lmg/ml糖化血红蛋白抗体(北京怡成 生物电子技术有限公司生产的冻干剂型）溶液中（用〇. 02MPBS，pH7. 0复溶，加入前测定 260nm和280nm吸光度值)。4°C反应过夜，约16小时。
[0088] f)微球溶液离心，上清留液待测蛋白浓度。用0. 05M硼酸缓冲液（pH8. 5)IOml悬 浮微球，并室温反应30分钟。
[0089]g)然后，13000转5分钟离心2次，用IOml的0. 05M硼酸缓冲液（pH8. 5)悬浮微 球。
[0090] h)13000转5分钟离心，用含lOmg/mlBSA的0? 05M硼酸缓冲液（pH8. 5)悬浮，室 温轻微搅拌30分钟。
[0091]i) 13000 转 5 分钟离心,用含 10mg/mlBSA、IOppmProclin的pH7.OPB悬浮微球。 再次13000转5分钟离心，弃去上清，得所述彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体。
[0092] j)最后，用2ml的含10mg/ml蛋白稳定剂、IOppmProclin的pH7.OPB悬浮所述彩 色纳米微球-糖化血红蛋白抗体，4°C保存。
[0093] 实施例3糖化血红蛋白检测试条的构建
[0094] 1.将实施例1制备得到的多肽-载体蛋白（糖化血红蛋白类似物)溶液，事先溶解 于pH7. 0的IOmMPB中配制成2mg/ml的浓度。
[0095]2.如图4所示,在反应膜上,用点样仪以Iii1/mm的量将上述步骤中配制的2mg/ ml的糖化血红蛋白类似物在硝酸纤维素（NC)膜上点成带状的检测区域401。
[0096] 3.以同样的办法再在试条的对照区域402包被羊抗鼠二抗(长沙博优生物技术有 限公司）。
[0097] 4.包被好的硝酸纤维素膜均放于干燥、密闭的干燥箱中干燥并保存，得到反应膜 4。
[0098] 5.用点样仪以Iii1/mm的量将实施例2制备的彩色纳米微球-糖化血红蛋白抗体 均匀地喷涂于玻璃纤维素膜上，冷冻干燥，得到结合物释放垫3。
[0099] 6?在PVC底板1上，依次顺序叠合样品垫2 (pall公司的CytoS印膜)，结合物释 放垫3、反应膜4和吸收垫（WhatmanCF6吸收垫）5。用切条机切成75mmX4mm条形的检测 试条。该试条本发明中亦称为糖化血红蛋白类似物试条。
[0100] 实施例4血红蛋白检测试条的构建
[0101] 1.血红蛋白溶液事先溶解于pH7. 0的IOmMPB中。
[0102] 2.在反应膜上，用点样仪以IiU/cm的量将lmg/ml的血红蛋白点成带状的检测 区。
[0103] 3.以同样的办法再在试条的对照控制区包被羊抗鼠二抗，包被好的膜均放于干 燥、密闭的干燥箱中干燥并保存待用。
[0104] 4.用点样仪以Iiil/mm的量将彩色纳米微球-血红蛋白抗体均匀得喷涂于玻璃纤 维素膜上，冷冻干燥。
[0105] 5.在PVC底板上，依次顺序叠合样品垫，结合物释放垫、反应膜和吸收垫。用切条 机切成75mmX4mm条形的检测试条。
[0106] 实施例5检测糖化血红蛋白
[0107] 1.在一小池里，将10 试剂盒所提供的糖化血红蛋白系列标准血样用140ill样 品处理液(层析液）裂解5分钟。
[0108] 2.将糖化血红蛋白和血红蛋白检测试条的样品垫端同时插入小池子上，让试条略 微斜靠并坚直得立在小池子上，使检测液从试条上的样品垫层析到吸收垫上。在试条的毛 细管作用带动下的层析过程中，彩色纳米微球-抗体与样品中的待测分子糖化血红蛋白形 成复合物；同时，样品及剩余的彩色纳米微球-抗体也流经由糖化血红蛋白类似物固定后 形成的检测区域，并在流经检测区域时彩色纳米微球-抗体也与检测区中的糖化血红蛋白 类似物反应而留在检测区。
[0109] 3.室温5?10分钟后，将两条试条分别插入"JF-200多用途标记物分析仪"，检测 仪的光学检测元件可以测定检测区带和对照区带的光学反射信号。
[0110] 4.在分别测定试剂盒所提供的糖化血红蛋白系列标准血样后，按照如图5和图6 所示作出糖化血红蛋白和血红蛋白的检测标准曲线。并获得如图7所示糖化血红蛋白百分 含量的标准曲线。
[0111] 5.同上述步骤，将IOiU待测血样用140iU样品处理液(层析液)裂解5分钟。使 检测液从试条上的样品垫层析到吸收垫上。室温5?10分钟后，将两条试条分别插入手持 式检测仪，测定检测区带和对照区带的信号。将此测定信号代入上述已获得的糖化血红蛋 白和血红蛋白的检测标准曲线，由仪器计算出待测血样的糖化血红蛋白和血红蛋白值，并 给出糖化血红蛋白百分含量(糖化血红蛋白/血红蛋白X100%)。
[0112] 应用本实施例的部分检测数据实例如表1、图IlA及图IlB所示。
[0113]表1试条标准血样梯度和一致性实验测试数据
【主权项】
1. 一种糖基化多肤，该糖基化多肤具有如下所不的序列结构： Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys〇
2. -种糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，该偶联物是权利要求1所述的糖基化多肽的 末端Cys偶联载体蛋白后的产物。
3. 根据权利要求2所示的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，其中，所述载体蛋白为牛 血清白蛋白、肌红蛋白或血监蛋白。
4. 权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物的制备方法，该方法包括步 骤： 将所述载体蛋白经SMCC修饰，在水溶液中反应活化所述载体蛋白，获得活化的载体蛋 白溶液； 将所述糖基化多肽溶解于含〇. IM EDTA的0. IM pH7. 2PBS溶液中； 将上述糖基化多肽溶液加入到活化的载体蛋白溶液中，混合均匀得混合液，室温放置 1 ?3h ; 用0. 17%碳酸氢铵平衡s印hadex G75柱，将上述混合液上柱层析，淋洗液为0. 17%碳 酸氢铵；280nm波长下监控收集淋出液，有两个280nm峰形，其中第一个峰形的流出液是糖 基化多肽与载体蛋白的偶联物。
5. 权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的 偶联物在制备检测糖化血红蛋的层析试条中的应用。
6. 根据权利要求5所述的应用，其中，权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或 3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物是代替人糖化血红蛋白抗原纯制品，与待检样品 中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体，从而进行检测。
7. -种检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红蛋白的层析试条上设有权利要 求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物，以所述 糖基化多肽或偶联物与待检样品中的人糖化血红蛋白抗原竞争结合人糖化血红蛋白抗体， 从而进行检测。
8. 根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，该检测糖化血红蛋白的层 析试条包括底板以及在底板上依次顺序设置的样品垫、结合物释放垫、反应膜和吸收垫；其 中，按照待测样品在试条上的层析流动的上下游方向： 所述样品垫位于试条的起始端，其是用于接受待测样品，样品垫的末端与结合物释放 垫部分叠合； 所述结合物释放垫的前端与样品垫部分叠合，末端与反应膜部分叠合； 所述反应膜贴合在底板上，前端与结合物释放垫部分叠合，末端与吸收垫部分叠合，且 反应膜上未与结合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分设置有检测区域，所述检测区域设有 权利要求1所述的糖基化多肽、或权利要求2或3所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物； 所述吸收垫设置在试条距样品垫最远的位置，与反应膜的末端部分叠合。
9. 根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，其中，所述结合物释放垫上 设有微球标记蛋白或胶体金标记蛋白，所述微球的直径范围为IOOnm?300nm ;优选地，所 述标记蛋白为糖化血红蛋白单克隆抗体。
10. 根据权利要求7所述的检测糖化血红蛋白的层析试条，其中，所述反应膜上未与结 合物释放垫或吸收垫叠合的中间部分还设置有对照区域，该对照区域设置在检测区域的下 游，对照区域内包被有糖化血红蛋白羊抗鼠二抗。
【专利摘要】本发明提供了一种糖基化多肽及其与载体蛋白的偶联物及其制备方法与应用，所述的糖基化多肽具有如下所示的序列结构：Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Tyr-Tyr-Cys，所述的糖基化多肽与载体蛋白的偶联物是糖基化多肽的末端Cys偶联载体蛋白（如牛血清白蛋白、肌红蛋白或血蓝蛋白等）后的产物，所述的糖基化多肽或其与载体蛋白的偶联物能代替昂贵的人糖化血红蛋白抗原纯制品制备层析试条（试纸条），该层析试条能快速、精确、定量、简便的检测全血中的糖化血红蛋白。
【IPC分类】C07K19-00, G01N33-72, C07K7-06
【公开号】CN104558112
【申请号】CN201310503612
【发明人】段学军, 杨彬, 胡昕芳, 郭振刚, 钟啸, 李元光, 何伟
【申请人】北京怡成生物电子技术股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2013年10月23日