分混匀后冰上静置10min；4℃16,000g离心10min转移上清至新无RNase离心管中；NC组、input组和各实验组样品-80℃保存备用。
S2、探针组溶液的制备：将生物素标记的各探针溶解后混合，于85℃变性3min，快速转移冰浴，得到探针组溶液。本实施例中，实验组的探针组含有8条探针，NC组的探针组含有3条探针。具体序列如表1和表2所示。
表1、实验组用探针序列
表2、NC组用探针序列
以实验组为例说明探针组溶液的制备：向各条探针中加入100倍nmol数μl的1×TE，假如探针为1nmol的粉末，则加入100μl的TE，充分涡旋混匀后微离心后，都转移到同一离心管中，加入1×TE调整每条探针浓度为10pmol/μl，得到探针混合液；取5μl探针混合液，其中每条探针含量为50pmol，探针总量为n×50pmol，n为探针数目；85℃变性3min后，快速转移冰浴，得到实验组用探针组溶液。采用相同的方法可以制备NC组用探针组溶液。
S3、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠。
磁珠浓度为400pmol/100μl，每1pmol探针需要1pmol磁珠，按n(探针数目)×100μl/(400pmol/50pmol)链霉亲和素磁珠标准，为实验组准备磁珠，磁力架上收集磁珠并去上清；加入1ml 10mM Tris-HCl pH 7.5充分重悬后，颠倒混匀10次，磁力架上收集磁珠并去上清，重复洗涤2次；加入1ml 1×Hybridization Buffer充分重悬后，颠倒混匀10次，磁力架收集磁珠并去上清。向磁珠加入1ml含0.05～0.5wt％BSA和10～20μmol/L寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后置于磁力架上去除TES溶液。采用相同的方法可以制备NC组用磁珠。
S4、探针组-磁珠复合物的制备：将探针组溶液加入到预处理后的磁珠中，得到探针组-磁珠复合物。
将制备的实验组探针组溶液加入实验组用预处理后的磁珠中，并加入100μl2×TES，25℃旋转温和混合30min，磁力架上收集磁珠并去上清，加入0.35ml1×TES，温和旋转洗涤磁珠，置于磁力架上去除洗涤液，重复洗涤一次，得到实验组用探针组-磁珠复合物。采用相同的方法制备NC组用探针组-磁珠复合物。
S5、反义纯化
实验组样品中加入准备的实验组用探针组-磁珠复合物；垂直混匀器上65℃温育变性10min，37℃孵育杂交180min，37℃洗涤2次、42℃洗涤2次、45℃洗涤2次，每次垂直混匀器摇动洗涤5min，洗涤用Wash Buffer，在使用前预热到相应洗涤温度并加入0.5mM PMSF，洗涤后在磁力架上静置1min收集磁珠弃上清；最后一次洗涤后加入500μl Wash Buffer悬浮磁珠，35℃摇动洗涤2～4min后磁力架上收集磁珠并去上清，并重复3～6次，得到实验组用RNA-探针组-磁珠复合物。采用相同的方法制备NC组用RNA-探针组-磁珠复合物。
S6、RNA的洗脱
实验组用RNA-探针组-磁珠复合物样品磁珠加入50μl RNA Elution Buffer充分混匀后，95℃加热2min；磁力架收集磁珠并转移上清至新无RNase离心管中，重复上述步骤一次；加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg proteinase K，50℃温育消化1h，得到实验组用洗脱后的RNA样品。采用相同的方法洗脱NC组用RNA-探针组-磁珠复合物，得到NC组用洗脱后的RNA样品。
向input组样品中加入25μl 5×Proteinase K buffer、1μg proteinase K、50μl RNA Elution Buffer，50℃温育消化1h，得到input组用RNA样品。
S7、RNA的纯化
向实验组用洗脱后的RNA样品中加入等洗脱体积的(125μl)苯酚-氯仿-异戊醇混合液，颠倒混匀15s；13000g 4℃离心10min，收集上层水相并转移到新无RNA酶离心管中；加入20μl 5M NaCl、2μl Glycogen、600μl无水乙醇，充分颠倒混匀后-80℃沉淀1～16h；4℃16100g离心30min，弃上清；加入1ml预冷的80％乙醇，4℃16100g离心10min，弃上清；室温静置风干10min；加入20～30μl RNase-free water，冰上静置保存；65℃温育15min，充分溶解RNA及去除残余DNA酶活性，得到纯化后的实验组样品。采用相同的方法处理NC组用洗脱后的RNA样品和input组用RNA样品，分别得到纯化后的NC组样品和input组样品。
对纯化后的RNA样品进行了miRNA检测，具体方法如下。取5μl RNA样品开展1.5％琼脂糖凝胶电泳检测RNA富集效果，结果显示检测到明显的RNA富集。取2μl RNA样品Agilent 2100检测RNA浓度及片段大小范围，检测结果显示富集得到的RNA浓度为6.9ng/μl，大小范围为200～700bp，均在正常范围之内。取2μl RNA样品nanodrop检测RNA纯度及浓度，结果显示其纯度为：OD260/280为1.91，浓度为8.9ng/μl，两次检测结果相近，说明已成功完成RNA的富集及纯化。
为了更好的说明本实用新型的效果，实用新型人还进行了两组对照，对照组1采用传统方法(Jesse Engreitz.RNA Antisense Purification(RAP):Experimental Protocols.2014.)检测has-MiR-214基因；对照组2采用本实用新型RAP试剂盒检测内参U6基因。
使用QiagenmiScript Reverse Transcription Kit(218061)逆转录RNA样品，具体方法参考逆转录试剂盒说明书；参考2×Taq PCR试剂盒说明书配置20μl PCR扩增体系，进行PCR扩增，取5～10μl PCR扩增产物开展琼脂糖凝胶电泳(2％～3％)。靶基因hsa-miR-214扩增片段长度为约90bp，与对照组1的结果相比，均处于正确范围，但比传统方法有更好的浓度和纯度。F引物序列为ACAGCAGGCACAGACAGGCAG，R引物为试剂盒自带引物。对照组2中U6扩增片段长度为94bp，F引物序列为：CTCGCTTCGGCAGCACA；R引物序列为：AACGCTTCACGAATTTGCGT。
以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型专利的保护范围应以所附权利要求为准。