本发明属于细菌分子检测技术领域，具体涉及一种鲟源中间气单胞菌amth-1及pcr检测引物及应用。
技术背景
气单胞菌是一类兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。早在1986年，colwell等将气单胞菌属由弧菌科中分出，隶属于新建的气单胞菌科。迄今为止，气单胞菌包括：嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、温和气单胞菌、维氏气单胞菌和中间气单胞菌等14个表型种和16个基因种。气单胞菌在环境中分布广泛，在水生生态系统中以嗜温菌存在。中间气单胞菌(aeromonasmedia)，是气单胞菌属的一个种，最早于1983年在河水中发现，随后在淤泥、废水、动物体以及人体中都检测到该细菌的存在。中间气单胞菌是一种新发现的条件致病菌，可引起人类和动物的感染，人类的主要症状是腹泻。中间气单胞菌对水生动物致病的报道相对较少，仅王高学等(2007)报道了中间气单胞菌引起刺参腐皮病；黄文明等(2013)报道了中间气单胞菌引起胭脂鱼发病；杨移斌等(2016)通过病原分离纯化鉴定及人工感染等实验,证实中间气单胞菌可引起斑点叉尾鮰出血性死亡。
本申请中，申请人首次在人工养殖的中华鲟中发现中间气单胞菌感染，感染症状主要为体表出血和内脏器官的广泛出血。中华鲟和达氏鲟是我国长江流域现存的最为古老的鱼类，属于国家一级重点保护野生动物，中间气单胞菌的发现对这两种鲟鱼的物种保护构成潜在威胁。因此，对鲟源中间气单胞菌进行深入研究具有重要意义。
目前对气单胞菌属的研究主要集中在嗜水气单胞菌(aeromonashydrophila)，而对中间气单胞菌的研究甚少。尚未有鲟源中间气单胞菌的公开报道，也更无有效的检测方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供了鲟源中间气单胞菌(aeromonasmedia)amth-1，所述的中间气单胞菌分离自中华鲟病变组织，该细菌已于2018年4月9日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：中间产气单胞菌(aeromonasmedia)amth-1，保藏编号：cctccno:m2018185，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了鲟源中间气单胞菌amth-1的特异性序列16srrna和cpn60，16srrna的核苷酸序列为seqidno.1所示，cpn60的核苷酸序列为seqidno.2所示。
本发明还有一个目的在于提供了检测鲟源中间气单胞菌amth-1的引物，所述的引物为f1：5'-gttgatacctaatacctgycagc-3'，r1：5'-ggactaccagggtatctaatc-3'；f2：5'-ccagccctgcgccgacaa-3'，r2：5'-caccagggtcgccagcgcttca-3'。
本发明还有一个目的在于提供了鲟源中间气单胞菌amth-1的应用，所述的应用包括利用该细菌制备成中间气单胞菌细菌疫苗，或是制备成鲟源中间气单胞菌的实验室对照品，或是用于制备筛选治疗鲟源中间气单胞菌细菌病药物的模型。
本发明的最后一个目的在于提供一种鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物的应用，包括利用所述的引物制备成鲟源气单胞菌检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种中间气单胞菌amth-1，所述的细菌分离自中华鲟病变肝脏组织，该细菌已于2018年4月9日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：中间产气单胞菌(aeromonasmedia)amth-1，保藏编号：cctccno:m2018185，地址：中国武汉武汉大学。
将中间气单胞菌amth-1(本发明或称为amth-1)接种到bhi(bd,bectotmbrainheartinfusion)固体琼脂培养基上进行扩大培养，28℃培养箱中培养24h后，挑取单菌落在相同条件下在bhi固体琼脂培养基进行二次划线培养，于-80℃甘油保存。
中间气单胞菌amth-1的形态特征：大小为(1～4)μm×(0.1～1)/μm，菌体两端钝圆，单极鞭毛，运动不活泼。无芽胞，有窄的荚膜，属于革兰阴性短杆菌。
中间气单胞菌amth-1的应用，所述的应用包括利用该细菌制备成中间气单胞菌疫苗，或是制备成鲟源中间气单胞菌的实验室对照品，或是用于制备筛选治疗鲟源中间气单胞菌细菌病药物的模型。
鲟源中间气单胞菌amth-1的特异性序列16srrna和cpn60，16srrna的核苷酸序列为seqidno.1所示，cpn60的核苷酸序列为seqidno.2所示。
鲟源中间气单胞菌amth-1的特异性序列的应用，包括利用16srrna和/或cpn60序列用于检测或区分鲟源的中间气单胞菌amth-1。
针对鲟源中间气单胞菌amth-1的特异性序列16srrna和/或cpn60设计的引物也属于本发明的保护范围，所述的引物包括但不限于基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，lamp引物，数字pcr引物等。
一种鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物，包括f1：5'-gttgatacctaatacctgycagc-3'，r1：5'-ggactaccagggtatctaatc-3'；f2：5'-ccagccctgcgccgacaa-3'，r2：5'-caccagggtcgccagcgcttca-3'。
一种鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物的应用，包括利用针对鲟源中间气单胞菌amth-1的特异性序列16srrna和/或cpn60设计的引物制备成用于检测中间气单胞菌检测试剂盒。
优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：
1)提取待测样品的dna；
2)pcr体系
采用25μl反应体系：浓度为10μm的两对引物f1、r1或f2、r2分别各取0.5μl加入两只pcr反应管，两个pcr反应管中再分别加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μl。反应条件，94℃预变性3min；94℃30s、56℃15s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
3)检测结果判定
聚合酶链式反应扩增的最终反应产物取4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭(eb)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100v电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示352bp和385bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明首次自中华鲟体内分离出了中间气单胞菌，对于鲟源气单胞菌的研究具备开拓性的意义。
1.本发明的方法快速简便：本发明所建的pcr方法只需数小时，相比较传统细菌分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
2.本发明的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了pcr方法扩增的高度特异性。
附图说明
图1为本发明提供的两对引物的灵敏度的实验结果示意图；
其中，泳道1：原始模板、泳道2：10倍稀释、泳道3：100倍稀释、泳道4：1000倍稀释、泳道5：10000倍稀释、泳道6：100000倍稀释、泳道7：1000000倍稀释。
图2为利用本发明提供的引物检测感染鲟源中间气单胞菌amth-1的鲟鱼组织进行检测的结果示意图；
其中泳道p：阳性对照；n：阴性对照(模板为无菌水)m：2000bpmarker(从上至下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)
泳道1：待测样品1；
泳道2：待测样品2；
泳道3：待测样品3；
泳道4：待测样品4。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1：
一种鲟源中间气单胞菌amth-1，其分离过程如下：
1)将携带细菌的中华鲟肝脏、脾脏等组织取出并碾磨后，无菌的pbs稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到bhi(bd,bectotmbrainheartinfusion)固体琼脂培养基上进行分离培养，28℃培养箱中培养24h后，培养皿中出现白色半透明的菌落。
2)挑取单菌落，革兰氏染色观察细菌形态。
3)收集细菌，对其进行16srrna和cpn60扩增和测序，序列分别为seqidno.1所示和seqidno.2所示。
中华鲟中间气单胞菌的形态特征：属于革兰阴性短杆菌。大小为(1～4)μm×(0.1～1)/μm，菌体两端钝圆，单极鞭毛，运动不活泼。无芽胞，有窄的荚膜。该细菌已于2018年4月9日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：中间产气单胞菌(aeromonasmedia)amth-1，保藏编号：cctccno:m2018185，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
基于鲟源中间气单胞菌amth-1的16srdna(seqidno.1)和cpn60(seqidno.2)与其他细菌的相应序列的差异设计的引物：
本发明以普通pcr为例进行说明，基于该差异序列设计的其他引物，荧光定量引物，lamp引物，数字pcr引物等，也能完成鲟源中间气单胞菌amth-1的检测。
一种鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物，包括f1：5'-gttgatacctaatacctgycagc-3'，r1：5'-ggactaccagggtatctaatc-3'；f2：5'-ccagccctgcgccgacaa-3'，r2：5'-caccagggtcgccagcgcttca-3'。
实施例3：
利用中间气单胞菌amth-1pcr检测引物对鲟源中间气单胞菌amth-1的检测，方法包括：
1.中华鲟组织dna的提取：采用商品化基因组提取试剂盒提取待测样品的总dna，将获得dna模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为10μm的两对引物f1、r1或f2、r2分别各取0.5μl分别加入两个pcr反应管，再分别加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×thermopolreactionbuffer2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μl。反应条件，94℃预变性3min；94℃30s、56℃15s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
f1：5'-gttgatacctaatacctgycagc-3'，r1：5'-ggactaccagggtatctaatc-3'；
f2：5'-ccagccctgcgccgacaa-3'，r2：5'-caccagggtcgccagcgcttca-3'
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增扩增的最终反应产物4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭(eb)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100v电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。若f1和r1能扩增出352bp且f2和r2能扩增出385bp特征性条带，则该样品为阳性；如无任何条带，则为阴性。
实施例4：
鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物特异性试验
利用实施例3所述的方法，对表1中的待检鲟源中间气单胞菌amth-1样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(amth-1)，待检细菌样品具体为：中华鲟嗜水气单胞菌(ahth-1)(嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫施氏鲟后的免疫应答反应与保护效果，周勇)、中华鲟维氏气单胞菌(avth-1)、中华鲟脑膜败血伊丽莎白菌(em)，温和气单胞菌(asth-1)。
表1鲟源中间产气单胞菌amth-1pcr检测试剂盒特异性试验
结果如表1所示，仅阳性对照组(amth-1)可检测到352bp和385bp特征性条带，其余组均无特征条带，说明鲟源中间产气单胞菌amth-1检测引物具备很强的特异性。
实施例5：
鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物的灵敏度
将浓度为2000ng/μl的amth-1dna模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物pcr的检测限，结果如图1所示，可见105倍稀释还可检测到目的条带，也就是最低可检测20pg/μl的cdna模板。
实施例6：
鲟源中间气单胞菌amth-1pcr检测引物在制备鲟源中间气单胞菌检测试剂盒中的应用：
1.中华鲟组织总dna的提取：采用商品化基因组提取试剂盒提取待测样品的总dna，将获得dna模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为10μm的两对引物f1、r1或f2、r2分别各取0.5μl加入两只pcr反应管，再分别加入2.5mmdntps2μl，25mmmgcl21.5μl，5utaq聚合酶0.5μl，模板cdna1μl，10×buffer2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μl。反应条件，94℃预变性3min；94℃30s、56℃15s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。f1：5'-gttgatacctaatacctgycagc-3'，r1：5'-ggactaccagggtatctaatc-3'；f2：5'-ccagccctgcgccgacaa-3'，r2：5'-caccagggtcgccagcgcttca-3'
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μl，加入至含有0.5μg/ml溴化乙锭(eb)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100v电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示352bp和385bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
结果如图2所示，阳性对照(中华鲟中间产气单胞菌amth-1)显示385bp和352bp特征性条带，阴性(水)对照无明显条带，1-4号感染了中华鲟中间产气单胞菌amth-1的鲟鱼组织样品显示352bp和385bp特征性条带，说明样品1-4为中华鲟中间产气单胞菌阳性，与实际情况相符。
实施例7：
中间气单胞菌amth-1在制备鲟源中间气单胞菌的实验室对照品中的应用：
将本发明提供的鲟源中间气单胞菌amth-1作为对照品，将待确认的其他细菌与本发明的细菌进行生理生化上的比较，并且将待测样品跟seqidno.1和seqidno.2所示序列进行比较。
实施例8：
中间气单胞菌amth-1在制备筛选治疗鲟源中间气单胞菌细菌病药物的模型中的应用：
1.挑取中间气单胞菌amth-1单个菌落接种到bhi液体培养基上进行扩大培养，28℃摇床中培养15h后，4℃4000rpm离心15min收集细菌；
2.将离心收集的中间气单胞菌amth-1细菌重悬于pbs缓冲液中，调整细菌悬浮浓度至1.9×109cfu/ml；
3.选取30尾健康的子二代达氏鲟(体长：3.0±0.8cm；体重：25.1±3.1g)，分成2组，实验组和对照组各15尾；
4.实验组每尾鱼腹腔注射200μl(3.8×108cfu)细菌悬液，对照组每尾鱼腹腔注射200μlpbs缓冲液；
5.统计7天内的实验组和对照组鱼的死亡率，实验组感染死亡率为100％(15尾)，对照组无死亡。
序列表
<110>中国水产科学研究院长江水产研究所
<120>一种鲟源中间气单胞菌amth-1及pcr检测引物及应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1346
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gcgagcggcggacgggtgagtaatgcctgggaaattgcccagtcgagggggataacagtt60
ggaaacgactgctaataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggaccttcgggcctt120
gcgcgattggatatgcccaggtgggattagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggc180
gacgatccctagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccag240
actcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagcca300
tgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggtt360
gatacctaatacctgycagctgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtg420
ccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcg480
cacgcaggcggttggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatt540
taaaactgtccagctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaat600
gcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgct660
caggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaac720
gatgtcgatttggaggctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcg780
accgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcaca840
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<210>2
<211>632
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
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<213>人工序列(artificialsequence)
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<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
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