26]
[0107] -种糖酸的制备方法，其中，使用[1]~[18]中的任一项所述的蛋白质，由糖质制 备糖酸。
[0108] [27]
[0109] [1]~[18]中的任一项所述的蛋白质在将食品内的糖质氧化中的用途。
[0110] [28]
[0111] -种蛋白的脱糖方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的应用。
[0112] [29]
[0113] 一种脱糖蛋白的制备方法，使用[28]中记载的脱糖方法。
[0114] [30]
[0115] -种面包的品质及/或面坯的物性的改性方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的 应用。
[0116] [31]
[0117] -种面包的制备方法，使用[30]中记载的改性方法。
[0118] [32]
[0119] -种乳糖酸的制备方法，至少进行[27]中记载的蛋白质的应用。
[0120] 本发明的蛋白质能够作用于广泛的糖，并且具有适度的温度稳定性，所以，在现有 的葡萄糖氧化酶、低聚糖氧化酶无法应对的广泛的领域中，能够起到糖质氧化作用。
【附图说明】
[0121] 图1是表示实施例1中的糖质氧化酶的SDS-PAGE的代图图表。条带1 :糖质氧 化酶。
[0122] 图2是表示实施例3中的相对于pH的相对活性（％ )的代图图表。
[0123] 图3是表示实施例4中的相对于pH的相对活性（％ )的代图图表。
[0124] 图4是表示实施例5中的相对于温度的相对活性（％ )的代图图表。
[0125] 图5是表不实施例6中的相对于温度的相对活性（％ )的代图图表。
[0126] 图6是表示实施例9中的脱糖蛋白中的残留葡萄糖量的代图图表。
[0127] 图7是表不实施例10中在54 C进彳丁加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图 图表。
[0128] 图8是表不实施例10中在56 C进彳丁加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图 图表。
[0129] 图9是表不实施例10中在58 C进彳丁加热处理时的脱糖蛋白中的残留活性的代图 图表。
[0130] 图10是表示实施例11中的面包体积测定结果的代图图表。
[0131] 图11是表示实施例11中的面包硬度测定结果的代图图表。
[0132] 图12是表示实施例13中的以乳糖为基质的乳糖酸生成的色谱结果的代图图表。
[0133] 图13是表示实施例16中构建的表达质粒pCSGOOXG的构建体的概念图。
[0134] 图14是表示实施例16中的丝状菌转染体培养滤液的SDS - PAGE结果的代图图 表。条带1 :米曲霉BB - 56的培养滤液、条带2 :丝状菌转染体的培养滤液。
【具体实施方式】
[0135] 以下对用于实施本发明的优选方式进行详细说明。应予说明，以下说明的实施方 式表示本发明的代表性实施方式之一例，不应由此对本发明的范围做狭窄的解释。
[0136] < 1.具有糖质氧化酶活性的蛋白质>
[0137] 本发明的蛋白质是具有后述的理化性质的蛋白质。
[0138] 本发明中，糖质氧化酶活性的测定方法没有特别限定，可以自由选择公知的方法 来进行。本发明中，特别是通过后述的实施例中记载的方法对糖质氧化酶活性进行测定。
[0139] (1)作用
[0140] 本发明的蛋白质在有氧条件下将后述的糖氧化，形成糖酸。更详言之，在有氧条件 下，使本发明的蛋白质作用于后述的糖时，生成糖酸和过氧化氢。
[0141] (2)基质特异性
[0142] 本发明的蛋白质对葡萄糖、麦芽三糖、麦芽糖、半乳糖、麦芽四糖、乳糖、纤维二糖 显示活性。本发明的蛋白质对各基质的相对活性在以对葡萄糖的活性为100%的情况下，麦 芽三糖：约92%、麦芽糖：约86%、半乳糖：约79%、麦芽四糖：约60%、乳糖：约58%、纤维 二糖：约53% (参见后述的实施例2)。
[0143] 应予说明，本发明中，将以葡萄糖为基质时的活性作为基准（100% )时相对活性 如果在50%以上，则判断为"本酶良好地起作用的基质"。
[0144] 这样，本发明的蛋白质不仅对葡萄糖这样的单糖类显示活性，对二糖类以上的大 范围的糖质也显示活性。因此，在现有的葡萄糖氧化酶、低聚糖氧化酶无法应对的广泛的领 域中，能够起到糖质氧化作用。
[0145] ⑶Km值
[0146] 本发明中，对蛋白质的Km值（米氏常数）的具体计算方法没有特别限定，可以自 由选择公知的方法进行计算。本发明中特别是通过后述实施例8中记载的方法计算Km值。 本发明的蛋白质的Km值没有特别限定，优选[葡萄糖的Km值]/ [麦芽糖的Km值]< 1，更 优选0.4彡[葡萄糖的Km值]/[麦芽糖的Km值]彡1。
[0147] (4)分子质量
[0148] 本发明的蛋白质通过SDS-PAGE法测定的分子质量约63kDa。
[0149] (5)最佳pH
[0150] 本发明的蛋白质在37°C反应5分钟的条件下在pH5. 0~9. 0附近糖质氧化酶活性 最尚。
[0151] (6)稳定pH范围
[0152] 本发明的蛋白质在37°C处理15分钟的条件下在pH5. 0~10. 5附近是稳定的。
[0153] (7)最佳温度
[0154] 本发明的蛋白质在pH7. 0反应5分钟的条件下在20°C~55°C附近糖质氧化酶活 性最尚。
[0155] (8)温度稳定性
[0156] 本发明的蛋白质在pH7. 0处理15分钟的条件下即使于45°C的温度条件下进行处 理也维持80%以上的活性。
[0157] (9)关于来源
[0158] 因为以上说明的本发明的蛋白质在前述的理化性质方面具有目前没有的特征，所 以只要是以前述的理化性质表征的蛋白质即可，对其来源没有特别限定。本发明中，例如可 以举出来源于归属枝顶孢属（Acremonium属）的微生物。这种情况下，作为归属枝顶孢属 (Acremonium属）的微生物，可以举出顶头抱霉（Acremonium chrysogenum)。
[0159] 此处的"来源于顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)的糖质氧化酶"是指分类 于顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)的微生物（可以是野生株，也可以是突变株）所 生产的糖质氧化酶，或者利用糖质氧化酶基因，通过基因工程方法得到的糖质氧化酶。因 此，通过导入了由顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)得到的糖质氧化酶基因（或改 变了该基因的基因）的宿主微生物生产的重组体也属于来源于"顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)的糖质氧化酶"。
[0160] 作为本发明的蛋白质的来源的顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)的例子，可以 举出顶头孢霉（Acremonium chrysogenum)NBR C30055(NITE、日本）、ATCC15006(ATCC、美 国）、DSM880(DSMZ、德国）。
[0161] (10)氨基酸序列
[0162] 本发明的蛋白质在前述的理化性质方面具有目前没有的特征，所以只要是以前述 的理化性质表征的蛋白质即可，对其氨基酸结构没有限定，如果列举一个例子，则可以用以 下的氨基酸序列表征。
[0163] 具体而言，本发明的蛋白质可以用序列号10所表示的氨基酸序列表征。
[0164] 此处，一般而言，对某个蛋白质的氨基酸序列的一部分施加了改变的情况下，改变 后的蛋白质有时具有与改变前的蛋白质同等的功能。即，氨基酸序列的改变对蛋白质的功 能没有实质影响，蛋白质的功能在改变前后被维持。因此，作为本发明的其他方式，提供由 在序列号10所表示的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加1~数个氨基酸而得的氨基酸序 列组成的、具有糖质氧化酶活性的蛋白质。"构成氨基酸序列的1~数个氨基酸的缺失、取 代及/或添加"典型地是指氨基酸序列的部分差异。
[0165] 此处的氨基酸序列的差异只要能够保持糖质氧化酶活性即可（活性可以多少变 化）。只要满足该条件，对氨基酸序列差异的位置没有特别限定，另外可以在多个位置产生 差异。此处的多个是指例如相当于全部氨基酸序列的大约不足30%的数量，优选为相当于 大约不足20%的数量，更优选为相当于大约不足10%的数量，更进一步优选相当于大约不 足5%的数量，最优选相当于大约不足1 %的数量。
[0166] 即，是指与序列号10的氨基酸序列具有例如约70%以上、优选约80%以上、更优 选约90%以上、更进一步优选约95%以上、最优选约99%以上的同源性。
[0167] 另外，优选通过在对于糖质氧化酶活性并非必须的氨基酸残基中发生保守性氨基 酸取代而得到蛋白质的方法。此处的"保守性氨基酸取代"是指将某氨基酸残基取代成具有 同样性质侧链的氨基酸残基。氨基酸残基根据其侧链分类成几个家族，即碱基性侧链（例 如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、酸性侧链（例如天冬氨酸、谷氨酸）、非荷电极性侧链（例如甘 氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非极性侧链（例如丙氨酸、 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、0分支侧链（例如苏氨酸、 缬氨酸、异亮氨酸）、芳香族侧链（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。保守性氨基酸 取代优选为同一家族内的氨基酸残基间的取代。
[0168] 但是，两个氨基酸序列或两个核酸（以下作为包含这些含义的用语使用"两个序 列"）的同源性（％)例如可以按以下顺序决定。首先，排列两个序列以便能够进行最合适 的比较。此时，例如可以在第一序列内导入间隙，将与第二序列的比对最佳化。第一序列的 特定位置的分子（氨基酸残基或核苷酸）与第二序列中的对应位置的分子相同时，可以称 之为该位置的分子相同。两个序列的同源性是该两个序列共同的同一位置的数目的函数 (即、同源性（％ )=相同位置的数目/位置的总数X 100)，优选还考虑比对的最佳化所需 的间隙的数目以及尺寸。
[0169] 另外，两个序列的比较以及同源性的确定可以使用数学算法来实现。作为序列的 比较能够利用的数学算法的具体例，记载于Karlin以及Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :2264 - 68,在 Karlin 以及 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 5873 - 77中有被改变的算法，但并不限定于此。这样的算法可以编入Altschul等（1990) 工1〇1.81〇1.215:403 - 10中记载的咄1^51'程序以及乂81^51'程序（版本2.0)中。为了 得到与本发明的核酸分子等价的核苷酸序列，例如只要通过NBLAST程序作为score = 100、 wordlength = 12进行BLAST核苷酸检索即可。
[0170] 为了得到与本发明的多肽分子等价的氨基酸序列，例如只要通过XBLAST程序作 为score = 50、wordlength = 3进行BLAST多肽检索即可。为了得到用于比较的间隙比对， 可利用 Altschul 等（1997)Amino Acids Research 25(17) :3389 - 3402 中记载的 Gapped BLAST。利用BLAST以及Gapped BLAST的情况下，可以使用对应的程序（例如XBLAST以及 NBLAST)的缺省参数。详情请参见 http ://www. ncbi. nlm. nih. gov。
[0171] 作为能够用于序列比较的其他数学算法的例子，有Myers以及Miller (1998) Comput Appl Biosci.4 :11 - 17中记载的算法。这样的算法例如编入GENESTREAM网络服 务器（IGH M