a 9706细胞株、对照细胞株Eca9706-Control细胞株都是用这种方法得到。
[0118]使用DMEM培养基(DMEM ；Gibco BRL)辅以10%的胎牛血清(Gibco BRL)的培养基培养食管癌细胞Eca 9706，并在37 °C的含5%浓度二氧化碳的无菌细胞培养箱中进行培养。
[0119]实施例5:P0U5F1B在食管癌细胞和肝癌细胞中的功能研宄
1.通过体内成瘤实验得出P0U5F1B的过表达增强食管癌细胞的体内成瘤能力方法:将100、500、1000、5000个实验组细胞Eca 9706-P0U5F1B或对照组细胞Eca9706-vector分别注射到6只4周龄左右裸鼠的左测背部皮下。监测注射后2个月内肿瘤的形成情况和肿瘤的大小。
[0120]结果:如图19所示，红色方块曲线表示注射过表达P0U5F1B细胞Eca9706-P0U5F1B的小鼠中不形成肿瘤的百分比，蓝色圆点曲线表示注射对照组细胞Eca9706-vector的小鼠中不形成肿瘤的百分比。从中可以看出注射Eca 9706-P0U5F1B组中，不形成肿瘤的小鼠所占的比例比明显低于对照组接种Eca 9706-vector的小鼠。在接种Eca 9706-P0U5F1B的小鼠中，不形成肿瘤小鼠的百分比随着接种细胞数量的增加而降低，而且降低的幅度比对照组的大。
[0121]结果分析:过表达P0U5F1B增强了食管癌细胞的体内成瘤能力。提示P0U5F1B可作为食管癌治疗的靶点。
[0122]2.通过SP分选实验得出P0U5F1B的高表达显著增加食管癌中的肿瘤起始细胞方法:用胰酶消化细胞，加入完全培养基，800rpm离心4分钟。然后将其重悬于含2%的胎牛血清的DMEM中，调整细胞(Eca 9706-P0U5F1B和Eca 9706-vector)浓度成IXlO6个/mL。将每类细胞分成两组，两组细胞的数量相等。一组在ΙΟΟμΜ的verapamil (Sigma-Aldrich)中 37°C孵育 30min，以抑制 ATP-binding cassette (ABC)transporters。另外一组则在与verapamil等体积的无菌水中37°C孵育30min。然后两组细胞在 5 μ g/mL Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)于 37°C孵育 90min，在期间每 15 到20分钟震荡一次，最后加入2mL冰磷酸缓冲液(PBS)终止反应，I 500 r/min离心10 min后弃上清，再用含2%的胎牛血清的PBS洗I次，用2%的胎牛血清的PBS重悬，PI加入至终浓度I μ g/mL的，在进行流式细胞分选、鉴定前细胞4度避光保存。流式细胞仪检测分选，350nm (375)波长紫外光激发Hoechst染色，于450/20nm带通下收集测定蓝光，675nm带通下收集测定红光。选取线性信号，做Hoechst Red(X轴)和Hoechst Blue(Y轴)二维散点图，将Hoechst Red及Hoechst Blue弱信号且维拉帕米对照组缺失的区域设定为SP细胞的门，计算百分比。
[0123]结果:上述流式细胞仪检的结果如图20所示，从中可以看出P0U5F1B过表达细胞系Eca 9706-P0U5F1B中食管癌肿瘤起始细胞(TIC，tumor initiated cells)的数量显著增加。
[0124]结果分析:高表达P0U5F1B促进食管癌中肿瘤起始细胞的形成。提示P0U5F1B可作为食管癌治疗的靶点。
[0125]3.通过体内成瘤实验得出P0U5F1B的低表达降低食管癌细胞的体内成瘤能力
方法:将 100、500、1000、5000 个实验组细胞 Eca 9706_shP0U5FlB#2、Eca 9706-shP0U5FlB#3或对照组细胞Eca 9706-Control分别注射到6只4周龄左右裸鼠的左测背部皮下。监测注射后2个月内肿瘤的形成情况和肿瘤的大小。
[0126]结果:如图21所示，在接种Eca 9706- shP0U5FlB#2 (桔色方块曲线)、Eca 9706-shP0U5FlB#3 (黑色三角形曲线)的小鼠中，不形成肿瘤的小鼠所占的比例比接种Eca9706-Control (紫色圆点曲线)的小鼠高。在接种 Eca 9706- shP0U5FlB#2、Eca 9706-shP0U5FlB#3的小鼠中，不形成肿瘤的小鼠所占的比例随着接种细胞数量的增加而降低，而且降低的幅度比接种Eca 9706-Control的小鼠小。在接种Eca 9706- shP0U5FlB#2的小鼠中，不形成肿瘤的小鼠所占的比例与接种Eca 9706- shP0U5FlB#3的小鼠相近。
[0127]结果分析:沉默P0U5F1B的表达降低了食管癌细胞的体内成瘤能力。提示P0U5F1B可作为食管癌治疗的靶点。
[0128]4.通过SP细胞分选实验得出P0U5F1B的沉默显著降低食管癌中的肿瘤起始细胞方法:具体实验方法如实施例5第2点所示。
[0129]结果:上述流式细胞仪检的结果如图22所示，从中可以看出P0U5F1B的沉默显著显著降低了食管癌中的肿瘤起始细胞(TIC，tumor initiated cells)数量。
[0130]结果分析:沉默P0U5F1B抑制食管癌中肿瘤起始细胞的形成。提示P0U5F1B可作为食管癌治疗的靶点。
[0131]5.体内成瘤实验结果表明，P0U5F1B高表达与小鼠切除肿瘤后的生存率显著负相关
方法:将 I X 16个实验组细胞(Eca 9706-P0U5F1B、Eca 9706- shP0U5FlB#2)或对照组细胞(Eca 9706-vector, Eca 9706-Control )分别注射到8只4周龄左右裸鼠的左测背部皮下。35天后将裸鼠身上长出的肿瘤切除，25天后统计裸鼠的生存率。
[0132]结果:如图23所示，P0U5F1B高表达(图中Eca 9706-P0U5F1B曲线)的小鼠切除肿瘤后的生存率比对照组的明显降低，P0U5F1B低表达(图中Eca 9706- shP0U5FlB#2曲线)的小鼠切除肿瘤后的生存率比对照组的明显升高。
[0133]结果分析:结果显示P0U5F1B高表达与小鼠切除肿瘤后的生存率显著负相关，P0U5F1B低表达与小鼠切除肿瘤后的生存率正相关，P0U5F1B高表达明确指示较差的预后。因此，P0U5F1B可作为患者预后的潜在指标。
[0134]6.小鼠肿瘤复发模型实验结果表明P0U5F1B高表达促进食管癌的复发
方法:将上一实验中的切除下来的肿瘤按照细胞种类(Eca 9706-P0U5F1B、Eca 9706-shP0U5FlB#2、Eca 9706-vector, Eca 9706-Control )分别剪碎、消化成单个细胞，然后将这些细胞按每只小鼠注射IXlO6个的数量分别注射到8只4周龄左右裸鼠的左测背部皮下。60天后统计裸鼠的生存率。
[0135]结果:如图24所示，注射过表达P0U5F1B的细胞Eca 9706-P0U5F1B的小鼠24天后全部死亡，而注射沉默P0U5F1B的细胞Eca 9706- shP0U5FlB#2的小鼠60天后仍然全部存活。
[0136]结果分析:上述结果说明P0U5F1B的表达水平与小鼠的生存率负相关，P0U5F1B低表达与小鼠的生存率正相关，P0U5F1B高表达明确指示较差的预后，而且P0U5F1B高表达促进食管癌的复发。因此，P0U5F1B可作为预测患者预后复发的潜在指标。
[0137]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B拷贝数的试剂。
2.一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因P0U5F1B转录水平的引物序列。
4.根据权利要求3所述的一种肿瘤检测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测基因P0U5F1B转录水平的引物序列:上游引物5’ -GCCATACGGTCACAGAGCTT-3’(SEQ ID NO:1)和下游引物 5’- GGAAGCTTAGCCAGGTCAGA-3’ (SEQ ID NO:2)。
5.一种肿瘤的预后试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B拷贝数的试剂。
6.一种肿瘤的预后试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B表达水平的试剂。
7.—种肿瘤的复发预测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B拷贝数的试剂。
8.—种肿瘤的复发预测试剂盒，其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测基因P0U5F1B表达水平的试剂。
9.一种肿瘤治疗药剂，其特征在于:该药剂中含有抑制基因P0U5F1B表达的试剂。
10.根据权利要求9所述的一种肿瘤治疗药剂，其特征在于:所述抑制基因POU5F1B表达的试剂选自可使基因POU5F1B沉默的试剂。
【专利摘要】本发明公开了POU5F1B在肿瘤诊断、治疗、预后和预测复发中的应用。本发明发现在多种肿瘤中基因POU5F1B的拷贝数、表达水平与肿瘤的转移、复发、患者预后和肿瘤细胞干性密切相关。通过研究发现高表达POU5F1B可以促进TIC的形成进而增强食管癌细胞的体内成瘤能力，降低生存率。而通过抑制POU5F1B的表达，可有效抑制TIC的形成降低食管癌细胞的体内成瘤能力、提高生存率。可见抑制内源性POU5F1B可显著降低食管癌细胞的体内成瘤能力、提高患者生存率，说明POU5F1B可作为诊断、治疗、预后和预测复发的标记物。POU5F1B抑制剂在制备治疗肿瘤的药物组合物上极具临床应用价值，为肿瘤的有效治疗提供了新的药物和方法。
【IPC分类】C12Q1-68, A61K48-00, A61K31-7088, A61P35-00
【公开号】CN104762375
【申请号】CN201510112706
【发明人】宋立兵, 李隽 , 张鑫, 谭展瑶, 吴淑
【申请人】中山大学肿瘤防治中心
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年3月13日