专利名称:新羰基还原酶、其基因及它们的使用方法
技术领域：
本发明涉及具有不对称地还原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以产生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇 的活性的多肽(羰基还原酶)，其中该多肽分离自具有所述活性的微生物；编码该多肽的DNA；含有该DNA的载体，及用该载体转化的转化体。
本发明还涉及使用所述多肽或转化体制备光学活性醇，特别是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇是一种作为药剂等的合成起始原料有用的化合物。
背景技术：
作为(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的制备方法，已知的一种方法包括用还原剂例如硼氢化钠等化学地还原氨基被保护的(3S)-1-卤-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物(专利文献1，非专利文献1)。但是，这种方法需要相对昂贵的还原剂，而且其立体选择性从实用上说是不足的。
另外，作为使用微生物的方法，已知的一种方法包括使属于假丝酵母(Candida)属的微生物等作用于(3S)-1-卤-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物以产生(2R，3S)-1-卤-3-氨基-4-苯基-2-丁醇衍生物(专利文献2)，已知另一种方法包括使属于红球菌属(Rhodococcus)的微生物等与(3S)-1-卤-2-氧-3-被保护的氨基-4-取代的丁烷接触，以产生(2R，3S)-1-卤-2-羟基-3-被保护的氨基-4-取代的丁烷(专利文献3，非专利文献2)。但是，使用这些方法，反应混合物中可积累的产物浓度从实用上来说是不足的。
专利文献1JP-A-2-42048专利文献2JP-A-9-285专利文献3WO2002/014528非专利文献1Tetrahedron，50，6333(1994)非专利文献2TetrahedronAsymmetry，14，3105(2003)。
发明的公开本发明要解决的问题考虑到上面所述，本发明旨在提供用于生产(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的多肽，编码该多肽的DNA，含有该DNA的载体，和用该载体转化的转化体。
另外，本发明旨在提供使用所述多肽或转化体高效地制备多种光学活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
解决问题的手段本发明人从具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的微生物中分离了具有该活性的多肽。而且，他们成功地阐明了编码该多肽的DNA的碱基序列，并使用该序列生成了大量产生该多肽的转化体。另外，他们还发现通过使用该多肽或转化体能够高效地生产光学活性醇，例如(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，由此完成了本发明。
即，本发明涉及具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
此外，本发明提供编码该多肽的DNA。另外，本发明还提供含有该DNA的载体。此外，本发明还提供含有该载体的转化体。另外，本发明还提供使用所述或转化体制备光学活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
发明的效果根据本发明，可以提供制备有用的光学活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的实用的方法。
图1显示重组载体pNTOM4G1的制备方法和结构。
发明的优选实施方式下面详细地说明本发明。
本说明书中描述的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮可以通过例如JP-A-62-126158或JP-A-2-42048中公开的方法来制备。另外，除非另有说明，本发明中所述的DNA的分离、质粒的制备、基因操作例如转化等，可根据Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等书中描述的方法来进行。而且，除非另有说明，本说明书的描述中所用的“％”指“％(w/v)”。
本发明的多肽是具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。这种多肽可以从具有所述活性的微生物中分离。
作为本发明的多肽的来源的微生物没有具体限制，例如，可以使用属于Ogataea属的酵母。特别优选Ogataea minuta var.minuta，NBRC0975菌株。该微生物可以从国立制品评价技术局生物技术本部生物遗传资源部门(NBRC，2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu-shi 292-0818，Chiba Japan)获取。
培养作为本发明的多肽的来源的微生物的培养基可以使用包含碳源、氮源、无机盐、有机营养物等的一般液体营养培养基，只要该微生物能生长。
本发明的多肽可以通过合适地组合一般公知的蛋白纯化方法从作为该多肽来源的微生物中分离。例如，分离可如下述进行。
首先，在合适的培养基中培养微生物，再通过离心或过滤从培养基(cultured medium)中收集细胞。通过物理手段用超声破碎器(ultrasonicdisintegrator)、玻璃珠等破碎所得的细胞，然后通过离心去除细胞碎片而得到无细胞的提取物。然后，通过单独或组合例如盐析(salt-out)(硫酸铵沉淀，磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(通过丙酮、乙醇等分级沉淀蛋白质)、透析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、反相色谱、超滤等的方法，从无细胞的提取物中分离本发明的多肽。
还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性的测定，可以通过例如下列步骤在含0.33％(v/v)二甲亚砜的100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中加入0.2mM底物(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，0.25mM辅酶NADPH，以及粗酶，使该混合物在30℃反应1分钟，由反应后340nm波长的吸光度的下降速率来计算所述活性。
另外，由上述反应生成的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的绝对构型的确定和非对映体过量(diastereomeric excess)的测量可以通过高效液相色谱来进行(柱子COSMOSIL 5C8-MS(4.6mm×250mm；由NacalaiTesque生产)，洗脱液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；检测210nm)。
本发明的DNA是编码上述的本发明的多肽的DNA，而且只要能在根据下面叙述的方法转化的宿主细胞中表达该多肽，其可以是任何DNA，并可以包含任何非翻译的区域。一旦能够获得多肽，本领域普通技术人员即可以通过已知的方法从作为该多肽来源的微生物中获得这样的DNA。例如，可以用下面的方法获得。
首先，用合适的内肽酶消化本发明的分离的多肽，并通过反相HPLC将所得的肽片段分级。然后，例如，使用ABI492蛋白质测序仪(由AppliedBiosystems制造)测定所述肽片段的部分或全部氨基酸序列。
根据这样获得的氨基酸序列的信息，合成用于扩增编码所述多肽的DNA的一部分的PCR(聚合酶链式反应)引物。然后，通过一般的DNA分离方法，例如Visser的方法等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))制备作为所述多肽来源的微生物的染色体DNA。使用该染色体DNA作为模板以及上述的PCR引物进行PCR来扩增编码所述多肽的DNA的一部分，并测定其碱基序列。碱基序列可以用例如ABI373 DNA测序仪(由Applied Biosystems制造)等来测定。
一旦清楚了编码所述多肽的DNA的一部分碱基序列，就可以通过例如i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))来测定全长序列。
以这种方式获得的本发明的DNA的例子包括含有SEQ ID NO1所示的碱基序列的DNA和含有SEQ ID NO2所示的碱基序列的DNA。此外，本发明的DNA还涵盖在严紧条件下与由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA杂交的DNA，其编码具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
所述在严紧条件下与由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA杂交的DNA是指当进行菌落杂交方法、噬菌斑杂交方法、Southern杂交方法等时，与具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的碱基序列的互补碱基序列的DNA特异性地形成杂交体的DNA。
本文所用的严紧条件是指例如在65℃，在75mM柠檬酸三钠，750mM氯化钠，0.5％十二烷基硫酸钠，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％Ficoll 400(由Amersham Biosciences制造)的组合物的水溶液中进行杂交，然后在60℃，用15mM柠檬酸三钠150mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的组合物的水溶液洗涤的条件。优选地，它们指在上述条件下杂交后，在65℃，用15mM柠檬酸三钠，150mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的组合物的水溶液进行洗涤的条件。更优选地，它们指在以与上述相同的方式杂交后，在65℃，用1.5mM柠檬酸三钠，15mM氯化钠和0.1％十二烷基硫酸钠的组合物的水溶液进行洗涤的条件。
本发明的多肽的例子包括由SEQ ID NO1所示碱基序列编码的、具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的多肽，和由SEQ ID NO2所示碱基序列编码的、具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
此外，与这两种多肽的任一种显示至少一定水平的同源性，并具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽，在功能上等价于上述两种多肽，并包括在本发明中。
如本文中所用的，序列的同源性是通过，例如当使用同源性搜索程序FASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman；Pro.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988))比较性分析两个氨基酸序列时，相对于全部序列的同一性(identity)的值来表示的。与SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的多肽等价的多肽的例子，包括与这两种多肽的任一种显示不少于78％(SEQ ID NO3所示的多肽和SEQ ID NO4所示的多肽之间的同源性是78％)，优选不少于80％，更优选不少于85％，还更优选不少于90％的同源性的多肽。
这样的多肽可以，例如，通过将DNA连接到合适的载体中，并将载体导入合适宿主细胞中以让其表达而得到，其中所述DNA在严紧条件下可以与由上述SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA杂交。另外，这样的多肽可以通过，例如，根据Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.，1989)等中所述的已知的方法，在具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽中造成氨基酸的取代、插入、缺失或添加而得到。
通过后一方法得到的多肽的例子包括在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中，用甘氨酸取代第42位的丙氨酸、用丙氨酸取代第43位的谷氨酸、用谷氨酸取代第46位的赖氨酸、和/或用赖氨酸取代第49位的天冬酰胺而得到的多肽。具有所有这4种突变的多肽(突变体多肽1)在SEQ ID NO16中显示，编码该多肽(突变体多肽1)的DNA在SEQ ID NO15中显示。
用于将本发明的DNA导入到宿主微生物，以使DNA在该宿主微生物中表达的载体没有具体的限制，只要该DNA能够在合适的宿主微生物中表达编码基因。这样的载体的例子包括质粒载体，噬菌体载体，黏粒(cosmid)载体等。另外，还可以使用能够与其他宿主细胞交换基因的穿梭载体。
这样的载体一般含有调控因子(regulator)，例如lacUV5启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，lpp启动子，tufB启动子，recA启动子，pL启动子等，而且还可优选地用作含有与本发明的DNA可操作地连接的表达单元的表达载体。例如，可以优选地使用pUCNT(WO94/03613)。
本说明书中所用的术语“调控因子”指具有功能性启动子和任何相关的转录元件(例如增强子，CCAAT盒，TATA盒，SPI部分等)的碱基序列。
本说明书中所用的术语“可操作地连接”是指在宿主细胞中，控制基因表达的不同的调控元件例如启动子、增强子等，与基因以可操作的状态连接。对本领域的普通技术人员而言所熟知的是，调控因子的类型和种类可能依据宿主而变化。
本发明的表达载体的例子包括后面所述的pNTOM3，其中SEQ ID NO1所示的DNA已被导入pUCNT；pNTOM4，其中SEQ ID NO2所示的DNA已被导入pUCNT；及pNTOM5，其中SEQ ID NO15所示的DNA已被导入pUCNT，等等。
作为其中导入了含有本发明的DNA的载体的宿主细胞，可以使用细菌、酵母、丝状菌(filamentous bacterium)、植物细胞、动物细胞等等。由于导入和/或培养容易，细菌是优选的，且特别优选大肠杆菌(Escherichia coli)。含有本发明的DNA的载体可以通过已知的方法导入宿主细胞。当使用大肠杆菌作为宿主细胞时，例如商业上可获得的大肠杆菌HB101感受态细胞(由TAKARA BIO生产)可以用于将载体导入宿主细胞。
本发明的转化体的例子包括后面所述的大肠杆菌HB101(pNTMO3)FERM BP-10368，其中上述pNTMO3已被导入大肠杆菌HB101；大肠杆菌HB101(pNTMO4)FERM BP-10369，其中上述pNTMO4已被导入大肠杆菌HB101；及大肠杆菌HB101(pNTMO5)FERM BP-10370，其中上述pNTMO5已被导入大肠杆菌HB101，等等。这些转化体已经分别以上述的登录号被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPODCentral 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566日本)(在日本的原保藏日为2004年6月3日，国家保藏菌株已根据布达佩斯条约于2005年7月6日转为国际保藏)。
当使用本发明的多肽不对称地还原具有羰基的化合物以产生光学活性醇时，需要辅酶例如NADH、NADPH等。但是，通过在同时存在可将氧化的辅酶转变为还原形式(以下称其为辅酶再生能力)的多肽、作为多肽底物的化合物和本发明的多肽的条件下进行反应，可以显著地减少所使用的昂贵的辅酶的量。
作为具有辅酶再生能力的多肽，可使用例如氢化酶、甲酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶等。优选使用葡萄糖脱氢酶。
如下可以使用本发明的多肽制备光学活性醇。首先，将作为底物的具有羰基的化合物、辅酶例如NADPH等，以及所述多肽加入合适的溶剂，并在调节的pH下搅拌该混合物以进行反应。当组合使用本发明的多肽和具有辅酶再生能力的多肽进行反应时，将具有辅酶再生能力的多肽(例如葡萄糖脱氢酶)和作为其底物的化合物(例如葡萄糖)进一步添加到上述反应组合物中。
可以使用水性溶剂进行反应，或者可以使用水性溶剂和有机溶剂的混合物进行反应。有机溶剂的例子包括甲苯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、己烷、异丙醇、二异丙基醚、甲醇、丙酮、二甲亚砜等。反应在10℃到70℃的温度下进行，且反应混合物的pH保持在4-10。可以通过分批的过程或连续的过程来进行反应。对于分批过程，反应底物以0.1％到70％(w/v)的进料浓度加入。作为底物的具有羰基的化合物的例子包括(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮。但是只要该化合物能够在上述反应条件下被还原并转变为光学活性醇，对其没有具体限制。
即使当使用含有编码所述多肽的DNA的转化体或者其处理过的产物来代替本发明的多肽时，也可以类似地进行反应。而且，即使当使用既含有编码本发明的多肽的DNA，又含有编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA的转化体或者其处理过的产物时，也可以类似地进行反应。“转化体的处理过的产物”是指，例如，用表面活性剂或有机溶剂处理过的细胞，干燥的细胞，破碎的细胞，细胞的粗提取物等，以及用已知的手段固定的那些。
具体地，当使用同时含有编码本发明的多肽的DNA和编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA的转化体，或者其处理过的产物时，不需要单独制备和添加用于再生辅酶的酶，且可以高效率地生产光学活性醇。
同时含有编码本发明的多肽的DNA和编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA的转化体可通过下述来获得将编码本发明的多肽的DNA和编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA掺入到单个载体中，并将该载体导入宿主细胞，或者将这两种DNA分别掺入到属于不同的不相容的组的两种载体中，并将这两种载体导入单个宿主细胞中。
同时掺入编码本发明的多肽的DNA和编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA的载体的例子包括pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1，其中来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶基因已被导入上述各个表达载体pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5等。同时含有编码本发明的多肽的DNA和编码具有辅酶再生能力的多肽的DNA的转化体的例子包括大肠杆菌HB101(pNTMO3G1)、大肠杆菌HB101(pNTMO4G1)和大肠杆菌HB101(pNTMO5G1)，其中大肠杆菌HB101已经用这些载体所转化，等等。
转化体中具有辅酶再生能力的多肽的活性可以用常规方法来测定。例如，当在1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中加入100mM葡萄糖，2mM辅酶NADP或NAD，及所述酶，并将混合物在25℃下反应1min时，可由340nm波长处吸光度的增加速率计算葡萄糖脱氢酶的活性。
含有编码本发明的多肽的DNA的转化体可以在含有碳源、氮源、无机盐、有机营养物等的常规液体营养培养基中培养，只要其能生长。
反应所得的光学活性醇可以用常规方法纯化。例如，当反应所得的光学活性醇是(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇时，用有机溶剂例如乙酸乙酯、甲苯等提取反应混合物，然后减压蒸发掉有机溶剂。另外，它可以通过如结晶析出(crystal precipitation)、色谱等处理来纯化。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非对映体过量的测量可使用高效液相色谱(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生产)，洗脱液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；检测210nm)。
如上所述，根据本发明，可以高效率地制备本发明的多肽，而且，使用该多肽，可以提供多种有用的光学活性醇包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的优异的制备方法。
实施例本发明在下面的实施例中得到详细的说明，这些实施例不应被理解为限制性的。下面的实施例中所用的与重组DNA技术相关的具体操作方法等描述于下面的书籍中Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience)实施例1 多肽的纯化根据下面所述的方法，从Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株中分离并纯化了具有不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。除非另有说明，纯化是在4℃下进行的。
通过下述测定对于(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的还原活性在含有0.33％(v/v)二甲亚砜的100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中溶解底物[(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮]至终浓度0.2mM及辅酶NADPH至终浓度0.25mM，再加入粗酶溶液，在30℃进行反应1min，并由反应混合物在340nm波长处的吸光度的减少速率来计算所述还原活性。在所述反应条件下经过1分钟将1μmol NADPH氧化为NADP的活性定义为1个单位。
(微生物的培养)将含葡萄糖5％，聚胨0.5％，酵母提取物0.1％，磷酸氢二钾0.1％，磷酸二氢钾0.2％和七水合硫酸镁0.02％的液体培养基(18L)(pH 6.5)制备于30L釜式发酵罐(jar-fermentor)(由B.E.Marubishi Co.，Ltd制造)中，并在120℃用蒸汽灭菌20min。
向该培养基中接入180ml预先在相同的培养基中预培养的Ogataeaminuta var minuta NBRC0975菌株的培养基，然后在250rpm搅拌、5.0NL/min通气量和28℃的条件下将混合物培养48小时。
(无细胞提取物的制备)通过离心从上述培养基中收集细胞，并用2000ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)洗涤，以得到907g该菌株的细胞。在1800ml的含0.1mM二硫苏糖醇(DTT)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中重悬这些细胞，并用UH-600超声分散器(由SMT制造)破碎细胞。通过离心从破碎物中去除细胞碎片以得到无细胞提取物。
(硫酸铵分级)用氨水将上述得到的无细胞提取物的pH调节到7.5，加入硫酸铵并溶解到40％饱和度同时保持pH，然后通过离心除去得到的沉淀。以和上述相同的方式向上清中再加入硫酸铵并溶解到60％饱和度，同时保持在pH 7.5，并通过离心收集得到的沉淀。将沉淀溶解在含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，并对相同的缓冲液透析过夜以得到活性级分。
(DEAE-Sephacel柱色谱)将通过硫酸铵分级得到的活性级分上样到预先用含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的DEAE-Sephacel(由Amersham Biosciences制造)柱(29×290mm)上，以使活性级分吸附。用相同的缓冲液洗涤柱子后，用氯化钠线性梯度(0M到1M)洗脱活性级分。收集活性级分并对相同缓冲液透析过夜。
(MonoQ HR柱色谱)将由DEAE-Sephacel柱色谱得到的活性级分上样到预先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 10/10柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性级分吸附。用相同的缓冲液洗涤柱子后，用氯化钠线性梯度(0M到1M)洗脱活性级分。收集活性级分并对相同缓冲液透析过夜。
(Phenyl-Superose柱色谱)将氯化钠溶于通过MonoQ HR柱色谱所得的活性级分中至终浓度4M，再将该溶液上样到预先用含4M氯化钠和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的Phenyl-Superose HR 10/10柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性级分吸附。用相同的缓冲液洗涤柱子后，用氯化钠线性梯度(4M到0M)洗脱活性级分。收集活性级分并对含0.1mM DTT的10mMTris-HCl缓冲液(pH 7.5)透析过夜。
(MonoQ HR柱色谱)将通过Phenyl-Superose柱色谱得到的活性级分上样到预先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 5/5柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性级分吸附。用相同的缓冲液洗涤柱子后，用氯化钠线性梯度(0M到1M)洗脱活性级分。收集活性级分并用Centricon YM-10(由Millipore生产)浓缩。
(凝胶过滤色谱)将通过上述MonoQ HR柱色谱得到的活性级分上样到预先用含0.2M氯化钠和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)平衡的Superdex 200HR 10/30柱(由Amersham Biosciences制造)上，并用相同的缓冲液以0.5ml/min的流速洗脱活性级分。收集活性级分并用Centricon YM-10(由Millipore生产)浓缩。再将其上样到预先用相同缓冲液平衡的Superdex 200 HR 10/30柱(由Amersham Biosciences制造)上，并用相同的缓冲液以0.5ml/min的流速洗脱活性级分。收集活性级分并用作所述多肽的纯化标准样品。
(实施例2)基因克降(PCR引物的制备)
使实施例1中所得的纯化多肽在8M脲存在下变性，然后用源自无色杆菌属(Achromobacter)的赖氨酰内肽酶(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd制备)消化。然后，通过ABI492蛋白质测序仪(由Perkin Elmer制造)测定所得的肽片段的氨基酸序列。根据从该氨基酸序列推测的DNA序列，合成了引物15’-acngtntayttyathgcngg-3’(SEQ ID NO5)和引物25’-atnggdatrtcraaytgrtc-3’(SEQ ID NO6)，用来通过PCR扩增编码该多肽的基因的一部分。
(通过PCR扩增基因)从以与实施例1相同的方式培养的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的细胞中，根据Visser的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))等提取染色体DNA。用上面制备的DNA引物1和2并使用所得的染色体DNA作为模板进行PCR。结果，扩增了被认为是目标基因的一部分的约700bp的DNA片段。用TaKaRa Ex Taq(由TAKARA BIO制造)作为DNA聚合酶进行PCR，其中反应条件遵照其指导手册。将该DNA片段克隆到质粒pT7Blue T-载体(由Novagen制造)，并用ABI PRISM染料终止物循环测序即用反应试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(由Perkin Elmer制造)和ABI 373A DNA测序仪(由Perkin Elmer制造)分析其碱基序列。PCR的结果显示，扩增了具有不同碱基序列的两种DNA片段。其碱基序列在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中显示。
(通过i-PCR鉴定目标基因的全长序列)用限制酶XbaI完全消化上面制备的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的染色体DNA，用T4连接酶使所得的DNA片段的混合物分子内环化。使用其为模板，通过i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))确定了含有上述SEQ ID NO7所示的碱基序列的基因的全长碱基序列。结果在SEQ ID NO1中显示。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARA BIO制造)作为DNA聚合酶进行i-PCR，其中反应条件根据其指导手册。通过类似的操作还确定了含有上述SEQ ID NO8所示的碱基序列的基因的全长碱基序列，其结果在SEQ ID NO2中显示。另外，由SEQ ID NO1所示的碱基序列编码的氨基酸序列显示在SEQ ID NO3中，由SEQ ID NO2所示的碱基序列编码的氨基酸序列显示在SEQ ID NO4中。
(实施例3)表达载体的构建使用引物35’-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3’(SEQ ID NO9)和引物45’-gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa-3’(SEQ ID NO10)，并以实施例2中得到的Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株的染色体DNA作为模板进行PCR。结果得到了这样的双链DNA其中在具有如SEQ ID NO2所示的碱基序列的基因的起始密码子处添加了NdeI识别位点，而在紧接着该基因的终止密码子之后添加了EcoRI识别位点。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARABIO制造)作为DNA聚合酶进行PCR，其中反应条件根据其指导手册。用NdeI和EcoRI消化该DNA，并将其插入质粒pUCNT(WO 94/03613)的lac启动子的下游的NdeI识别位点和EcoRI识别位点之间，以构建重组载体pNTOM4。
类似地，使用引物55’-gtgcatatggctaagactgtctatttca-3’(SEQ ID NO11)和引物65’-gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa-3’(SEQ ID NO12)得到了这样的双链DNA其中在具有如SEQ ID NO1所示的碱基序列的基因的起始密码子处添加了NdeI识别位点，而在紧邻该基因的终止密码子之后添加了EcoRI识别位点。以与上面相同的方式将该DNA插入质粒pUCNT以构建重组载体pNTOM3。
(实施例4)突变体基因的构建使用Mutan-SuperExpress Km(由TAKARA BIO制造)并遵照其指导手册中描述的操作方法，制备了这样的突变体基因其中在具有如SEQ ID NO2所示的碱基序列的基因中，第125位的C被G取代，第128位的A被C取代，第136位的A被G取代，且第147位的C被G取代。该突变体基因编码这样的多肽，其中在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中，第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，第43位的谷氨酸被丙氨酸取代，第46位的赖氨酸被谷氨酸取代，第49位的天冬酰胺被赖氨酸取代。该突变体基因的碱基序列在SEQ IDNO15中显示，且由该基因编码的突变体多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO16中显示。以和实施例3相同的方式将该突变体基因插入载体pUCNT中以构建重组载体pNTOM5。
(实施例5)进一步包含葡萄糖脱氢酶基因的表达载体的构建使用引物75’-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3’(SEQ ID NO13)和引物83’-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-5’(SEQ ID NO14)，并以质粒pGDK1(Eur.J.Biochem.，186，389(1989))作为模板进行PCR，得到了这样的双链DNA其中，在源自巨大芽孢杆菌IAM1030菌株的葡萄糖脱氢酶(以下称为GDH)基因中，起始密码子上游5个碱基处添加了大肠杆菌核糖体结合序列，该核糖体结合序列的紧邻前方添加了EcoRI切割位点，且终止密码子紧邻后方添加了SalI切割位点。
所得的DNA片段用EcoRI和SalI消化，并插入实施例3和4中构建的pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5的EcoRI和SalI位点，以构建重组质粒pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1。作为示例，pNTOM4G1的产生方法和结构显示在图1中。
(实施例6)转化体的制备使用实施例3和4中构建的重组载体pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5转化大肠杆菌HB101感受态细胞(由TAKARA BIO制造)得到大肠杆菌HB101(pNTOM3)、大肠杆菌HB101(pNTOM4)和大肠杆菌HB101(pNTOM5)。这些转化体已经分别以登录号FERM BP-10368、FERMBP-10369和FERM BP-10370被保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(IPOD)。
类似地，使用实施例5中构建的重组载体pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1转化大肠杆菌HB101感受态细胞(由TAKARA BIO制造)得到大肠杆菌HB101(pNTOM3G1)、大肠杆菌HB101(pNTOM4G1)和大肠杆菌HB101(pNTOM5G1)。
(实施例7)转化体中的基因表达将实施例6中获得的6种转化体和含有载体质粒pUNCT的转化体大肠杆菌HB101(pUNCT)接种到50ml的含有200μg/ml氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％，pH7.0)，37℃下振荡培养24小时。通过离心收集细胞，并重悬于50ml的100mM磷酸盐缓冲液(pH6.5)中。用UH-50超声均质器(由SMT制造)破碎细胞，通过离心去除细胞碎片以得到无细胞提取物。测量了无细胞提取物的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮还原活性和GDH活性，并作为比活性表示在表1中。在所有6种实施例6中获得的转化体中都观察到了(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮还原活性的表达。在含有GDH基因的大肠杆菌HB101(pNTOM3G1)、大肠杆菌HB101(pNTOM4G1)和大肠杆菌HB101(pNTOM5G1)中也观察到了GDH活性的表达。(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮还原活性是通过实施例1中描述的方法测定的。当在1MTris-HCl缓冲液(pH 8.0)中加入0.1M葡萄糖，2mM辅酶NADP，以及粗酶溶液，并使该混合物在25℃反应1min时，由340nm波长处的吸光度的增加速率计算GDH活性。在所述反应条件下经过1分钟将1μmol的NADP还原成NADPH的酶活性定义为1个单位。另外，用蛋白质测定试剂盒(由BIO-RAD制造)测定无细胞提取物中的蛋白质浓度。
表1
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮
(实施例8)使用转化体反应将葡萄糖脱氢酶(由Amano Enzyme制造)2000U，葡萄糖2g，NADP 6mg和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g加入50ml实施例7中制备的大肠杆菌HB101(pNTOM3)的无细胞提取物中，30℃下搅拌所述混合物22小时并通过滴加5M氢氧化钠将pH调节到6.5。反应完成后，用甲苯提取反应混合物，去溶剂，并分析该提取物。结果得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(产率86.3％、非对映体过量96.4％d.e.)。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非对映体过量的测定使用高效液相色谱来进行(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生产)，洗脱液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；检测210nm)。
(实施例9)使用转化体反应向22.5ml实施例7中制备的大肠杆菌HB101(pNTOM4)的无细胞提取物中加入葡萄糖脱氢酶(由Amano Enzyme制造)1250U、葡萄糖3g、NADP4mg、(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮0.25g，在30℃下搅拌，同时通过滴加5M氢氧化钠将pH调节到6.5。反应开始后2小时、4小时和6小时添加0.25g、及反应开始后8小时添加1.25g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，反应31小时。反应完成后，用甲苯抽提反应混合物，脱溶剂后，和实施例8一样分析提取物。结果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(产率99.0％、非对映体过量99.8％d.e.)。
(实施例10)使用转化体反应向25ml实施例7中制备的大肠杆菌HB101(pNTOM4G1)的无细胞提取物中加入葡萄糖3g、NADP 3mg、甲苯0.25ml及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，在30℃下搅拌，同时通过滴加5M氢氧化钠将pH调节到6.5。反应完成后，用甲苯提取反应混合物，脱溶剂，以与实施例8相同的方式分析提取物。结果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(产率99.1％、非对映体过量99.8％d.e.)。
(实施例11)使用转化体反应向以与实施例7中相同的方式制备的大肠杆菌HB101(pNTOM5G1)的培养基中加入葡萄糖6g、NADP 1.4mg、甲苯0.25mI及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，将混合物在30℃搅拌，同时通过滴加5M氢氧化钠将pH调节到6.5。反应开始后1小时添加2.5g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，使混合物反应20hr。反应完成后，用甲苯提取反应混合物，脱溶剂，并以与实施例8相同的方式分析提取物。结果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(产率99.0％、非对映体过量99.8％d.e.)。
(实施例12)多肽的底物特异性在含有0.33％(v/v)二甲亚砜的100mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5)中，分别溶解作为底物的羰基化合物到1mM的终浓度，及辅酶NADPH到0.25mM的终浓度。向其中加入实施例7中制备的大肠杆菌HB101(pNTOM4)或大肠杆菌HB101(pNTOM3)无细胞提取物，并使该混合物在30℃反应1小时。由反应混合物在340nm波长处的吸光度的减少速率来计算对每种羰基化合物的还原活性，并在表2中显示为相对于对(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性(其作为100％)的值。由所述转化体产生的、由SEQ IDNO3和SEQ ID NO4所示氨基酸序列组成的多肽，对于多种羰基化合物都显示了还原活性。
表2转化体产生的多肽的底物特异性
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮.
序列表<110>株式会社钟化(Kaneka Corporation)<120>新羰基还原酶、其基因及它们的使用方法<130>B040342WO01<150>JP2004-231226<151>2004-08-06<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>756<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>1atggctaaga ctgtctattt cattgccgga gcatcgagag ggattggcct cgagattgca 60acccaattga gtgcaaaccc agagaaccat gtgattgcct cgtacagatc tgaaaagact 120gctggtgcac tcctggaact tgccaagaag gacaacgtgg acactgttgt gttggatatt 180gcaatccagg agtcgattga gggtttgtcc caacagattg tgaagctgac ggacggaatt 240gatattgctc tgatcaatgc cggagttgga tactcaatgt actctctact cgaatgttcc 300agagaagcat tcattgacca ctggactaca aattctctgg gtccaatcct ggtgtataag 360gaaatccacc aattcatgct gaagagagaa actcgaaaag tgttcttcat gtctagcgga 420gcagggtcta ttcagggcca cttgcctgtt tccgtgagtg catacggtat gtcgaaggca 480gcactgaact acgcggcccg gaaactttct gacgaatgct acaaagacgg ctttactatt 540gtggcgcttc acccaggtat ggttctgaca gacatgggta tggagagtat tgagattatg 600gcaaacggag acgagcagct tgccgcgtcc atcaacagta ttgcaattag tacagacact 660agtgccgcac aatgcattgg tgcaatgcag agtcttacaa agcagagcaa cggtagattc 720attaatgttg cagaccagtt tgacattcca ttctag 756<210>2<211>756<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>2atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcagctgagc tgctcaaact ggccaacaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480
gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756<210>3<211>251<212>PRT<213>Ogataea minuta var.minuta<400>3Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Ile Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Glu Asn His Val Ile20 25 30Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Ala Ile Gln Glu50 55 60Ser Ile Glu Gly Leu Ser Gln Gln Ile Val Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Ala Leu Ile Asn Ala Gly Val Gly Tyr Ser Met Tyr Ser Leu85 90 95Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ala Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Leu Val Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Ala Gly Ser Ile130 135 140Gln Gly His Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Ala Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Gly Phe Thr Ile Val Ala Leu His Pro Gly Met Val Leu Thr Asp Met180 185 190Gly Met Glu Ser Ile Glu Ile Met Ala Asn Gly Asp Glu Gln Leu Ala195 200 205Ala Ser Ile Asn Ser Ile Ala Ile Ser Thr Asp Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Cys Ile Gly Ala Met Gln Ser Leu Thr Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Asn Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250<210>4<211>251<212>PRT
<213>Ogataea minuta var.minuta<400>4Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ala35 40 45Asn Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Ash Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phc Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物1<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n代表a，t，g或c<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)<223>n代表a，t，g或c<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n代表a，t，g或c<400>5acngtntayt tyathgcngg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n代表a，t，g或c<400>6atnggdatrt craaytgrtc 20<210>7<211>703<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>7agcatcgaga gggattggcc tcgagattgc aacccaattg agtgcaaacc cagagaacca 60tgtgattgcc tcgtacagat ctgaaaagac tgctggtgca ctcctggaac ttgccaagaa 120ggacaacgtg gacactgttg tgttggatat tgcaatccag gagtcgattg agggtttgtc 180ccaacagatt gtgaagctga cggacggaat tgatattgct ctgatcaatg ccggagttgg 240atactcaatg tactctctac tcgaatgttc cagagaagca ttcattgacc actggactac 300aaattctctg ggtccaatcc tggtgtataa ggaaatccac caattcatgc tgaagagaga 360aactcgaaaa gtgttcttca tgtctagcgg agcagggtct attcagggcc acttgcctgt 420ttccgtgagt gcatacggta tgtcgaaggc agcactgaac tacgcggccc ggaaactttc 480tgacgaatgc tacaaagacg gctttactat tgtggcgctt cacccaggta tggttctgac 540agacatgggt atggagagta ttgagattat ggcaaacgga gacgagcagc ttgccgcgtc 600catcaacagt attgcaatta gtacagacac tagtgccgca caatgcattg gtgcaatgca 660gagtcttaca aagcagagca acggtagatt cattaatgtt gca 703<210>8<211>703<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>8agcttctaga ggtattggcc ttgaggttgc cactcagctg agtgccaacc cagataatta 60
tgttattggt tcttacagaa cggagaaaac tgcagctgag ctgctcaaac tggccaacaa 120agaaaatgtc gacactgttg tcctagacat tggtagccaa ggttctattg aagcgcttcc 180agcacaaatc tcaaagctga cggacggaat cgatattact ctgatcaatg ccggaattgc 240gtactcaatg tactctattt tcgagtgttc cagagagaca tttattgatc actggaccac 300aaattccttg ggtccaatca tgctctacaa ggagattcat cagttcatgc tgaagagaga 360aactcgtaag gtgtttttca tgtctagtgg aggaggctct atccagtctc tattgcctat 420ttcaaccagt gcttacggta tgtcgaaggc tgcactgaac tatgcggtcc ggaagctttc 480tgatgaatgc tacaaggaca acttcaccat tgtgatgttg cacccaggag tggtggccac 540ggatatgggc cgggaaacta ccaagatcat ggccaatgga aatgctcaga ttatctctta 600tattgaatcc atatctttgc cgcccgctac aagcgctgca cagactattg gtgcaatgca 660agctcttgac aagcagagca atggtaggtt catcggagtc gca 703<210>9<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物3<400>9gtgcatatga ccaagactgt ttatttca 28<210>10<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物4<400>10gtcgaattct tattaaaatg gaatgtcgaa 30<210>11<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物5<400>11gtgcatatgg ctaagactgt ctatttca 28<210>12<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物6<400>12
gtcgaattct tactagaatg gaatgtcaaa 30<210>13<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物7<400>13gccgaattct aaggaggtta acaatgtata aa 32<210>14<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物8<400>14gcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg 28<210>15<211>756<212>DNA<213>人工的<220>
<223>突变DNA 1<400>15atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcaggtgcgc tgctcgaact ggccaagaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756<210>16<211>251<212>PRT<213>人工的<220>
<223>突变多肽1<400>16Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phe Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250
权利要求
1.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO1中所示碱基序列的DNA，(b)与由SEQ ID NO1所示碱基序列的互补碱基序列组成的DNA在严紧条件下杂交，并编码多肽的DNA，所述多肽具有不对称地还原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以产生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性
2.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO2中所示的碱基序列的DNA，(b)与由SEQ ID NO2所示的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA在严紧条件下杂交，并编码多肽的DNA，所述多肽具有不对称地还原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
3.一种多肽，其由权利要求
1或2的DNA所编码，并具有不对称地还原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
4.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列的多肽，(b)包含与SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列显示不少于78％的同源性的氨基酸序列，并具有不对称地还原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
5.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列的多肽，(b)包含与SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列显示不少于78％的同源性的氨基酸序列，并具有不对称地还原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
6.一种在SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列中、具有下列1)到4)中的至少一种突变的多肽1)第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，2)第43位的谷氨酸被丙氨酸取代，3)第46位的赖氨酸被谷氨酸取代，4)第49位的天冬酰胺被赖氨酸取代。
7.权利要求
6所述的多肽，其包含前述1)到4)的所有突变。
8.编码权利要求
4-7中任一项所述的多肽的DNA。
9.包含权利要求
1、2或8的DNA的载体。
10.权利要求
9所述的载体，其是质粒pNTOM3。
11.权利要求
9所述的载体，其是质粒pNTOM4。
12.权利要求
9所述的载体，其是质粒pNTOM5。
13.权利要求
9所述的载体，还包含编码具有葡萄糖脱氢酶活性的多肽的DNA。
14.权利要求
13所述的载体，其中所述具有葡萄糖脱氢酶活性的多肽是源自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脱氢酶。
15.用权利要求
9-14中任一项所述的载体转化宿主细胞而获得的转化体。
16.权利要求
15所述的转化体，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
17.权利要求
16所述的转化体，其是大肠杆菌HB101(pNTOM3)FERMBP-10368。
18.权利要求
16所述的转化体，其是大肠杆菌HB101(pNTOM4)FERMBP-10389。
19.权利要求
16所述的转化体，其是大肠杆菌HB101(pNTOM5)FERMBP-10370。
20.一种光学活性醇的制造方法，其包括使权利要求
3-7中任一项所述的多肽或权利要求
15-19中任一项所述的转化体，或其处理过的产物，与具有羰基的化合物反应。
21.权利要求
20所述的方法，其中所述具有羰基的化合物是由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，所述光学活性醇是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。
专利摘要
分离自属于Ogataea属的微生物，并具有不对称地还原(3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁酮以产生(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的活性的多肽；编码该多肽的DNA；产生该多肽的转化体；和使用上述多肽或转化体生产(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的方法。通过使用上述多肽或转化体，可以高效地生产光学活性醇，例如(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇。
文档编号C12N5/10GK1993464SQ200580026643
公开日2007年7月4日 申请日期2005年8月1日
发明者木崎宪之, 矢野美穗, 船木正大, 武居辉明, 八十原良彦, 守川壮一, 中井孝尚, 片冈道彦, 清水昌 申请人:株式会社钟化导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan