化肽A0P-0M1，其制备方法可以通过生物化学分离纯化方法，由大绿臭蛙皮肤分泌物中得到。上述方法制备的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl，可通过质谱及抗氧化活性进行鉴定。
[0021]本发明纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1在自由基ABTS+清除实验中显示了较强的抗氧化活性，揭示本发明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1有潜在的应用前景。
[0022]本发明的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽A0P-0M1具有结构简单、抗氧化活性强的有益特点。
[0023]实施例1大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl分离纯化和鉴定
1、分离纯化
大绿臭蛙活体采自贵州遵义，用6V直流电刺激6s，然后用生理盐水冲洗其皮肤，获得皮肤分泌物，真空冷冻干燥，-80°保存备用。
[0024]第一步:S印hadex G-75排阻层析:按照上述方法获得皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，取I ml (蛋白含量为100 mg)上预先用20 mM Tris-HCl缓冲液(pH=7.8，含0.1 M NaCl)平衡 24 小时的 Sephadex G-75 (GE Healthcare，超细)柱子(长度 30 cm，内径宽度1.5 cm)，用同样的缓冲液进行洗脱，流速为1.5 ml/10min，每10 min收集一次，测定其在280 nm下的吸光度，所得的分离纯化图谱如图1所示，其中AOP-OMl存在于图1箭头所示峰。
[0025]第二步:高效液相色谱反相层析:
第一步所得样品真空冷冻干燥后取I mg溶于Iml去离子水后上样于预先用超纯水(含
0.1%的三氟乙酸)平衡20 min的Hypersil 0DS2 5mm柱(大连伊利特，尺寸为4.6 mm X 300mm)，实验仪器为Waters 1525高压液相系统，在流速为I ml/min的条件下，用乙腈(含0.1%的三氟乙酸)在线性梯度(0-100% in 100 min)条件下进行洗脱，监测波长为215 nm，所得的分离纯化图谱如图2所示，图中箭头所示为纯化的天然大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl。
[0026]2、分子鉴定氨基酸序列的测定:
纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl在全自动蛋白质序列测定仪(岛津PPSQ-31A)上经Edman降解法，测定了大绿臭娃皮肤抗氧化肽AOP-AMl氨基酸全序列，结果表明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl具有本发明SEQ ID NO:1所示的结构。
[0027]质谱分子量测定:
基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALD1-TOF-MS)检测了纯化得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OMl的精确分子量，所用仪器为Bruker公司Autoflex III TOF/TOF质谱仪。大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl质谱测定的分子量分别为938.1道尔顿，见图3所示。质谱结果揭示大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OMl不存在翻译后修饰。
[0028]实施例2 以实施例1制备得到的大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl的抗氧化活性试验:
方法:利用自由基ABTS+清除活性实验检测拉大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl的抗氧化活性，结果表明大绿臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-AMl具有较强的抗氧化活性。
[0029]具体步骤与结果:取7 mM的ABTS在水中和2.8 mM的过硫酸钾混合，室温黑暗环境中反应6个小时，使得ABTS被氧化成为ABTS+自由基，之后用去离子水稀释50倍，取50uL稀释液和50 uL样品混合，室温黑暗环境下反应30分钟，之后，在415 nm波长下测其吸光度。自由基ABTS+的清除率(％)用下述公式进行计算:(A blank-A sample) X100/Ablank。不同浓度大绿臭蛙抗氧化肽A0P-0M1的抗氧化活性如图4所示。
【主权项】
1.一种抗氧化多肽AOP-OMl，其特征在于所述的抗氧化多肽AOP-OMl的氨基酸序列如SEQ ID:N0.1 所示。
2.一种权利要求1所述的抗氧化多肽A0P-0M1的制备方法，其特征在于包括以下步骤: A、取原料大绿臭娃皮肤分泌物lOOmg，加入Iml去离子水溶解，上SephadexG-75柱，用Tris-HCl缓冲液以流速1.5 ml/min进行洗脱，每1min收集一次，分别测定洗脱液在280nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到浸膏a ; B、Img浸膏a中加入Iml去离子水溶解，上Hypersil0DS2色谱柱，用乙腈以lml/min的流速进行洗脱，监测215nm下的吸光度，收集合并活性峰值组分的洗脱液，浓缩干燥后得到目标物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的SephadexG_75柱需预先用20mmol/L，pH7.8的Tris-HCl缓冲液平衡24h。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的Hypersil0DS2色谱柱需预先用含0.1%三氟乙酸的超纯水平衡20min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的乙腈为含0.1%三氟乙酸的乙腈。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的洗脱是采用线性梯度洗脱，即乙腈浓度从0%升至100%所消耗的时间为lOOmin。
7.—种权利要求1所述的抗氧化多肽A0P-0M1的应用，其特征在于所述的抗氧化多肽A0P-0M1在制备抗氧化药物中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种抗氧化多肽AOP-OM1及其制备方法与应用，所述的抗氧化多肽AOP-OM1的氨基酸序列如SEQ ID：No.1所示。所述的制备方法是以大绿臭蛙皮肤分泌物为原料分离纯化获得。本发明是在两栖动物大绿臭蛙的皮肤中发现了一种新型的抗氧化剂，其化学本质为多肽，和传统的两大类抗氧化剂不同，其由基因编码，但分子量却很小。本发明从中国产大绿臭蛙的皮肤中得到了1个新颖的抗氧化多肽AOP-OM1，其抗氧化活性很强，约为维生素E的200倍。
【IPC分类】A61K38-08, A61P39-06, C07K7-06, C07K1-16
【公开号】CN104530192
【申请号】CN201510025060
【发明人】王滢, 梁醒财
【申请人】云南民族大学, 北京美瑞昆华科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月19日...