KRT6A基因甲基化在弱精症诊断剂中的应用及试剂盒的制作方法

本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及人krt6a基因启动子区的甲基化水平在制备弱精症诊断剂中的应用，以及一种弱精症诊断试剂盒。

背景技术：

40％以上的不育男性均检测出患有弱精症。弱精症的病因是多因子的，例如，可能与内分泌紊乱、环境因素、生活经历甚至年纪渐长等都密切相关。对鼠类进行基因敲除和突变的研究显示，一些基因的突变与精子活性改变相关，但是这些基因在人类研究中均显示与精子活性无关。尽管近50％的不育案例被认为由遗传缺陷所致，但是，在一些男性不育的案例中，遗传因素貌似并非主要因素。越来越多的证据显示，在男性不育中，异常的表观遗传改变也有贡献。

精子是具有高度多样性的细胞群，其在dna和精子质量参数上均体现出高度的多样性。有研究者已经开始研究精子dna甲基化的样品内多样性，包括不同精细胞之间的精子dna甲基化多样性和同一次射精物中不同质量的精子区之间的精子dna甲基化多样性。本申请的发明人在研究过程中发现并报道(杜野等，humanreproduction,vol.31,no.1pp.24–33,2016，promotertargetedbisulfitesequencingrevealsdnamethylationprofilesassociatedwithlowspermmotilityinasthenozoospermia)，一些特定区域上的甲基化在弱精症患者的精细胞与正常对照的精细胞之间存在显著的差异，推测其中某些区域的甲基化可能与弱精症的发病相关联。

然而，目前已报道的可作为弱精症的分子标志物的甲基化区域十分少，难以用来准确诊断受试者是否患有弱精症，因此需要鉴定更多与弱精症相关的甲基化区域，从而为后续诊断和治疗的应用提供更多依据。

技术实现要素：

我们在以前研究的基础上，继续深入研究，寻找和分析与弱精有关联的差异甲基化区域。基于此，本发明提供了人krt6a基因启动子区在制备弱精症诊断剂中的应用。

在一个具体实施方案中，所述人krt6a基因启动子区位于人第12号染色体第52886681至52889381位对应的区域。

在一个具体实施方案中，所述人krt6a基因启动子区为如seqidno:1所示序列对应的区域。

本发明还提供了一种弱精症诊断试剂盒，包括检测人krt6a基因启动子区的甲基化水平的引物。

在一个优选实施方案中，所述诊断试剂盒包括第一引物对和第二引物对，所述第一引物对由序列分别为seqidno:2和3的两条引物组成，所述第二引物对由序列分别为seqidno:4和5的两条引物组成。

在一个优选实施方案中，所述检测试剂盒还包括亚硫酸氢盐溶液。

在一个优选实施方案中，所述亚硫酸氢盐溶液为亚硫酸氢钠溶液。

本发明通过基于全基因组甲基化测序结果进行分析和研究并通过验证，发现人krt6a基因启动子区的甲基化水平在弱精症患者与健康人之间存在着显著性差异，可作为分子标志来诊断受试者是否患有弱精症。当该区域甲基化率高于0.72时，受试者患有弱精症的概率较大。该分子标志可为弱精症的诊断提供辅助评价信息，结合其他诊断指标一起鉴定受试者是否患有弱精症。

附图说明

图1为全基因组测序研究中8名健康志愿者的级分a中的精子(na)与7名弱精症患者的级分a中的精子(aa)的人krt6a基因启动子区甲基化水平统计图；

图2为验证研究中50名健康志愿者的级分a中的精子(na)与30名弱精症患者的级分a中的精子(aa)的人krt6a基因启动子区甲基化水平统计图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1、精子分离

招募7个弱精症志愿者(a组)和8个健康志愿者(n组)，从志愿者获取精子样品，进行全基因组甲基化水平测序研究。使用spermclassanalyzer进行计算机辅助的精子分析(casa)，进行diff-quik快速染色法评价精子形态。通过以下方法将具有不同活力的精细胞分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力精子细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力精子细胞。收集到的精子经pbs洗两次后，提取基因组dna

2、文库构建与甲基化测序

使用试剂盒从精子细胞中提取基因组dna，用于文库构建。将1μg基因组dna打断成约200-300bp的片段。纯化后将dna片段用t4dna聚合酶、klenow片段和t4多聚核苷酸激酶处理，形成平端的dna片段，将平端dna片段进行3’腺苷化，然后与接头连接，得到文库。对文库定量后，将其用于液相杂交捕获和亚硫酸氢盐测序。

经数据处理分析，我们发现，a组和n组的无论级分a还是级分c的全局dna甲基化水平几乎相等，没有显著差异。但是，在一些区域上，存在a组与n组之间，或者同一组的不同级分之间，存在着甲基化的差异性。

3、差异甲基化区域的鉴定

对上述差异甲基化区域进行分析，我们发现，第12号染色体第52886681-5288938位(参考基因组：grch37/hg19，ucscgenomebrowser)之间的区域存在甲基化水平差异，该区域为krt6a基因的启动子区，覆盖该基因的第-2409至+291位(seqidno:1)。我们的研究显示，该区域内的甲基化水平在n组的级分a与a组的级分a之间具有显著差异。如表1和图1所示，a组级分a的精子中，该区域的甲基化率均处于0.72以上，平均值为0.77，而n组级分a的精子中，该区域的甲基化率大部分处于0.7以下，平均值为0.62。两者之间的平均值差值约为15％，极显著性p值为0.009(<0.01)。因此，我们推测，级分a中的精子在该位点的甲基化水平可作为诊断受试者是否患有弱精症的分子标志物。

表1n组的8个健康人的krt6a基因启动子区的甲基化水平

4、临床验证

我们另外招募了50个健康志愿者和30名弱精症志愿者，收集他们的精液样品，用于临床验证。

通过以下方法将具有不同活力的精细胞分离：在300×g下离心20min，制备非连续密度梯度级分(分为47.5、57、76和95％浓度层)，从95％浓度层(级分a)收集高活力精子细胞，从57％与76％浓度层之间(级分c)收集低活力精子细胞。收集到的精子经pbs洗两次后，提取基因组dna。

设计引物，采用位点特异性亚硫酸氢盐测序(locusspecificbisulfitesequencing，lbs)检测12号染色体第52886681-52889381位之间的区域内的甲基化率。方法如下：

采用ezdnamethylation-directkit(zymoresearch)进行亚硫酸氢盐处理。基因组dna经过99℃变性8min，随后立即加入亚硫酸氢盐溶液于64℃孵育3.5h进行转换；转换后的基因组dna通过回收柱回收后作为模板用于pcr。

采用hotstartaqmastermix(qiagen)进行位点特异性pcr。根据待测区域，分别设计了两对引物(表2)进行扩增和测序，每对引物扩增片段长度在2kb左右，扩增产物经回收后用abi3730测序仪完成，甲基化状态通过比较c-t转换来检测。

表2pcr引物

结果如图2所示，50个健康人级分a的精子该区域的平均甲基化率为0.583，30个弱精症患者级分a的精子该区域的平均甲基化率为0.772，极显著性p值为0.008(<0.01)。根据统计学分析，将该区域的临界甲基化率为0.72。即，当该区域的甲基化率高于0.72时，受试者患弱精症的概率较大。由此可见，krt6a基因的启动子区(-2409至+251位)的甲基化率可用作诊断受试者是否患有弱精症的辅助标准。

需要说明的是，本文中以grch37/hg19作为参考基因组定位相关区域，本领域还有其他参考基因组，对于相关区域的标示可能与本文中不同，但是，只要通过blast等比对工具最终比对到与本研究中所标示区域对应，均应落在本发明的保护范围之内。同样的，本文中虽然仅列出了seqidno:1作为一个实例，但是，本领域技术人员应当清楚，基因组中的序列不是完全保守的，有可能有变异存在，不需要所检测的序列与seqidno:1完全相同，仅需要通过blast等比对工具最终比对到与seqidno:1对应，即可认为落在本发明的保护范围内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>深圳市龙华区人民医院

<120>krt6a基因甲基化在弱精症诊断剂中的应用及试剂盒

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2701

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

cctcccccactgggcggagctctgtctgccccatgctgctgctcagcagagtggctgcaa60

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<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

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<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

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<211>25

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

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