癌患者(红色所示的Amp曲线)比P0U5F1B拷贝数正常的肝癌患者(蓝色所示的Not Amp曲线)的无病生存率显著降低(Ρ〈0.05)
结果分析:SPSS统计分析结果显示P0U5F1B拷贝数的扩增与肝癌患者无病生存率呈显著负相关(P=0.005)，P0U5F1B拷贝数扩增明确指示较差的预后。因此，P0U5F1B可作为肝癌患者预后的潜在指标。
[0098]实施例3:P0U5F1B的扩增促进P0U5F1B mRNA的表达，增强肿瘤干细胞相关的特性
1.TCGA数据库分析结果显示P0U5F1B的扩增促进P0U5F1B mRNA表达的上调
为了探索P0U5F1B在肿瘤中所起的作用，对CNV (copy number variants)和RNA水平的相关性进行分析。
[0099]方法:将TCGA中的泛癌数据根据泛癌中P0U5F1B扩增程度进行分类，类别有二倍体(4415 例)、Gain (2857 例)和 Amplificat1n (1014 例)。
[0100]所有统计学分析用SPSS17.0统计软件进行处理。不同组间比较用独立t检验(常变量)，两组间均数的比较用t检验，分类变量的比较用X2检验，多组间比较用单因素方差分析。数值用均数土SD表示。检验系数P〈0.05认为在统计学上有显著性差异。运用SPSS统计学分析法比较P0U5F1B拷贝数为二倍体(4415例)、Gain (2857例)和(1014例)的泛癌中P0U5F1B mRNA相对表达量的均值。
[0101]结果:如图15所示，与4415例P0U5F1B拷贝数为2(Diploid)的泛癌中的P0U5F1BmRNA 水平相比，2857 例 P0U5F1B Gain 的泛癌(Pan-cancers)中的 P0U5F1B mRNA 水平显著上升。与4415例P0U5F1B拷贝数为2的泛癌中的P0U5F1B mRNA水平相比，1014例P0U5F1BAmplificat1n的泛癌中的P0U5F1B mRNA水平显著上升。与2857例P0U5F1B Gain的泛癌中的 P0U5F1B mRNA 水平相比，1014 例 P0U5F1B Amplificat1n 的泛癌中的 P0U5F1B mRNA水平显著上升。
[0102]结果分析:P0U5F1B在肿瘤中的CNV (copy number variants)与其mRNA水平呈显著正相关，P0U5F1B的扩增促进P0U5F1B mRNA表达的上调。因此，用含有可以特异性定量检测 P0U5F1B mRNA 水平的引物(上游引物 5’ -GCCATACGGTCACAGAGCTT-3’ (SEQ ID NO:I)；下游引物5’- GGAAGCTTAGCCAGGTCAGA-3’ (SEQ ID NO:2))的辅助诊断试剂盒检测到临床样本中P0U5F1B mRNA水平高于正常样本，更能确诊为该组织样本为肿瘤样本。临床样本的分析提示P0U5F1B可作为辅助诊断的靶点。
[0103]2.GSEA分析结果表明P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤复发相关的基因集呈正相关
方法:对TCGA中肿瘤组织按照系统进行分类，类别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。按照P0U5F1B的扩增程度分别将以上肿瘤分为P0U5F1B扩增程度高、P0U5F1B扩增程度低两类。通过GSEA (全名为gene set enrichmentanalysis，基因集富集分析)分析方法对肿瘤的P0U5F1B扩增程度与Recurrence upsignatures、Recurrence down signatures 基因集的相关性进行分析。
[0104]结果:如图16所示，1-9分别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。Normalized Enrichment Score (NES)为标准化富集得分，NES距离零值越远，表明相关性越大。NES正负值代正负相关性的方向。图16中，若NES值为正数，则用红色表示。NES值距离零值越远，红色越深，表示正相关性越大。若NES值为负数，则用蓝色表示。NES值距离零值越远，蓝色越深，表示负相关性越大。结果表明P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤复发相关的基因集呈正相关。
[0105]结果分析:P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤复发相关的基因集呈正相关。P0U5F1B可作为预测肿瘤复发的潜在指标。
[0106]3.GSEA分析P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与预后相关的基因集呈负相关
方法:对TCGA中肿瘤组织按照系统进行分类，类别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。按照P0U5F1B的扩增程度分别将以上肿瘤分为P0U5F1B扩增程度高、P0U5F1B扩增程度低两类。通过GSEA分析方法对肿瘤的P0U5F1B扩增程度与 Prognosis poor signatures、Prognosis good signatures 基因集的相关性进行分析。
[0107]结果:如图17所示，1-9分别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。Normalized Enrichment Score (NES)为标准化富集得分，NES距离零值越远，表明相关性越大。NES正负值代表相关性的方向。图17中，若NES值为正数，则用红色表示。NES值距离零值越远，红色越深，表示正相关性越大。若NES值为负数，则用蓝色表示。NES值距离零值越远，蓝色越深，表示负相关性越大。结果表明P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤复发相关的基因集呈正相关。
[0108]结果分析:P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤预后相关的基因集呈负相关。P0U5F1B可作为预测肿瘤预后的潜在指标。
[0109]4.GSEA分析结果表明P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤细胞干性相关的基因集呈正相关
方法:对TCGA中肿瘤组织按照系统进行分类，类别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。按照P0U5F1B的扩增程度分别将以上肿瘤分为P0U5F1B扩增程度高、P0U5F1B扩增程度低两类。通过GSEA分析方法对肿瘤的P0U5F1B扩增程度与 Sternness up signatures、Sternness down signatures 基因集的相关性进行分析。
[0110]结果:如图18所示，1-9分别为女性生殖系统肿瘤、消化系统肿瘤、呼吸系统肿瘤男性生殖系统肿瘤、皮肤和软组织肿瘤、泌尿道系统肿瘤、神经系统肿瘤、血液淋巴系统肿瘤和内分泌系统肿瘤。Normalized Enrichment Score (NES)为标准化富集得分，NES距离零值越远，表明相关性越大。NES正负值代表相关性的方向。图18中，若NES值为正数，则用红色表示。NES值距离零值越远，红色越深，表示正相关性越大。若NES值为负数，则用蓝色表示。NES值距离零值越远，蓝色越深，表示负相关性越大。结果表明P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤细胞干性相关的基因集呈正相关。
[0111]结果分析:P0U5F1B在所有类型的肿瘤中的扩增与肿瘤细胞干性相关的基因集呈正相关。P0U5F1B可作为预测肿瘤复发的潜在指标。
[0112]实施例4:构建稳定高表达P0U5F1B的细胞株和构建sh P0U5F1B的细胞株。
[0113]1.构建稳定的P0U5F1B高表达的细胞株
(I)构建P0U5F1B的表达质粒
用PCR扩增P0U5F1B前体的cDNA全长序列，将纯化的P0U5F1B全长序列构建到pMSCV-retro-puro表达载体(购自Clontech公司)，获得P0U5F1B过表达质粒pMSCV-retro-puro-P0U5FlB。
[0114](2)转染人食管癌细胞Eca 9706
分别利用 Lipofectamine2000 (Invitrogen，#11668)和优化的包装质粒(Invitrogen，K4975-00)将获得的 pMSCV-retro-puro_P0U5FlB 和作为对照的pMSCV-retro-puro空载体转入293FT细胞。并于12小时后更换DMEM培养基(DMEM ；Gibco BRL)辅以10%的胎牛血清(Gibco BRL)。48小时及72小时后收集逆转录病毒上清，并转导进入食管癌细胞Eca 9706细胞。
[0115]用puromycin (0.5 μ g/mL ;Sigma_aldrich)筛选 10 天左右可得到稳定的P0U5F1B高表达的细胞株Eca 9706- P0U5F1B，对照细胞株为Eca 9706-Vector。
[0116](3)培养稳定的高表达P0U5F1B的细胞株
使用DMEM培养基(DMEM ；Gibco BRL)辅以10%的胎牛血清(Gibco BRL)的培养基培养食管癌细胞Eca 9706，并在37°C的含5%浓度二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行培养。
[0117]2.构建sh P0U5F1B的细胞株
制备沉默P0U5F1B表达的发夹结构(hairpin structure) sh P0U5F1B，发夹结构(hairpin structure)整合到细胞基因组后，表达siRNA。siRNA与RISC通过抑制mRNA翻译或切割mRNA，从而降低目的基因在细胞内的表达水平。上述shP0U5FlB可由相关生物公司进行合成，可沉默P0U5F1B的表达，本发明所用到的shP0U5FlB是根据P0U5F1B ORF序列设计的。shP0U5FlB 的 sense seq:5’-CGGAGAAGTCCCAGGACAT-3’ (SEQ ID N0:3)，而阴性对照Control的序列为随机序列。将shP0U5FlB和阴性对照瞬时转染到Eca 9706细胞株中，得到含有shP0U5FlB的Eca 9706细胞株(简称为Eca 9706-shP0U5FlB ;对照细胞株Eca 9706-Control。下文所述的含有shP0U5FlB的Ec