专利名称:肝癌易感基因分型检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种核酸分型检测产品，具体的说，涉及一种用于检测肝癌易感基因 分型的试剂盒，并公开了其使用方法。
背景技术：
肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道 而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人， 占全世界肝癌死亡人数的45%。
肝癌的发生与基因有密切关系，例如半胱氨酸9、停泊蛋白2等，这些基因变化将 会改变个体患肝癌的风险。高发病率、高死亡率和与基因之间的关系，使得人们对于肝癌易 感基因的分型研究产生了巨大的动力。
最早常用的分型技术是southern杂交，这种技术实验设备要求比较简单，但是过 程却十分复杂，涉及到大量的试剂，容易出现错误，可控性比较差。到了 80年代，随着内切 酶技术的进步，HFLP技术成了主流的分型方式，这种方法利用内切酶的酶切反应代替了杂 交反应，使得实验过程被大大简化，实验的重复性得到提高。但是这种方法有一个缺陷，分 型过于依赖内切酶的种类和数量，当两种基因型的差别不足以引起已知内酶切的酶切位点 的改变，就会导致分型失败。如公开号为的专利CN101078027，公开了一种与肝癌相关的 ESR1基因多态性检测方法，其中就用到了酶切技术进行基因分型检测。不过随着PCR技术 的发展，这个问题得到了很好的解决，特异性PCR技术加上荧光显色技术成为了现在比较 常见的分型方式，操作简单、分型准确。随着人类基因组计划的完工，这种技术在肝癌的分 型应用上越来越显得疲惫了，因为肝癌是一种多基因疾病，涉及到很多易感基因，而这种技 术的通量较低，耗时多，费用高。
现在主力研究的肝癌易感基因分型技术是芯片技术，这种技术是利用生物基因芯 片，结合PCR技术和计算机技术，同时优化了 southern技术中的杂交反应，提高效率、固化 条件、简化过程，从而很好地避免了内切酶的限制和特异性PCR的低效，最后结果通过计算 机分析，能够客观准确。
发明内容
本发明提供一种用于肝癌易感基因分型检测的试剂盒，包括基因芯片，扩增液和 聚合酶，所述的扩增液包含多重引物，各引物的长度为15_30bp，根据碱基配对的原则设计， 位于各基因型突变位点所在核酸序列位置的上游或下游。
所述的多重引物共34对，其相应序列如下
1、扩增位点EGFL31的引物
Primer1 5-AGACAAGGAGGACGTGGAG-3，
Primer2 5-ATGGTGGGACCTGCGACT-3 ；
2、扩增位点EGFL3 II III的引物
5[0012]Primer3 5-CATGAAAGGAAAGGGTGCC-3，
Primer4 5-AGGACACCGCTTCCCACA-3 ;
3、扩增位点TP73的引物
Primer5 5-AAGACATGCCCCATCCAGAT-3，
Primer6 5-ACGTGCTCCGCTTTCTTGT-3 ；
4、扩增位点EN01 I II的引物
Primer7 5-GGGCGTCATGGTGTCTCA-3，
Primer8 5-CCAGGTCAGCGATGAAGGTAT-3 ；
5、扩增位点TNFRSFB I II的引物
Primer9 5-TTCCTGACCAAGCCTCCTC-3，
Primer10 5-CCATTGGGAGCAGGAAGG-3 ；
6、扩增位点MASP2 I II的引物
Primer11 5-GACATTGACGAGTGCCAGGT-3，
Primer12 5-CGGCAGGAGCAGTAGAAACC-3 ；
7、扩增位点CASP91的引物
Primer13 5-TGGAAGAGCTGCAGGTGGA-3，
Primer14 5-GTCCTCGATCATATGGGGC-3 ；
8、扩增位点CASP9 II的引物
Primer15 5-GCGAACTAACAGGCAAGCAG-3，
Primer16 5-TCTGGGTGTTTCCGGTCTG-3 ；
9、扩增位点CASP9 III IV的引物
Primer17 5-GCCACTGCCTCATTATCAACA-3，
Primer18 5-GCCCTTCACCTCCACCAT-3 ；
10、扩增位点TOR I II的引物
Primer19 5-GCCCACCTCTCACTCTACTTC-3,
Primer20 5-CTGATCTCCCAGGCGTCC-3 ；
11、扩增位点SEPm的引物
Primer21 5-GCTTCTGGTGGGACGAGTTC-3，
Primer22 5-GGCATCAGGAGTGTGCAAC-3 ；
12、扩增位点E2F2 I II的引物
Primer23 5-GAATGTTTGAAGACCCCACCA-3，
Primer24 5-ACCCAGGAAGGAAGAAACAGAT-3 ；
13、扩增位点PINK1的引物
Primer25 5-CATCTAAGCCTCTGGGGTGAA-3，
Primer26 5-CAGCCAACCATCTTGTCTAACTT-3 ；
14、扩增位点SI￥N1 I的引物
Primer27 5-GAAGTGCGGAAGAACAAAGAAT-3，
Primer28 5-GGGATGGGGAGAAAGTCAGT-3 ；
15、扩增位点STMN1 II的引物[0051]Primer29 5-CAGAAGGCAATAGAAGAGAACAAC-3，
Primer30 5-CGGTTCTCTTTATTAGCTTCCATT-3 ；
16、扩增位点MUTYH I的引物
Primer31 5-GCCTCCCTCCTTCCATTTT-3，
Primer32 5-TGTCACTGGGCTGCACTGAA-3 ；
17、扩增位点MUTYH II的引物
Primer33 5-GCCCTCACCTCCCTGTCTT-3，
Primer34 5-CAAGTGGGTCTGTAAGCAATCAA-3 ；
18、扩增位点MUTYH III IV的引物
Primer 355-GATCTCCCTTCCCAGCTCC-3,
Primer36 5-GAATGGAGGGAATCGGCAG-3 ；
19、扩增位点MUTYH V的引物
Primer37 5-TTCCGAGGGAGCCTGCTAA-3，
Primer38 5-GAAGACGGGCAGAAGAGGT-3 ；
20、扩增位点MUTYH VI的引物
Primer39 5-ATGAGGAAGCCACGAGCAG-3，
Primer40 5-ACCGACGGACGAAGGACA-3 ；
21、扩增位点JUN的引物
Primer41 5-ATCGCTGCCTCCAAGTGC-3，
Primer42 5-GCTGTGCCACCTGTTCCCT-3 ；
22、扩增位点THEAI II的引物
Primer43 5-CTGGTAGAGAAGCCCAAACACT-3，
Primer44 5-CCTTGTGCTATTTCAGGAGACTT-3 ；
23、扩增位点THEA III的引物
Primer45 5-GAGGCAGGACCAGCTCCACA-3，
Primer46 5-CGTTCCCTCCCTTATCCCAT-3 ；
24、扩增位点THEA IV的引物
Primer47 5-GCCTCGGAAGTGGAACA-3，
Primer48 5-GGCATTCCTTCTGTCTC-3 ；
25、扩增位点GSTM1 I II的引物
Primer49 5-CCTTATTTGTCCTCTTTCCTTGC-3，
Primer50 5-CGTGAACTCGGGTGTACCT-3 ；
26、扩增位点PHGDH 的引物
Primer51 5-CACTGGTGTCAGATGGGGAG-3，
Primer52 5-AGGTTAGAAGTGGAACTGGAAGG-3 ；
27、扩增位点DEFB1 I II III的引物
Primer53 5-CAATCATTGGGCCAATTTCTT-3，
Primer54 5-CTGCGTCATTTCTTCTGGTCA-3 ；
28、扩增位点MTMR9 的引物
7[0090]Primer55 5-AGCAACTGCTGTTGAATTTTCA-3，
Primer56 5-GCACCTCCTCCCGTTTGT-3 ；
29、扩增位点FDFT1的引物
Primer57 5-TGGACCAGGACTCGCTCAG-3，
Primer58 5-CAGCGCCTGGATTAACAGC-3 ；
30、扩增位点NAT 1 I II的引物
Primer59 5-ACATTGTCGATGCTGGGTTT-3，
Primer60 5-CTGTTCCCTTCTGATTTGGTCTA-3 ；
31、扩增位点D0K2的引物
Primer61 5-GCCTCCAGCATGTCCAGC-3，
Primer62 5-GTACTTTGGGCCTTTCTTTAG-3
32、扩增位点EPHX2 I II的引物
Primer63 5-CACCGGGAGGAGCAGATG-3，
Primer64 5-GAGGGAAGCAAAGAGGGAGTAT-3 ；
33、扩增位点ADRB3的引物
Primer65 5-CTTTCCGCCCGAGGAGTCT-3，
Primer66 5-TTCCCGGAGAGGCAGGAG-3 ；
34、扩增位点BNIP3L的引物
Primer67 5-TACCATCCTCATCCTCCATCC-3，
Primer68 5-CTCTGTCCTGATTCATGTTGTGC-3。
一种使用上述试剂盒的方法，包括扩增检测样本，和用基因芯片进行反应检测，所 述的样本扩增步骤为梯度降温扩增。
本发明应用生物易感基因分析原理，结合PCR技术和计算机技术，同时优化了 southern技术中的杂交反应，提高效率、固化条件、简化过程，从而很好地避免了内切酶的 限制和特异性PCR的低效；最后结果通过计算机分析，能够客观准确地进行多个肝癌易感 性基因的分析。
具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员 常规采用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂 商所建议的步骤和条件。
实施例1:引物合成
向生物寡核苷酸链合成公司(生工)定制
发明内容
中所提及的引物。
实施例2:制作基因芯片
(1)探针准备
将探针用3X的柠檬酸缓冲液(SSC)统一配制成1500nM终浓度，4°C密封保存。探 针可用申请号200910203530. 5中所述基因芯片所用序列。
(2)玻片准备[0120]1、将玻片垂直放置在玻璃架上，然后把架子放在玻璃缸内。
2、用50克NaOH溶解于200ml去离子水，再加上300ml 95%乙醇(不要用100% 的乙醇)，配制500ml的碱性洗液，把玻片完全浸没在洗液中至少2个小时。
3、用去离子水全面冲洗浸泡过的箔片5次，最后在去离水中完全浸没摇洗5分钟。
4、用35ml多聚L赖氨酸(poly-L-lysine) ,35ml灭菌过滤的PBS和280ml的去离 子水配制350ml修饰液。
5、将第三步中玻片洗净以后迅速放入修饰液中，轻轻摇动1小时，注意减少暴露 在空气中的时间。
6、把修饰处理过的玻片插进一个装有干净去离子水的缸中，上下抽动5次，把玻 片转移到一个低速离心机中，旋转是玻片干燥，5分钟。用铝箔包裹干燥的玻片，防止灰尘， 放进真空干燥炉中，45°C，10分钟。室温密封保存，一般在一个月以后使用。
(3)芯片制备
1、将样本放置于96孔板中，用基因芯片点样仪，每针吸装lul探针，把探针点在多 聚L赖氨酸处理过的玻片，点样量为5nl，每组探针点在相邻位置，便于观察。
2、用玻片水合舱和金属加热板对玻片进行再次水合化和快速干燥的处理。将玻片 的点样面对着水蒸气5-15秒，然后点样面背着加热器5秒。
3、UV交联。用紫外线是DNA交联到玻片上，照射能量为60mJ。
4、配置封闭液。将6克丁二酸酐放入3-甲基-2-吡咯烷酮溶液中，定容335ml，再 加入15ml 1M的硼酸钠溶液。
5、迅速把第三步完成的玻片浸没于封闭液中，15分钟。结束以后把玻片放入刚沸 过的水中，晃动3-5次，浸没2分钟。然后将玻片放入95%的乙醇中，上下提拉3-5次，离心思干。
实施例3:试剂盒制备
(1)扩增液配制
以 25ml (灭菌双蒸水 18. 5ul, lOxPCR buffer 2. 5ul)缓冲液，引物(10umol/L，上 游下游各lul)2ul，dNTP(10mmol/L，dTTP Dig-dUTP = 10 1)，按前述比例配制成扩增 液。体系中的引物为lOumol/L指的是
发明内容
中包括的所有引物各自的浓度均达到这个 水平。
(2) Taq 酶(聚合酶)(2U/ul)(购自 TAKARA)。
实施例4 检测基因的扩增和标记
(1) 口腔粘膜细胞的DNA提取
1、将粘有口腔粘膜细胞的棉签头放入装有lml 10% SDS的离心管中，充分浸润。 加入50ul的蛋白酶K，37°C保温1-2小时，加入lml 5mol/L的NaCl，混勻，5000rpm，离心数秒。
2、取上清液于新离心管，用等体积酚氯仿异戊醇(25 24 1)抽提。待分 层后，3000rpm离心5分钟。
3、取上层水相至干净离心管，加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。移去上 层乙醚，保留下层水相。
4、加1/10体积3mol/LNaAc，及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止
910分钟，离心弃上清。
5、用70%乙醇中漂洗沉淀，离心弃上清，重复一次。放入烘箱内数分钟将剩余的酒 精除去，用50ulTE溶解DNA，-20°C保存。
(2)基因扩增
1、以 25ml (灭菌双蒸水 18. 5ul，IOxPCR buffer 2. 5ul)，引物(10umol/L，上游 下游各 lul) 2ul，dNTP(10mmol/L, dTTP Dig-dUTP =10 1)，Taq 酶(聚合酶)(2U/ ul)0. 5ul，配成含聚合酶的扩增液，加入DNA样品Iul组成多重PCR体系，扩增目的基因。体 系中的引物为lOumol/L指的是
发明内容
中包括的所有引物各自的浓度均达到这个水平。
2、扩增条件94°C 5分钟预变性；94°C 30秒，64°C 30秒，72°C 30秒，5个循环； 940C 30 秒，61°C 30 秒，72°C 30 秒，5 个循环；94°C 30 秒，58°C 30 秒，72°C 30 秒，5 个循 环；94°C 30秒，550C 30秒，72°C 30秒，30个循环；72°C延伸10分钟。
实施例5 杂交反应与检测结果
(1)点样杂交
配制杂交液，包括0.02 % SDS、5XSSC、50 %去离子甲酰胺、0. 1 % N-laurysarosine,50mmol · L-I 磷酸钠、pH 7. 0、2%封闭剂。
用移液枪将2ul Dig标记的PCR产物吸加到IOul杂交液中，95°C预变性2分钟， 然后在冰上冷却5分钟。将待杂交混合液置于芯片上的探针区域，并盖上盖玻片(防止水 分在杂交过程中蒸发)，置于42°C的杂交炉内1. 5小时。
杂交后小心拿出玻片，浸入盛有洗液1(2 X SSC，0. 1% SDS)的玻片槽，玻片点样面 朝下，保证芯片阵列区的安全，将玻片在洗液中晃动2-3次，移入盛有洗液2 (1 X SSC)的玻 片槽中，轻柔地摇晃玻片槽2-3分钟，再将玻片移入盛有洗液3(0. 2xSSC)2分钟，然后离心 甩干玻片。实验过程均应在室温。
(2)显色
6mg 二氨基联苯胺(DAB)溶于IOmlTBS (0. 05M ρΗ7· 6)，再加入0. Iml浓度为3 %的 H2O2，过滤掉沉淀物，配制成显色液。取Iml显色液，控制显色时间10-15分钟，然后用IxPBS 溶液清洗，终止反应。最后通过基因芯片扫描仪，读取芯片上的信息。
(3)结果判断
利用计算机进行灰度值分析，同组探针中，如果第一个探针和第二个探针的杂交 信号比值< 0. 33，基因型为第二种探针对应的纯合型；大于3. 0，基因型为第一种探针对应 得纯合型；1. 5到0. 67，基因型为杂合型；其余情况视为实验失败，重复实验。
序列表
<110>上海裕隆基因科技中心有限公司
<120>肝癌易感基因分型检测试剂盒
<160>68
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
10[0164]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EGFL3分型位点的DNA引物，命名为Primerl。
<400>1
agacaaggag gacgtggag 19
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EGFL3分型位点的DNA引物，命名为Primer2。
<400>2
atggtgggac ctgcgact 19
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EGFL3分型位点的DNA引物，命名为Primer3。
<400>3
catgaaagga aagggtgcc 19
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EGFL3分型位点的DNA引物，命名为Primer4。
<400>4
aggacaccgc ttcccaca 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因TP73分型位点的DNA引物，命名为Primer5。
<400>5[0198]aagacatgcc ccatccagat 20
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因TP73分型位点的DNA引物，命名为Primer6。
<400>6
acgtgctccg ctttcttgt 19
<210>7
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因ENOl分型位点的DNA引物，命名为Primer7。
<400>7
gggcgtcatg gtgtctca 18
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因ENOl分型位点的DNA引物，命名为Primer8。
<400>8
ccaggtcagc gatgaaggtat 21
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因TNFRSFB分型位点的DNA引物，命名为Primer9。
<400>9
ttcctgacca agcctcctc 19
<210>10
<211>18
12[0233]<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因TNFRSFB分型位点的DNA引物，命名为PrimerlO。
<400>10[0238]ccattgggag caggaagg 18[0239]<210>11[0240]<211>20[0241]<212>DNA[0242]<213>人工序列[0243]<220>[0244]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基因 MASP2分型位点的DNA引物，命名为Primerl 1。[0245]<400>11[0246]gacattgacg agtgccaggt 20[0247]<210>12[0248]<211>20[0249]<212>DNA[0250]<213>人工序列[0251]<220>[0252]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基因 MASP2分型位点的DNA引物，命名为Primerl2。[0253]<400>12[0254]cggcaggagc agtagaaacc 20[0255]<210>13[0256]<211>19[0257]<212>DNA[0258]<213>人工序列[0259]<220>[0260]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基因 CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl3。[0261]<400>13[0262]tggaagagct gcaggtgga 19[0263]<210>14[0264]<211>19[0265]<212>DNA[0266]<213>人工序列[0267]<220>[0268]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl4。
<400>14
gtcctcgatc atatggggc 19
<210>15
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl5。
<400>15
gcgaactaac aggcaagcag 20
<210>16
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl6。
<400>16
tctgggtgtt tccggtctg 19
<210>17
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl7。
<400>17
gccactgcct cattatcaac a 21
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因CASP9分型位点的DNA引物，命名为Primerl8。
<400>18[0302]gcccttcacc tccaccat18
<210>19
<211 >21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因TOR分型位点的DNA引物，命名为Primerl9。
<400>19
gcccacctct cactctactt c 21
<210>20
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因FGR分型位点的DNA引物，命名为Primer20。
<400>20
ctgatctccc aggcgtcc18
<210>21
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因SEPm分型位点的DNA引物，命名为Primer21。
<400>21
gcttctggtg ggacgagttc 20
<210>22
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因SEPm分型位点的DNA引物，命名为Primer22。
<400>22
ggcatcagga gtgtgcaac 19
<210>23
<211>21[0337]<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因E2F2分型位点的DNA引物，命名为Primer23。
<400>23
gaatgtttga agaccccacc a 21
<210>24
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因E2F2分型位点的DNA引物，命名为Primer24。
<400>24
acccaggaag gaagaaacag at 22
<210>25
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因PINKl分型位点的DNA引物，命名为Primer25。
<400>25
catctaagcc tctggggtga a21
<210>26
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因PINKl分型位点的DNA引物，命名为Primer26。
<400>26
cagccaacca tcttgtctaa ctt 23
<210>27
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>[0372]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因STMNl分型位点的DNA引物，命名为Primer27。
<400>27
gaagtgcgga agaacaaaga at 22
<210>28
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因STMNl分型位点的DNA引物，命名为Primer28。
<400>28
gggatgggga gaaagtcagt20
<210>29
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因STMNl分型位点的DNA引物，命名为Primer29。
<400>29
cagaaggcaa tagaagagaa caac 24
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因STMNl分型位点的DNA引物，命名为Primer30。
<400>30
cggttctctt tattagcttc catt 24
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer31。
<400>3119
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer32。
<400>32
tgtcactggg ctgcactgaa20
<210>33
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer33。
<400>33
gccctcacct ccctgtctt19
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer34。
<400>34
caagtgggtc tgtaagcaat caa 23
<210>35
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer35。
<400>35
gatctccctt cccagctcc19
<210>36
<211>19
18[0441]<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer36。
<400>36
gaatggaggg aatcggcag19
<210>37
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer37。
<400>37
ttccgaggga gcctgctaa19
<210>38
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer38。
<400>38
gaagacgggc agaagaggt 19
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer39。
<400>39
atgaggaagc cacgagcag 19
<210>40
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
19[0476]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MUTYH分型位点的DNA引物，命名为Primer40。
<400>40
accgacggac gaaggaca 18
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因JUN分型位点的DNA引物，命名为Primer41。
<400>41
atcgctgcct ccaagtgc 18
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因JUN分型位点的DNA引物，命名为Primer42。
<400>42
gctgtgccac ctgttccct19
<210>43
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer43。
<400>43
ctggtagaga agcccaaaca ct 22
<210>44
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer44。
<400>44[0510]ccttgtgcta tttcaggaga ctt 23
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer45。
<400>45
gaggcaggac cagctccaca20
<210>46
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer46。
<400>46
cgttccctcc cttatcccat 20
<210>47
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer47。
<400>47
gcctcggaag tggaaca17
<210>48
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因THEA分型位点的DNA引物，命名为Primer48。
<400>48
ggcattcctt ctgtctc17
<210>49
<211>23[0545]<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因GSTMl分型位点的DNA引物，命名为Primer49。
<400>49
ccttatttgt cctctttcct tgc 23
<210>50
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因GSTMl分型位点的DNA引物，命名为Primer50。
<400>50
cgtgaactcg ggtgtacct 19
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因PHGDH分型位点的DNA引物，命名为Primer51。
<400>51
cactggtgtc agatggggag 20
<210>52
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因PHGDH分型位点的DNA引物，命名为Primer52。
<400>52
aggttagaag tggaactgga agg 23
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
22[0580]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因DEFBl分型位点的DNA引物，命名为Primer53。
<400>53
caatcattgg gccaatttct t 21
<210>54
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因DEFBl分型位点的DNA引物，命名为Primer54。
<400>54
ctgcgtcatt tcttctggtc a 21
<210>55
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MTMR9分型位点的DNA引物，命名为Primer55。
<400>55
agcaactgct gttgaatttt ca 22
<210>56
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因MTMR9分型位点的DNA引物，命名为Primer56。
<400>56
gcacctcctc ccgtttgt18
<210>57
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因FDFTl分型位点的DNA引物，命名为Primer57。
<400>57[0614]tggaccagga ctcgctcag19
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因FDFTl分型位点的DNA引物，命名为Primer58。
<400>58
cagcgcctgg attaacagc19
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因NATl分型位点的DNA引物，命名为Primer59。
<400>59
acattgtcga tgctgggttt20
<210>60
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因NATl分型位点的DNA引物，命名为Primer60。
<400>60
ctgttccctt ctgatttggt cta 23
<210>61
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因D0K2分型位点的DNA引物，命名为Primer61。
<400>61
gcctccagca tgtccagc18
<210>62
<211>21[0649]<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因D0K2分型位点的DNA引物，命名为Primer62。
<400>62
gtactttggg cctttcttta g 21
<210>63
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EPHX2分型位点的DNA引物，命名为Primer63。
<400>63
caccgggagg agcagatg18
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因EPHX2分型位点的DNA引物，命名为Primer64。
<400>64
gagggaagca aagagggagt at 22
<210>65
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因ADRB3分型位点的DNA引物，命名为Primer65。
<400>65
ctttccgccc gaggagtct19
<210>66
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>[0684]<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因ADRB3分型位点的DNA引物，命名为Primer66。
<400>66
ttcccggaga ggcaggag18
<210>67
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因BNIP3L分型位点的DNA引物，命名为Primer67。
<400>67
taccatcctc atcctccatc c 21
<210>68
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作检测肝癌易感基 因BNIP3L分型位点的DNA引物，命名为Primer68。
<400>68
ctctgtcctg attcatgttg tgc 23
权利要求
一种肝癌易感基因分型检测试剂盒，包括基因芯片，扩增液和聚合酶，其特征在于所述的扩增液包含多重引物，各引物的长度为15 30bp，根据碱基配对的原则设计，位于各位点所在核酸序列位置的上游或下游。
2.如权利要求
1所述的试剂盒，其特征在于所述的多重引物的序列如下[1、扩增位点EGFL3I的引物 Primerl 5-AGACAAGGAGGACGTGGAG-3， Primer2 5-ATGGTGGGACCTGCGACT-3 ；[2、扩增位点EGFL3II III的引物 Primer3 5-CATGAAAGGAAAGGGTGCC-3， Primer4 5-AGGACACCGCTTCCCACA-3 ；[3、扩增位点TP73的引物Primer5 5-AAGACATGCCCCATCCAGAT-3， Primer6 5-ACGTGCTCCGCTTTCTTGT-3 ；[4、扩增位点ENOlI II的引物 Primer7 5-GGGCGTCATGGTGTCTCA-3， Primer8 5-CCAGGTCAGCGATGAAGGTAT-3 ；[5、扩增位点TNFRSFBI II的引物 Primer9 5-TTCCTGACCAAGCCTCCTC-3， PrimerlO 5-CCATTGGGAGCAGGAAGG-3 ；[6、扩增位点MASP2I II的引物 Primerll 5-GACATTGACGAGTGCCAGGT-3， Primer12 5-CGGCAGGAGCAGTAGAAACC-3 ；[7、扩增位点CASP9I的引物 Primer13 5-TGGAAGAGCTGCAGGTGGA-3， Primer14 5-GTCCTCGATCATATGGGGC-3 ；[8、扩增位点CASP9II的引物 Primer15 5-GCGAACTAACAGGCAAGCAG-3， Primer16 5-TCTGGGTGTTTCCGGTCTG-3 ；[9、扩增位点CASP9III IV的引物 Primer17 5-GCCACTGCCTCATTATCAACA-3， Primer18 5-GCCCTTCACCTCCACCAT-3 ；[10、扩增位点TORI II的引物 Primer19 5-GCCCACCTCTCACTCTACTTC-3， Primer20 5-CTGATCTCCCAGGCGTCC-3 ；[11、扩增位点SEPNl的引物 Primer21 5-GCTTCTGGTGGGACGAGTTC-3， Primer22 5-GGCATCAGGAGTGTGCAAC-3 ；[12、扩增位点E2F2I II的引物 Primer23 5-GAATGTTTGAAGACCCCACCA-3，Primer24 5-ACCCAGGAAGGAAGAAACAGAT-3 ；13、扩增位点PINKl的引物 Primer25 5-CATCTAAGCCTCTGGGGTGAA-3, Primer26 5-CAGCCAACCATCTTGTCTAACTT-3 ；14、扩增位点STMNlI的引物 Primer27 5-GAAGTGCGGAAGAACAAAGAAT-3， Primer28 5-GGGATGGGGAGAAAGTCAGT-3 ；15、扩增位点SI￥N1II的引物 Primer29 5-CAGAAGGCAATAGAAGAGAACAAC-3， Primer30 5-CGGTTCTCTTTATTAGCTTCCATT-3 ；16、扩增位点MUTYHI的引物 Primer31 5-GCCTCCCTCCTTCCATTTT-3， Primer32 5-TGTCACTGGGCTGCACTGAA-3 ；17、扩增位点MUTYHII的引物 Primer33 5-GCCCTCACCTCCCTGTCTT-3， Primer34 5-CAAGTGGGTCTGTAAGCAATCAA-3 ；18、扩增位点MUTYHIII IV的引物 Primer35 5-GATCTCCCTTCCCAGCTCC-3， Primer36 5-GAATGGAGGGAATCGGCAG-3 ；19、扩增位点MUTYHV的引物 Primer37 5-TTCCGAGGGAGCCTGCTAA-3， Primer38 5-GAAGACGGGCAGAAGAGGT-3 ；20、扩增位点MUTYHVI的引物 Primer39 5-ATGAGGAAGCCACGAGCAG-3， Primer40 5-ACCGACGGACGAAGGACA-3 ；21、扩增位点JUN的引物 Primer41 5-ATCGCTGCCTCCAAGTGC-3， Primer42 5-GCTGTGCCACCTGTTCCCT-3 ；22、扩增位点THEAI II的引物 Primer43 5-CTGGTAGAGAAGCCCAAACACT-3， Primer44 5-CCTTGTGCTATTTCAGGAGACTT-3 ；23、扩增位点THEAIII的引物 Primer45 5-GAGGCAGGACCAGCTCCACA-3， Primer46 5-CGTTCCCTCCCTTATCCCAT-3 ；24、扩增位点THEAIV的引物 Primer47 5-GCCTCGGAAGTGGAACA-3， Primer48 5-GGCATTCCTTCTGTCTC-3 ；25、扩增位点GSTMlI II的引物 Primer49 5-CCTTATTTGTCCTCTTTCCTTGC-3，Primer50 5-CGTGAACTCGGGTGTACCT-3 ；·26、扩增位点PHGDH的引物 Primer51 5-CACTGGTGTCAGATGGGGAG-3， Primer52 5-AGGTTAGAAGTGGAACTGGAAGG-3 ；·27、扩增位点DEFBlI II III的引物 Primer53 5-CAATCATTGGGCCAATTTCTT-3, Primer54 5-CTGCGTCATTTCTTCTGGTCA-3 ；·28、扩增位点MTMR9的引物 Primer55 5-AGCAACTGCTGTTGAATTTTCA-3, Primer56 5-GCACCTCCTCCCGTTTGT-3 ；·29、扩增位点FDFTl的引物 Primer57 5-TGGACCAGGACTCGCTCAG-3， Primer58 5-CAGCGCCTGGATTAACAGC-3 ；·30、扩增位点NATlI II的引物 Primer59 5-ACATTGTCGATGCTGGGTTT-3， Primer60 5-CTGTTCCCTTCTGATTTGGTCTA-3 ；·31、扩增位点D0K2的引物 Primer61 5-GCCTCCAGCATGTCCAGC-3， Primer62 5-GTACTTTGGGCCTTTCTTTAG-3 ；·32、扩增位点EPHX2I II的引物 Primer63 5-CACCGGGAGGAGCAGATG-3， Primer64 5-GAGGGAAGCAAAGAGGGAGTAT-3 ；·33、扩增位点ADRB3的引物 Primer65 5-CTTTCCGCCCGAGGAGTCT-3， Primer66 5-TTCCCGGAGAGGCAGGAG-3 ；·34、扩增位点BNIP3L的引物 Primer67 5-TACCATCCTCATCCTCCATCC-3， Primer68 5-CTCTGTCCTGATTCATGTTGTGC-3。
3. 一种使用权利要求
1所述的试剂盒的方法，包括扩增检测样本，用基因芯片进行反 应检测，其特征在于，样本扩增步骤为梯度降温扩增。
专利摘要
本发明提供一种用于肝癌易感基因分型的试剂盒。包括基因芯片，扩增液和聚合酶，所述的扩增液包含多重引物，各引物的长度为15-30bp，根据碱基配对的原则设计，位于各基因型突变位点所在核酸序列位置的上游或下游。可通过多重PCR扩增这些位点所在的片断，便于检测。本发明克服了传统的分型方法效率低、操作复杂、可控性差、分型局限性大等缺点，采用现代生物基因芯片检测技术，制备所得通量大、效率高的分型试剂盒，能够最大限度的囊括已知的易感基因位点，并通过特定设计的引物，提高检测灵敏度。通过本发明提供的肝癌易感基因分型试剂盒，能够帮助我们快速对样本进行分型，对于肝癌的循证医学的发展有极大的作用。
文档编号C12Q1/68GKCN101928750SQ200910053540
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月22日
发明者汪宁梅, 穆宇豪, 穆海东, 顾杰锋, 黎飒 申请人:上海裕隆基因科技中心有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan