方法
[0035]1. 1菌株
[0036] 芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440,由厦门大学海洋与地球学院分离保存。
[0037]1. 2基础发酵培养基
[0038] 以2216E液体培养基作为基础发酵培养基：蛋白胨5g/L、酵母膏lg/L、磷酸高铁 0? 01g/L、陈海水 1L。
[0039] 1. 3试验方法
[0040]1. 3. 1种子液培养
[0041] 用接种环将_80°C保存的芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440接种于2216E固体 培养基上，30°C培养48h进行活化。活化2次之后，从2216E平板上挑取一环单克隆A3440， 接种于装有l〇〇mL2216E液体培养基的250mL锥形瓶，200r/min、30°C摇床培养20h后备 用。
[0042] 1.3. 2生长曲线的测定
[0043] 将上述种子液接种于装有100mL基础发酵培养基的250mL锥形瓶中，接种量为 l%，200r/min、30°C摇床培养。每隔2h取样，以基础发酵培养基为空白，测定发酵液在 630nm条件下的吸光度。以培养时间为横坐标，0063(|为纵坐标，绘制芽孢杆菌A3440的生长 曲线。
[0044] 1. 3. 3芽孢率的测定
[0045] 采用稀释平板计数法，选取106、107、108三个浓度梯度，每个梯度涂布3个平板， 30°C培养48h后进行计数。将菌液80°C水浴lOmin后稀释平板计数，芽孢率=80°C水浴计 数/发酵液活菌数。
[0046] 1.3. 4蛋白酶活力的测定
[0047] 用100yg/mL的酪蛋白标准溶液配制标准系列溶液，酪蛋白终浓度0、10、20、30、 40、50yg/mL，分别使用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定其 〇D63(l，绘制标准曲线。以蒸馏水作为空白对照。标准曲线见图1。
[0048] 样品测定方法：取发酵菌液1ml，在8000rpm离心15min，分别取0.2ml加入2个 1. 5mL离心管，标记为实验组与空白组。40°C水浴2min，空白组加入0. 4mol/L三氯乙酸 0. 4ml。各组加入1%酪蛋白0. 8ml，40°C保温20min。实验组加入0. 4ml0. 4mol/L三氯乙 酸，保温20min。离心取上清，稀释100倍。取20ul于酶标板，以20ul蒸馏水作为对照。使 用生工改良型lowey法蛋白浓度测定试剂盒处理，在酶标仪上测定其0D63(i。
[0049] 计算公式：
[0050]酶活力（U/mL) = A 0D*lml*N/(k*20min)
[0051] 其中AOD为实验组与空白组0D63(I差值；N为酶液的稀释倍数；k为标准曲线斜率。
[0052] 1. 3. 5不同碳源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的 影响
[0053] 将基础发酵培养基中的蛋白胨替换为等量的淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，以 不加碳源的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1 %接种量加入种子 液，在30°C、200r/min条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同碳源对 芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
[0054] 1. 3. 6不同氮源对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的 影响
[0055] 将基础发酵培养基中的酵母膏替换为等量的牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵、乙酸铵，以 上述实验的最优碳源代替基础发酵培养基中的蛋白胨、以不加氮源的培养基作为阴性对 照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1%接种量加入种子液，在30°C、200rpm条件下摇 培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同氮源对芽孢杆菌（B.stratosphericus) A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
[0056] 1. 3. 7不同无机盐对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率 的影响
[0057] 将基础发酵培养基中的陈海水替换为10%。NaCl、10%。KC1、10%。MgS04、10%。CaCl2 加单蒸水，以上述实验的最优碳源和氮源代替基础发酵培养基中的蛋白胨和酵母膏、以不 加无机盐的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1 %接种量加入种子 液，在30°C、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同无机盐对 芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
[0058] 1. 3. 8不同金属离子对芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440蛋白酶活力与芽孢 率的影响
[0059] 将基础发酵培养基中的磷酸高铁替换为等量Mg2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+，以上述实验的 最优碳源、氮源和无机盐代替基础发酵培养基中的蛋白胨、酵母膏和陈海水、以不加金属离 子的培养基作为阴性对照、以基础发酵培养基作为阳性对照。以1 %接种量加入种子液， 在30°C、200rpm条件下摇培24h。测定发酵液蛋白酶活力和芽孢率，比较不同金属离子对 A3440蛋白酶活力与芽孢率的影响。
[0060] 1. 3. 9培养基成分的正交优化
[0061] 根据以上的实验结果，选择最优碳源、最优氮源、最优无机盐、最优金属离子四因 素四水平设计正交实验。具体实验设计如表1所示。
[0062] 表1芽孢杆菌（B.stratosphericus)A3440摇瓶正交试验设计
【主权项】
1. 芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，其特征在于其原料配方为：蛋白胨 7g/L、酵母膏7g/L、NaC120g/L、CaCl 2O. 2g/L，pH为9. O ;所述芽孢杆菌为芽孢杆菌 (B.stratosphericus)A3440〇
2. 采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵方法， 其特征在于具体方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵 培养基，再将芽孢杆菌（B. stratosphericus)A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培 养，即完成采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。
3. 如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠 道益生菌的发酵方法，其特征在于所述锥形瓶采用250mL锥形瓶，发酵培养基的加入量为 30mL。
4. 如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道 益生菌的发酵方法，其特征在于所述消毒灭菌的温度为120°C，消毒灭菌的时间为30min。
5. 如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道 益生菌的发酵方法，其特征在于所述接种的接种量按质量百分比为芽孢杆菌产蛋白酶和芽 孢的发酵培养基的8%。
6. 如权利要求2所述采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道 益生菌的发酵方法，其特征在于所述发酵培养的条件是置于恒温摇床上进行发酵培养，培 养温度30°C，培养时间24h。
【专利摘要】芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基及发酵方法，涉及蛋白酶和发酵培养基。所述芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基的原料配方为：蛋白胨7g/L、酵母膏7g/L、NaCl20g/L、CaCl20.2g/L，pH为9.0。发酵方法如下：在锥形瓶中装入已消毒灭菌的芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基，再将芽孢杆菌A3440的种子液接种至锥形瓶中进行发酵培养，即完成采用芽孢杆菌产蛋白酶和芽孢的发酵培养基用于鲍养殖的肠道益生菌的发酵。通过优化发酵条件，提高了菌液的芽孢率与蛋白酶活力。在优化条件下芽孢率为94.3％，蛋白酶活力为294.44U/mL，有利于芽孢杆菌的培养，降低后续工作的成本。
【IPC分类】C12R1-07, C12N3-00, C12N9-54
【公开号】CN104745554
【申请号】CN201510180738
【发明人】赵晶, 凌宇恒
【申请人】厦门大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年4月16日