在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用与流程

文档序号：22614878发布日期：2020-10-23 19:14阅读：453来源：国知局

本发明涉及基因工程领域，具体涉及在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法、重组启动子以及应用。

背景技术：

α-淀粉酶是一种内切型淀粉酶，随机切割淀粉、糖原、寡糖或多聚糖分子内部的α-1,4葡萄糖苷键，产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是我国目前用途最广、产量最大的工业酶制剂种类之一，同时也是淀粉工业中最为重要的水解酶之一，广泛应用于淀粉加工、纸浆制造、纺织工业、酒精酿造及饲料加工等领域。α-淀粉酶根据作用的温度不同可分为耐高温α-淀粉酶、中温α-淀粉酶和低温α-淀粉酶三种类型。在淀粉糖工业制备中，由于一般是在105～118℃的高温环境下进行淀粉喷射液化，所以α-淀粉酶的热稳定性对下游产业的应用极为重要，目前，产耐高温α-淀粉酶的菌株主要是芽胞杆菌属的微生物，如地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、凝结芽胞杆菌、嗜热脂肪芽胞杆菌等。

工业上生产α-淀粉酶的主要菌种有解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、米曲霉和黑曲霉，其中，芽孢杆菌是耐高温α-淀粉酶的主要生产菌株。目前，耐高温淀粉酶的生产中还普遍存在发酵酶活力较低，生产成本高等问题。将耐高温淀粉酶进行异源表达是提高耐高温淀粉酶发酵酶活力的有效方法之一。

相对于大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，枯草芽孢杆菌具有以下优点：枯草芽孢杆菌是食品级安全宿主，具有良好的外源蛋白分泌能力，成熟的发酵工艺及生产技术等。但它同时存在以下问题：枯草芽孢杆菌本身会分泌大量蛋白酶，导致外源蛋白的降解；质粒游离表达容易导致发酵后期质粒丢失，菌种发酵不稳定；启动子和信号肽的表达分泌效果不理想。

启动子是基因上游rna聚合酶识别并结合的一段核苷酸序列，它控制基因的转录，进而调节基因的表达。用于枯草芽孢杆菌表达的启动子主要有组成型、诱导型、时期特异型和自身诱导型启动子。目前启动子的改造策略有以下几个方面：(1)从枯草芽孢杆菌或其它近缘芽孢杆菌基因组中挖掘新的优异的启动子，可以通过基因分析，根据基因功能及蛋白表达强弱，预测启动子的强弱及特点，最后通过表达模型酶进行验证。(2)对现有表达较好的启动子进行改造，对其关键区域如-10区、-16区、-35区、up序列和核糖体结合位点(rbs)等进行理性改造，或者通过易错pcr对启动子整个序列进行改造，然后通过高通量筛选改造后酶活较高的启动子序列。(3)构建新型双启动子，根据rna聚合酶σ因子的不同，可以通过构建所结合σ因子相同的两个启动子来强化启动子活性，也可以构建所结合σ因子不同的两个启动子来延长启动子启动时期，进而增强表达。

枯草芽孢杆菌中，有300种自身蛋白可以被分泌到细胞质膜外去执行各种生理功能。枯草芽孢杆菌中有四种类型的分泌途径：最主要的sec分泌途径、tat分泌途径、com分泌途径和abc分泌途径。大多数分泌到质膜外的蛋白都含有一段信号肽去引导这些蛋白的分泌。信号肽大都含有三个特征结构域：n端结构域、h结构域和c端结构域。根据分泌途径的不同，信号肽可以分为四种：sec信号肽、tat信号肽、com信号肽和abc信号肽。用于表达重组蛋白的信号肽通常是sec和tat信号肽。研究表明枯草芽孢杆菌中不同蛋白的最优信号肽不同。尽管众多研究者去寻找其中的规律，目前还没有找到所分泌蛋白和最优信号肽之间的关键联系，因此目前很难通过理性分析去获得一个重组蛋白的最优信号肽，随着基因操作技术和高通量筛选方法的成熟，建立信号肽筛选文库，然后进行高通量筛选成为筛选最优信号肽的有效方法。

技术实现要素：

为了解决上述技术问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是减少枯草芽孢杆菌中蛋白酶对重组耐高温α-淀粉酶的影响，提供了在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温淀粉酶的方法。

本发明的再一目的是提供在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的杂合启动子。

本发明的再一目的是提供能够高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株。

根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法包括以下步骤：

构建蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌bs-vtr，作为表达宿主；

构建包含启动子和信号肽和高温α-淀粉酶基因的重组表达载体；

将上述构建的重组表达在于转入所述蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌中，进行发酵培养，获得耐高温α-淀粉酶。

根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其中，所述启动子为选自地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子和/或来源苏云金杆菌的启动子中的一种或多种启动子。

根据本发明的具体实施方式，所述启动子的核苷酸序列如seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5或seqidno.6所示单启动子中的一种或多种。或者，所述启动子为核苷酸序列如seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19或seqidno.20所示的杂合启动子。

根据本发明的在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的方法，其中，所述信号肽为选自地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽，运输蛋白信号肽，sec分泌通道蛋白信号肽，β-葡聚糖酶信号肽，内切-1,5-α-l-阿拉伯糖苷酶信号肽，和来源地衣芽孢杆菌的几丁质酶信号肽的组中的一种或多种，

根据本发明的具体实施方式，所述信号肽序列如seqidno.7，seqidno.8，seqidno.9，seqidno.10，seqidno.11，seqidno.12，seqidno.13，seqidno.14，seqidno.15或seqidno.16所示信号肽的一种或多种。

因此，本发明提供了在枯草芽孢杆菌中高效表达耐高温α-淀粉酶的高效杂合启动子，所述杂合启动子的核苷酸序列如seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，或seqidno.20所示。

本发明还提供了可以高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株，所述重组菌株包含启动子和信号肽和高温淀粉酶基因的重组表达载体，其中，所述启动子为核苷酸序列如seqidno.1，seqidno.2，seqidno.3，seqidno.4，seqidno.5或seqidno.6所示单启动子，或者，所述启动子为核苷酸序列如seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19或seqidno.20所示的杂合启动子，所述信号肽的核苷酸序列如seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，或seqidno.20所示。

根据本发明的高效表达耐高温α-淀粉酶的重组菌株，所述重组菌株为重组枯草芽孢杆菌，即以构建的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌bs-vtr为宿主，分别组合优化了一系列的启动子和信号肽，得到高效表达高温α-淀粉酶的重组枯草芽孢杆菌。

本发明提供了一系列能高效表达耐高温α-淀粉酶的组合启动子和信号肽，相对于对照启动子和信号肽组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α-淀粉酶相对酶活均有一定的提高，杂合启动子与不同信号肽组合的高温α-淀粉酶酶活力提高幅度更大，为工业化生产耐高温α-淀粉酶奠定了基础。

附图说明

图1为根据本发明的具体实施方式的表达载体puc-vtr结构示意图；

图2为敲除整合载体puc-ats结构示意图。

具体实施方式

以下实施例中未做特殊说明的分子生物学实验操作均参照j.萨姆布鲁克的《分子克隆实验指南》(第三版)一书进行，或者按照所购试剂的说明书进行，所述实验材料或试剂如无特殊说明均可从商业途径获取。

根据本发明的具体实施方式，以构建好的蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌bs-vtr为宿主菌，以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶为报告基因，以表达元件启动子p43+碱性蛋白酶信号肽s碱为对照组，分别组合优化启动子和信号肽。

所用启动子包括地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子p地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子p中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子p碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子p枯，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子p解，或来源苏云金杆菌的启动子p苏，所述启动子的序列如seqidno.1--seqidno.6所示。

所用信号肽包括地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽s地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽s中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽s碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽s淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽s解，某运输蛋白信号肽s运，某sec分泌通道蛋白信号肽s分，β-葡聚糖酶信号肽s葡，内切-1,5-α-l-阿拉伯糖苷酶信号肽s阿，或来源地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽s几，所述信号肽序列如seqidno.7--seqidno.16所示。

得到一系列优化后的启动子和信号肽组合，其分泌表达效率是对照组p43+s碱的100％-300％。

进一步，以p地、p中、p碱、p枯、p解、p苏6种不同启动子为模板，构建一批杂合启动子，进一步提高耐高温α-淀粉酶的分泌表达量，所得到杂合启动子为对照组(p43+s碱)的300％-600％。杂合启动子序列如seqidno.17，seqidno.18，seqidno.19，seqidno.20所示。

具体地，seqidno.1:p地，seqidno.2:p中，seqidno.3:p碱，seqidno.4:p枯，seqidno.5:p解，seqidno.6:p苏，seqidno.7:s地，seqidno.8:s中，seqidno.9:s碱，seqidno.10:s淀，seqidno.11:s解，seqidno.12:s运，seqidno.13:s分，seqidno.14:s葡，seqidno.15:s阿，seqidno.16:s几，seqidno.17：p1，seqidno.18：p2，seqidno.19：p3，seqidno.20：p4，seqidno.212。

根据本发明的技术方案，所述耐高温α-淀粉酶可以为来自地衣芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，古菌pyrococcus、热球菌；furiosus等来源的高温α-淀粉酶。

实施例1、启动子和信号肽的克隆获取及重组载体的构建

分别设计引物扩增得到相应的启动子和信号肽，其中，启动子包括：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶启动子p地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶启动子p中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶启动子p碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子p枯，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶启动子p解，和来源苏云金杆菌的启动子p苏，启动子的序列如seqidno.1至seqidno.6所示。得到的信号肽包括：地衣芽孢杆菌耐高温α-淀粉酶信号肽s地，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶信号肽s中，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶信号肽s碱，枯草芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽s淀，解淀粉芽孢杆菌中温α-淀粉酶信号肽s解，某运输蛋白信号肽s运，某sec分泌通道蛋白信号肽s分，β-葡聚糖酶信号肽s葡，内切-1,5-α-l-阿拉伯糖苷酶信号肽s阿，和来源地衣芽孢杆菌几丁质酶信号肽s几，所述信号肽序列如seqidno.7至seqidno.16所示。

本实施例中，所使用的高温α-淀粉酶基因如seqidno.21所示。

采用重叠pcr方法，将不同启动子，信号肽和来源于嗜热芽孢杆菌的高温α-淀粉酶基因amys融合至一起后，连接至公司前期构建好的表达载体puc-vtr框架上，得到相应的重组载体，通过电转化方式将其转化至相应的表达宿主bs-vtr，挑取转化子于lb培养基中，37℃，200rpm后测定发酵液上清中高温α-淀粉酶活力，酶活测定参照国标gb/t24401-2009进行。

根据酶活测定结果，得到有效的启动子和信号肽组合，不同组合对耐高温α-淀粉酶的表达如表1所示，由表1可知，相对于p43+s碱组合，所有优化后的启动子与信号肽组合的耐高温α-淀粉酶相对酶活均有一定的提高。其中p解+s碱组合相对酶活力最高为对照组的292％，其次为p中+s淀，相对酶活达269％。

表1

实施例2、杂合启动子的构建及筛选

为进一步提高耐高温α-淀粉酶的表达量，组合优化筛选了一批杂合启动子，分别以强启动子p碱、p地、p解、p枯、p中和p苏进行了不同组合，分别筛选得到了四个高表达耐高温α-淀粉酶的杂合启动子，分别命名为p1，p2，p3，p4，其中p1由p碱+p中+p解组合而成；p2由p地+p枯+p苏组合而成；p3由p地+p解+p苏组合而成；p4由p枯+p解+p碱组合而成，这4个杂合启动子序列如seqidno:17至seqidno:20所示。杂合启动子与不同信号肽组合的高温α-淀粉酶酶活力如表2所示，发酵酶活力均有一定幅度的提高。

表2：

从上述表中结果可知：

(1)通过不同启动子组合相较于对照均有较大幅度的提高，表明通过组合不同启动子进行串联表达相较于单一启动子而言可有效提高表达量；

(2)同时在相同启动子的条件下，不同的信号肽对菌体胞外分泌高温淀粉酶能力亦有显著不同，其中组合p4+s碱对高温淀粉酶的表达分泌能力最强，是对照组的588％，其次p2+s碱和p3+s分提升效果亦十分显著。

(3)同时，发现杂合启动子p1和p3分别与s碱，s淀，s几进行组合时，本实验中的高温淀粉酶的表达分泌量相较于其它组合而言，并没有显著提升。通过组合上述启动子和信号肽，与考cn201710032183.9的技术方案相比(本发明的p1为p碱+p中+p解，相当于普鲁兰酶的杂合强启动子p4；p3为p地+p解+p苏，相当于普鲁兰酶的杂合强启动子p2)，发现本申请的杂合启动子p1和p3对普鲁兰酶的分泌表达有显著提升作用，对比实验结果表明，不同组合的启动子和信号肽对不同的外源蛋白分泌表达亦有显著不同，可能与外源分泌蛋白的分子结构有关。

实施例3、耐高温α-淀粉酶整合型枯草芽孢杆菌的构建

将实施例2获得的杂合启动子和信号肽的组合、耐高温α-淀粉酶基因以及部分中温淀粉酶序列作为上下游同源臂，融合插入到构建好的敲除整合载体puc-ats，构建重组整合载体。由于枯草芽孢杆菌自身具有较强的同源整合效率，有研究表明一般具有200-300bp的同源区，即可使枯草芽孢杆菌发生较高效率的重组，一般随着同源臂的加长，整合效率更高，为此我们选取了整合宿主中约500bp的中温淀粉酶核酸序列作为上下游同源，部分整合序列如seqidno.22所示。采用电转化方法将上述重组整合载体转化至表达宿主bs-vtr，采用卡那霉素抗性筛选阳性转化子，接着，通过45℃培养，同时添加相应的卡那霉素抗性，使重组质粒载体的复制子失活，筛选出重组载体整合至宿主基因组上的单交换重组工程菌。

将构建好的单交换重组菌，进行无抗传代培养，连续传代12次左右，进行点板实验，将在抗性平板上不长，无抗平板上生长的转化子初步确定为已进行双交换整合的工程菌，提取初步确定整合的双交换工程菌基因组，进行pcr扩增，测序，最终确定为相应的耐高温α-淀粉酶双交换整合型菌株。

序列表

<110>广东溢多利生物科技股份有限公司

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